Etudes épidémiologique et phylogénétique chez Bartonella henselae par la technique MLVA

L’avènement de diverses méthodes de biologie moléculaire (PCR, séquençage…) ainsi que des outils de la bioinformatique a permis aux microbiologistes d’étudier de façon plus approfondie le génome des organismes vivants et sa plasticité. Ce couplage entre ces deux disciplines semble être devenu nécessaire et indissociable. La mise à portée de nombreux laboratoires des outils du typage moléculaire et leur diversification a notamment résulté de la nécessité d’adapter les techniques existantes aux particularités génétiques des micro-organismes étudiés. Les nouvelles techniques de génomique présentent en effet l’avantage de permettre l’étude du génome et non pas de ses produits d’expression et sont donc, contrairement au phénotypage, indépendantes des conditions de culture et, parfois, de la culture même de certains microorganismes qui sont difficilement cultivables (durée de culture relativement longue), voire non cultivables. La mise au point raisonnée de logiciels adaptés aux questions biologiques a rendu possible l’exploitation de la masse d’informations complexes qui en a résulté.

L’avènement des techniques moléculaire a ainsi fortement contribué à rendre possible l’étude de la diversité de nombreux agents bactériens, notamment Bartonella henselae. B. henselae est une bactérie émergente, zoonotique, agent de la maladie des griffes du chat (MCG), mais pouvant occasionner des manifestations plus graves comme l’angiomatose et le péliose bacillaires. Cette bactérie de culture difficile a le chat comme réservoir, généralement porteur asymptomatique. Le contact avec les chats, en particulier par griffure, constitue un facteur de risque majeur d’infection humaine.

La présente thèse a pour objet de développer un outil de typage moléculaire, la technique MLVA (Multi-Locus VNTR Analysis) basée sur des séquences répétées en tandem de type VNTR (Variable-Number Tandem-Repeats) afin d’étudier d’une d’autre part, de comprendre le rôle de ces structures dans le pouvoir zoonotique et/ou la virulence.

Les bartonelles sont des bactéries de connaissance ancienne. La première espèce identifiée, Bartonella bacilliformis, a été décrite microscopiquement en 1909 par le médecin péruvien Alberto Barton (Barton et al., 1909) et cultivée en 1926 par Noguchi Battisti (Nouguchi et al., 1926). Les bactéries du genre Bartonella, dont B. henselae, sont des petits bacilles ou des coccobacilles, parfois légèrement incurvés (environ 0.5 à 0.6 µm de diamètre sur 1 à 2 µm de longueur), non acido-alcoolo résistants, aérobies, Gram négatif, oxydase et catalase négatives (B. henselae est faiblement catalase positive), nitrateréductase, indole et uréase négatives (Slater et al., 1990 ; Regnery et al.,1992 ; Welch et al., 1991). Elles sont incapables d’oxyder le glucose pour la fourniture de leurs besoins énergétiques mais elles utilisent le glutamate et le succinate comme source de carbone. La culture de ces bartonelles, entre autres B. henselae, est laborieuse et très difficile (La Scola and Raoult, 1999). Les conditions optimales de culture valables pour la plupart des espèces sont réalisées par l’ensemencement de milieux enrichis avec du sang (5 pour cent de sang défibriné de mouton, de lapin ou de cheval), à l’exception de B. quintana et B. koehlerae qui préfèrent la gélose chocolat en primo-culture (Heller et al., 1999 ; Birtles et al., 1993). Les bartonelles poussent mieux sur le sang frais de lapin ou de cheval que sur celui de mouton. Sur gélose au sang cuit, incubée à une température comprise entre 35 et 37°C, dans une chambre à teneur d’humidité élevée et en présence de 5% de CO2 (à l’exception de B. bacilliformis qui croît à 28-30°C sans nécessiter de CO 2), les colonies apparaissent généralement après environ 8 jours mais parfois seulement après de nombreuses semaines. Dans ces conditions, on obtient sur gélose des colonies sèches, ayant un aspect en chou-fleur, de petite taille, grisâtres, dont certaines sont rugueuses et adhérentes sur la gélose (cf. Figure 1 & 2). Certaines bartonelles possèdent des flagelles unipolaires comme B. bacilloformis, B. clarridgeiae, B. chomelii et B. capreoli (Droz et al., 1999). Suite à plusieurs repiquages, certaines bactéries peuvent perdre leurs flagelles et se cultivent plus rapidement (minimum 5 jours) ; les colonies deviennent lisses, brillantes et moins adhérentes sur la gélose. Des milieux de culture liquides, relativement complexes, ont permis d’étudier plus précisément le métabolisme de Bartonella, mettant en évidence une activité faible sur les carbohydrates (Chenoweth et al., 2004).

Les bartonelles font partie des α-Protéobactéries et sont biologiquement et génétiquement proches des genres Rickettsia et Brucella. Ce n’est qu’en 1993 que Brenner et al ont pu, en se basant sur la comparaison des séquences de l’ARN 16S et l’hybridation ADN-ADN, unifier les genres Bartonella, représenté par B. bacilliformis, et Rochalimaea constitué par R. henselae, R. quintana, R. vinsonii et R. elizabethae (Brenner et al., 1993). En 1995, les espèces appartenant au genre Grahamella (G. talpae, G. grahamii, G.taylori, G. peromysci et G. doshiae) ont été affiliées au genre Bartonella au vu de la similarité (98.5%) de leur séquence 16S rRNA avec celle de Bartonella bacilliformis (Birtles et al., 1995).

Pour l’identification et la description des Bartonella, divers gènes ou portions de gènes ont été étudiés et amplifiés. On peut notamment citer les gènes codant l’acide ribonucléique ribosomal 16S (ou 16rRNA) (Pitulle et al., 2002 ; Matar et al.,1999), les gènes codant l’extrémité 3’ du gène de la citrate synthase (gltA) (Birtles et al., 1996, Norman et al., 1995), la riboflavine synthase (ribC) (Bereswill et al., 1999), la protéine de choc thermique de 60 kDa (GroEL) (Zeaiter et al., 2002), la protéine de division cellulaire (ftsZ) (Zeaiter et al., 2002 ; Kelly et al., 1998), la protéine 17kDa (Swerger et al., 2000), la flagelline Fla (Sander et al., 2000), la protéine de choc thermique HtrA (Anderson et al, 1997), l’endoribonucléase B (RpoB ) (Pitulle et al., 2002) et le fragment intergénique 16S-23S rRNA ou ITS pour Internal Trascribed Spacer (Birtles et al., 2000).

Chez les bactéries en général, la séquence de 16S rDNA est l’un des outils les plus souvent utilisés et est considérée comme l’une des plus informatives dans les études phylogénétiques (Olsen and Woese, 1993). Cette séquence a aussi été la première étudiée chez les bartonelles. Mais, certains auteurs ne la considèrent pas comme un outil efficace pour distinguer entre elles certaines espèces de bartonelles (Fox et al., 1992 ; Hasegawa and Hashimoto, 1993 ; Teichmann and Mitchison, 1999). Pour résoudre cette difficulté, certains auteurs ont proposé d’autres gènes, les plus utilisés étant gltA et groEL, qui permettent d’avoir de meilleures valeurs de « bootstrap » au niveau des nœuds par rapport à ceux obtenus en se basant sur la séquence de 16S rRDNA. En se basant sur d’autres séquences, les résultats ne sont pas pleinement concordants (cf. figure 3), comme le soulignent Marston et al., (1999) et Birtles et al., (1996), ce qui peut poser des problèmes d’interprétation et suggère des phénomènes anciens de recombinaison. Plus récemment, Pitulle et al., (2002) ainsi que La Scola et al., 2003 ont montré l’intérêt de la combinaison de plusieurs gènes afin de bien étudier les relations phylogénétiques.

Table des matières

INTRODUCTION
ETUDE BIBLIOGRAPHIQUE
I. Données bibliographiques B.henselae
A. Aspects bactériologiques
B. Aspects taxonomiques
C. Génome de B. henselae
D. Facteurs de virulence chez B. henselae
E. Aspects cliniques
E.1. Formes cliniques chez l’Homme
E.2. Les pathologies animales
E.2.1. Chez le chat
E.2.2. Chez le chien
E.2.3. Infection à B.henselae chez d’autres espèces animales
F. Aspects épidémiologiques de l’infection par B.henselae
F.1. Étude de prévalence de l’infection par B.henselae chez le chat par zone géographique
F.2. Modes et voies de transmission
F.3. Facteurs favorisant la transmission
F.4. Facteurs de la gravité de la maladie chez l’Homme
G. Aspects synthétiques : cycle de B.henselae
H. Diagnostic
I. Traitement
J. Prévention
II. Typage moléculaire des bactéries : Cas de B.henselae
A. Critères de choix d’une technique de typage moléculaire
B. Catégories de méthode
B.1. Méthodes de première génération
B.2. Méthodes de deuxième génération
C. Comparaison de techniques
D. VNTR et leur évolution
D.1. VNTR et la technique MLVA
D.2 .Evolution des VNTR
D.2.1. Structure des populations bactériennes et concept de clonalité
D.2.2. Mécanismes de changement du nombre de répétitions et
Conséquences
D.2.3. Rôle des VNTR dans les phénomènes adaptatifs et dans la virulence bactérienne
ETUDE EXPERIMENTALE
Chapitre I : Développement de la technique MLVA
I.Etape I : Développement initial
A. Matériel biologique
B. Méthodes
B.1.Identification des répétitions en tandem
B.2. Recherche des amorces
B.3. Culture des souches et extraction d’ADN
B.4. Amplification des répétitions en tandem par PCR
B.5. Électrophorèse et révélation
B.6. Stabilité de la méthode
B.7. Calcul du nombre des U.B
C. Résultats
C.1. Sélection des amorces (BHV)
C.2. Comparaison MLVA-MLST
C.3. Choix du programme de PCR
C.4. Étude de la stabilité
C.5. Localisation des séquences sélectionnées sur le génome
D. Discussion et conclusion
CONCLUSION

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