Etudes cristallographiques des DsbA de Neisseria meningitidis

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Les enzymes impliquées dans les échanges thiol-disulfure

La super famille des thiorédoxines :

La super famille des thiorédoxines est composée de thioltransférases dont les mieux caractérisées sont les Thiorédoxine TRX1 et TRX2 (Miranda-Vizuete et al. 1997; Stewart et al. 1998) et les Glutarédoxine GRX1, GRX2, GRX3 (Aslund et al. 1994). Cette famille comprend également des protéines eucaryotes qui appartiennent à la famille des PDI, comme Erp57, PDIp etc, et des protéines bactériennes, comme les enzymes DsbA, DsbC, DsbD, DsbG et DsbE d’E. coli, impliquées dans la synthèse de ponts disulfures des protéines extracytoplasmiques. Il y a d’autres membres au sein de cette super famille mais nous nous intéresserons seulement aux réductases, isomérases et oxydases de ponts disulfures, à savoir les TRX, GRX, DsbA et PDI.
Bien que ces enzymes n’aient pas une grande identité de séquence (Figure 8), leurs structures 3D sont assez proches. Elles possèdent toutes un ou plusieurs domaines de type TRX, dont le repliement est similaire à celui de TRX1 d’E. coli (Figure 9A), une réductase de ponts disulfures qui maintient un environnement réducteur dans le cytoplasme. Ce domaine est composé de 4 hélices α caractéristiques et d’un feuillet β central (β–α–β–α–β–α–β–β–α). α1C3P34 G3 C35 B.
A Les structures secondaires sont schématisées. B. Zoom de la région du site actif: les résidus du tétrapeptide CXXC sont représentés en bâtons. C32 est la cystéine nucléophile.
Les Thiorédoxine et Glutarédoxine sont constituées d’un seul domaine TRX d’environ 100 résidus. Toutes les enzymes de cette super famille sont des monomères à l’exception de DsbC qui est un dimère. DsbA et PDI sont des protéines de 189 et 510 résidus respectivement, qui ont au moins deux domaines. DsbA a deux domaines, l’un possède un repliement de type TRX et le second composé uniquement d’hélices α est inséré au sein du domaine TRX. La structure de PDI est beaucoup plus complexe puisqu’elle est composée de 4 domaines de type TRX.
La région la plus conservée par ces enzymes concerne la région du site actif contenant le motif CXXC. Ce motif est situé au sein du domaine TRX, en N-terminal de la première hélice (α1) (Figure 8 et Figure 9B). La cystéine située la plus en N-terminal est déprotonée à pH physiologique et est exposée au solvant: elle correspond à la cystéine nucléophile (CysN). L’autre cystéine est plus enfouie et généralement protonée. La nature des acides aminés situés entre les deux cystéines varie largement au sein de cette super famille d’enzymes (Figure 8).
Malgré des similarités structurales, ces enzymes ont des propriétés biochimiques différentes. Parmi les enzymes cytoplasmiques, TRX1 qui possède la séquence CGPC, et GRX1 la séquence CPYC ont des potentiels redox de -270 mV (Krause et al. 1991) et -233 mV (Aslund et al. 1997), respectivement. Par comparaison, dans le périplasme d’E. coli, DsbA a un site actif CPHC et un potentiel redox de -120 mV (Xia et al. 1992; Wunderlich et al. 1993a; Huber-Wunderlich et al. 1998). Les valeurs de leurs pka sont également variables : il est de 7.2 pour TRX1 ou TRX2 (Ren et al. 2009), de 3.8 pour les trois GRX (Yang et al. 1991), de 4.5 pour PDI (Kortemme et al. 1995) et 3.5 pour DsbA (Grauschopf et al. 1995).
Les TRX sont des protéines omniprésentes qui participent à la réduction d’enzymes cytoplasmiques (Holmgren 1988; Holmgren 1989; Prinz et al. 1997; Kern et al. 2003). Les GRX sont des réductases, mais seule GRX1 peut réduire les ponts disulfures à la fois in vivo et in vitro (Aslund et al. 1997; Stewart et al. 1998). Les activités de GRX2 et 3 sont limitées à la réduction de ponts disulfures mixtes avec le glutathion (Aslund et al. 1994).
La PDI est impliquée dans la maturation de protéines secrétées en tant que chaperone et catalyseur de la formation et du réarrangement de ponts disulfures dans la lumière du réticulum endoplasmique des cellules eucaryotes (Shorrosh et al. 1993; Puig et al. 1994).
DsbA catalyse la formation des ponts disulfures sur les protéines en cours de maturation (Wunderlich et al. 1993a; Zapun et al. 1993; Zapun et al. 1994). Elle est localisée dans le périplasme d’E. coli. L’oxydation des cystéines protéiques par DsbA est très rapide et conduit le plus souvent à la formation de ponts disulfures non natifs. Le réarrangement de ces ponts est alors catalysé par l’enzyme périplasmique dimérique DsbC qui a également une activité de chaperone (Zapun et al. 1993; Rietsch et al. 1996; Rybin et al. 1996; Sone et al. 1997; Darby et al. 1998; Chen et al. 1999).

Facteurs déterminant la fonction des enzymes de la famille des TRX :

Les membres de la famille des TRX ont des fonctions d’oxydant ou de réducteur dans la cellule. Dans les conditions physiologiques, ces protéines ont un seul de ces deux rôles.
Quels sont donc les facteurs qui déterminent leur activité enzymatique ?
La séquence du motif CXXC : La fonction physiologique des oxydoréductases de thiol-disulfure est habituellement corrélée aux propriétés d’oxydoréduction ou redox de son motif catalytique CXXC. Pour les enzymes de la super famille des TRX, un déterminant majeur de leur potentiel redox est la nature des acides aminés situés entre les deux cystéines actives (Huber-Wunderlich et al. 1998; Mossner et al. 1999; Inaba et al. 2002). Le remplacement des deux acides aminés centraux du motif CXXC permet de déplacer son potentiel redox vers un potentiel plus oxydant ou plus réducteur. Par exemple, le remplacement du dipeptide G-P du site actif de la TRX par la séquence P-H présente dans le site actif de DsbA, ou par la séquence P-T présente dans le site actif de GRX entraîne une augmentation du potentiel redox de la TRX de 66 mV et 75 mV, respectivement (Mossner et al. 1999). Ces mutants ne peuvent plus donner d’électrons à la réductase du 3’-phosphoadenylylsulfate (PAPS) et à la réductase de méthionine sulfoxide (MsrA) qui utilisent la TRX comme source d’électrons pour restaurer leur forme active (Moskovitz et al. 1995; Stewart et al. 1998; Lillig et al. 1999; Lowther et al. 2000). De plus, lorsque la TRX1 est exportée dans le périplasme d’une souche d’E. coli dsbAelle ne peut rétablir le phénotype sauvage alors que les mutants TRX qui possèdent la séquence CPHC de DsbA peuvent totalement complémenter la déficience en DsbA de cette souche (Debarbieux et al. 1998; Jonda et al. 1999; Debarbieux et al. 2000). Ces deux mutants sont donc des oxydants dans le périplasme d’E. coli.
Des études similaires ont été menées sur la TRX1 de la levure Saccharomyces cerevisae. Lorsque cette enzyme sauvage est exportée dans le réticulum endoplasmique, elle ne peut pas complémenter un mutant de délétion du gène de la PDI chez la levure. Cependant, un mutant TRX avec un potentiel redox se rapprochant de celui de la PDI peut complémenter la souche de levure dont le gène de la PDI a été enlevé (Chivers et al. 1996).
Une autre caractéristique de DsbA qui influence les propriétés redox de la séquence CXXC est sa localisation à l’extrémité N-terminale de l’hélice α1. A cette position, l’anion thiolate de C30 est stabilisé par l’effet de dipôle de l’hélice α1.
Ces expériences sont-elles suffisantes pour conclure que le potentiel redox du site actif est le facteur principal qui détermine la fonction d’une oxydoréductase de thiol-disulfure?
L’étude d’une série de mutants dsbA–, dans lesquels les deux acides aminés centraux du motif CXXC ont été mutés de façon aléatoire, montre que ce n’est pas le cas (Bessette et al. 2001). Les résultats indiquent qu’il n’y a pas qu’une simple corrélation entre le potentiel redox de ces mutants et leur efficacité à oxyder in vivo des substrats protéiques de DsbA. Par exemple, aucune des mutations du peptide central n’affecte l’activité de l’enzyme β-lactamase (une enzyme qui a un pont disulfure), même pour les mutants qui ont un potentiel redox de -220 mV. La formation d’une murine urokinase active clonée chez E. coli est cependant fortement affectée par la séquence du dipeptide du site actif. 

La voie de formation des ponts disulfures chez les bactéries à Gramnégatif

Alors que le caractère enzymatique de la synthèse des ponts disulfures chez les eucaryotes a été découvert dans les années 1960 avec la PDI, on a longtemps pensé que ces réactions étaient spontanées chez les procaryotes. Ce n’est qu’en 1991 que J. Beckwith et son équipe ont pu identifier les premières oxydoréductases de thiol-disulfure dans le périplasme bactérien (Bardwell et al. 1991). Depuis, deux voies impliquées dans la formation des ponts disulfures ont été très bien caractérisées : la voie oxydative, responsable de la formation de ponts disulfures, et la voie d’isomérisation, qui rétablit les ponts disulfures mal formés. De nombreuses revues ont été publiées sur ce sujet et seront largement utilisées comme support bibliographique de ce travail (Collet et al. 2002a; Kadokura et al. 2003; Ortenberg et al. 2003; Messens et al. 2006; Ito et al. 2008).

Les protéines de la famille des Dsb chez E. coli

Pour protéger la cellule des agents oxydants qui pourraient endommager les protéines cytoplasmiques, les bactéries ont développé des systèmes enzymatiques comme ceux de la thiorédoxine-thiorédoxine réductase et de la glutarédoxine-glutarédoxine réductase (CarmelHarel et al. 2000). Dans le cytoplasme bactérien la concentration en glutathion, d’environ 5 mM avec un rapport GSH/GSSG allant de 50/1 à 200/1, permet en partie d’empêcher la formation de ponts disulfures protéiques (Kosower et al. 1978; Hwang et al. 1992).
Par opposition, les protéines sécrétées dans le périplasme sont oxydées. Ce compartiment contient une famille de protéines qui catalysent la formation de ponts disulfures sur les protéines nouvellement transférées. Ces protéines font parties de la famille des Dsb. Les Dsb périplasmiques ont un domaine de type TRX (à l’exception de DsbB) contenant le motif CXXC au sein de leur site actif. Selon la fonction redox de l’enzyme, ce motif est soit réduit (Dsb-(SH)2 avec un dithiol) soit oxydé (Dsb-S2 avec un pont disulfure formé). Ces protéines sont impliquées dans deux voies principales : une voie d’oxydation (DsbA et DsbB) et une voie d’isomérisation (DsbC, DsbG, DsbD) des ponts disulfures (Figure 10). Nous ne décrirons pas cette seconde voie enzymatique.

Comparaison des interactions DsbA-peptide et DsbA-DsbB :

La comparaison du complexe DsbA-peptide (Paxman et al. 2009) avec celui DsbADsbB (Inaba et al. 2006a) montre que la conformation de DsbA est similaire dans les deux cas (Figure 18). Le peptide SigA et la boucle périplasmique de DsbB interagissent tous les deux avec 148RVG150 de la boucle de la cis-Proline de DsbA, cependant les chaînes latérales des résidus 99PFA101 de la boucle de DsbB sont enfouies dans la cavité hydrophobe de DsbA, où ils interagissent avec P151, P163, Q164, T168, M171 et F174 (Figure 18b). Par conséquent, DsbB semble établir plus de liaisons avec la cavité hydrophobe de la surface de DsbA que le peptide. Cela se traduit par une surface d’interaction plus grande observée dans le complexe DsbA-DsbB (1340 Å2) (Inaba et al. 2006b), expliquant par la même occasion la plus grande spécificité de l’interaction DsbA-DsbB. Malgré ces ressemblances, il y a des différences structurales entre DsbA pris dans les complexes DsbA-peptide et DsbA-DsbB. La différence la plus importante concerne le résidu H32, qui adopte une conformation gauche dans DsbApeptide et dont sa chaîne latérale, située en travers de la cavité hydrophobe, bloque l’accès au peptide substrat. Dans le complexe avec DsbB, H32 adopte une conformation trans, qui faciliterait l’accès à la cavité hydrophobe de DsbA et où sa chaîne latérale peut établir des interactions de type van-der-Waals avec A102-T103 de la boucle de DsbB. H32 déstabiliserait la forme oxydée de DsbA (Guddat et al. 1997a) et des mouvements de ce résidu seraient nécessaires pour permettre l’accès du substrat au site actif (Guddat et al. 1997a)

Diversité du système de formation des ponts disulfures chez les bactéries

Le système enzymatique de formation de ponts disulfures est extrêmement variable chez les bactéries et le système Dsb décrit chez E. coli (Figure 19a) n’est pas un modèle standard pour toutes les bactéries. Une analyse récente, portant sur les systèmes Dsb de 375 génomes de bactéries montre que la plupart des Protéobactéries possèderaient un système Dsb avec une DsbA et une DsbB, mais qu’une grande diversité de systèmes Dsb existe également parmi les bactéries (Dutton et al. 2008).
Par exemple, Staphylococcus aureus qui est une bactérie à Gram-positif, possède une DsbA mais pas de DsbB (Figure 19b). DsbA de S. aureus serait aussi stable sous forme réduite qu’oxydée (Heras et al. 2008) contrairement à son homologue chez E. coli, suggérant qu’un environnement oxydant maintiendrait DsbA de S. aureus sous sa forme oxydée au lieu d’une enzyme homologue à DsbB d’E. coli.
Streptococcus pyogènes est un cas extrême et ne possèderait ni DsbA ni DsbB. Chez cet organisme, des liaisons isopeptides remplaceraient les liaisons disulfures et stabiliseraient les structures de certaines protéines sécrétées (Kang et al. 2007). (Dutton et al. 2008) ont également décrit certaines bactéries comme Streptomyces coelicolor, qui possèderaient une DsbA et une réductase de la vitamine K époxide (VKOR).

Connaissances actuelles sur les DsbA de Neisseria meningitidis

Pour distinguer plus facilement les enzymes d’Escherichia coli et de Neisseria meningitidis, nous utiliserons les notations suivantes : EcDsbA et EcDsbB pour les enzymes d’E. coli et NmDsbA et NmDsbB pour les homologues chez N. meningitdis.

La découverte du système Dsb chez Neisseria meningitidis

L’équipe de Xavier Nassif à l’hopital Necker à Paris, est à la base de la caractérisation du système Dsb chez N. meningitidis en 2004 (Tinsley et al. 2004).
Le gène nmb0294 a été identifié en premier à la suite d’une analyse comparative des génomes des deux Neisseria pathogènes: N. meningitidis et N. gonorrhoaea (Tinsley et al. 1996; Klee et al. 2000). Le gène nmb0294 est spécifique du méningocoque et est localisé dans un îlot génétique absent du génome de N. gonorrhoaea. Il code pour une protéine NMB0294 qui possède les motifs caractéristiques des enzymes de la famille des thiorédoxines à savoir le motif CPHC (identique à celui d’EcDsbA) et une Proline située plus en C-terminal (cisProline conservée chez les TRX) (Figure 20). La séquence en acides aminés de NMB0294 contient un peptide signal relativement court et hydrophobe se terminant par la séquence consensus LAA(S)C (la Lipobox) qui est reconnue par la « lipoprotein-specific signal peptidase II ». Ceci indique que cette DsbA serait une lipoprotéine ancrée dans la membrane externe après lipidation de son résidu N-terminal. Ceci laissait supposer que NMB0294 pourrait constituer une cible antigénique.
(Tinsley et al. 2004) ont ainsi montré que NMB0294 avait bien une activité oxydoréductase comparable à celle d’EcDsbA, et était bien une lipoprotéine, mais que l’inactivation du gène nmb0294 ne confèrait pas à la bactérie un phénotype dsbA– et n’affectait pas sa virulence.
Ce dernier résultat, concernant l’absence de phénotypes associés à l’inactivation de nmb0294, a poussé l’équipe de X. Nassif à revenir au génome du méningocoque et à identifier deux autres gènes codant potentiellement pour des homologues à NMB0294 et à DsbA. Ceuxci sont localisés à des loci différents sur le chromosome. Le génome de N. meningitidis contient donc trois gènes nmb0278, nmb0294 et nmb0407 qui seront notés dsbA1, dsbA2 et dsbA3, par la suite. Bien que N. meningitidis ait trois gènes dsbA, il n’a été trouvé qu’un seul gène codant pour une hypothétique DsbB.

Table des matières

Introduction
I. Neisseria meningitidis : Agent de l’infection invasive à méningocoque
I.1. Les bactéries du genre Neisseria
I.2. Neisseria meningitidis
A) Description générale
B) Epidémiologie
C) L’infection invasive à méningocoque
D) Pathogénèse méningococcale et immunité
E) Biologie et microbiologie
I.3. Conclusion sur N. meningitidis
II. Le système de formation des ponts disulfures
II.1. Généralités
A) Ponts disulfures et protéines
B) Les enzymes impliquées dans les échanges thiol-disulfure
II.2. La voie de formation des ponts disulfures chez les bactéries à Gram-négatif
A) Les protéines de la famille des Dsb chez E. coli
B) Système Dsb et virulence bactérienne
C) La voie oxydative du repliement protéique
D) Diversité du système de formation des ponts disulfures chez les bactéries
III. Connaissances actuelles sur les DsbA de Neisseria meningitidis
III.1. La découverte du système Dsb chez Neisseria meningitidis
III.2. Comparaison et analyse des séquences protéiques des trois NmDsbA
III.3. Le système Dsb de Neisseria meningitidis est-il original ?
A) Parmi les bactéries à Gram-négatif ?
B) Parmi les bactéries du genre Neisseria ?
III.4. Premières caractérisations des DsbA de N. meningitidis
A) Localisations membranaires des deux lipoprotéines DsbA1 et DsbA2
B) Etudes des fonctions in vivo des NmDsbA
Principes Expérimentaux
I. Etudes biochimiques des DsbA de Neisseria meningitidis
I.1. Mesure de l’activité insuline réductase
I.2. Détermination de l’état redox
A) Méthode de l’AMS
B) Test d’Ellman
I.3. Détermination des potentiels redox
A) Définitions
B) Méthode de l’équilibre avec le glutathion et analyse par fluorimétrie
C) Méthode de l’équilibre redox protéine-protéine
I.4. Détermination de la stabilité thermale par Thermal Shift Assay
I.5. Détermination du pKa de la cystéine nucléophile par mesure de l’absorption du groupement thiol
II. Expérience de spectroscopie RAMAN
II.1. Principe
II.2. Pourquoi utiliser la spectroscopie Raman en biologie structurale ?
III. Etudes cristallographiques des DsbA de Neisseria meningitidis
III.1. Cristallogenèse
A) Les paramètres influençant la solubilité des protéines
B) Le diagramme de phases
C) Technique de la goutte suspendue associée à la diffusion en phase vapeur
III.2. Diffraction des rayons X par un cristal de protéine
A) Principe général
B) Le problème de la phase
C) De la carte de densité électronique au modèle structural
D) La qualité du modèle structural
IV. Etudes in vivo des activités des NmDsbA
IV.1. Suivi de la motilité
IV.2. Mesure de l’activité phosphatase alcaline
Résultats : Les DsbA de Neisseria meningitidis
I. Production des NmDsbA
I.1. Production périplasmique de DsbA3
I.2. Production cytoplasmique des NmDsbA
A) Expression et purification des NmDsbA
B) Caractérisation des NmDsbA après purification
II. Etudes cristallographiques des NmDsbA
II.1. Cristallogenèse et résolution des structures cristallographiques
A) DsbA1
B) DsbA2
C) DsbA3
II.2. Description et analyse des structures cristallographiques
A) Les structures de DsbA1 et DsbA3
B) La structure de DsbA2
C) Comparaison des deux structures de DsbA3 :
D) Comparaison des structures de DsbA1 et DsbA3 avec la structure de DsbA réduite d’E. coli
III. Etudes biochimiques des NmDsbA
III.1. Mesure du potentiel redox des NmDsbA
A) Application de la méthode de d’équilibre redox protéine-protéine aux NmDsbA
B) Détermination par équilibre avec le glutathion et fluorimétrie du potentiel redox des trois NmDsbA
III.2. Pka de la cystéine nucléophile des NmDsbA
III.3. Stabilités thermales des NmDsbA réduites et oxydées:
III.4. Ré-oxydation des NmDsbA par son partenaire membranaire
A) Production de NmDsbB
B) Ré-oxydation des NmDsbA par DsbB de N. meningitidis et d’E. coli
Résultats : Les mutants des NmDsbA
I. Introduction au travail de mutagénèse
I.1. Mutation dans la boucle de la cis-Proline
I.2. Mutation de la boucle d’interaction avec DsbB
II. Caractérisations des propriétés fonctionnelles de ces mutants
II.1. Etat redox et oxydation des enzymes
II.2. Activité insuline réductase
II.3. Potentiel redox
II.4. Stabilité thermale
II.5. Ré-oxydation des mutants NmDsbA par NmDsbB ou EcDsbB
III. Structure du mutant T176VDsbA1
IV. Spectrométrie Raman
V. Etudes in vivo des mutants NmDsbA
V.1. Construction de différentes souches d’E. coli
V.2. Suivi de la motilité
V.3. Activité phosphatase alcaline
Discussions
Conclusions et Perspectives
Protocoles Expérimentaux
I. Biologie moléculaire
I.1. Souches bactériennes
I.2. Conditions de culture
I.3. Constructions
A) Oligonucléotides
B) Clonage
C) Mutagenèse dirigée
II. Expression et purification des protéines d’intérêt chez E. coli
II.1. Croissance cellulaire et surexpression protéique
II.2. Purification
A) DsbA3 (expression périplasmique)
B) NmDsbA et leurs mutants (expression cytoplasmique)
C) DsbA2 et DsbA3 séléniées (expression cytoplasmique)
D) NmDsbB et EcDsbB
II.3. Préparation de fragments stables de DsbA2 par protéolyse limitée
III. Etudes biochimiques
III.1. Mesure de l’activité insuline réductase
III.2. Détermination de l’état redox
A) Méthode de l’AMS
B) Test d’Ellman
III.3. Oxydation et réduction des DsbA
III.4. Détermination du potentiel d’oxydoréduction
A) Méthode de l’équilibre avec le glutathion et analyse par fluorimétrie
B) Méthode de l’équilibre redox protéine-protéine
III.5. Thermal Shift Assay
III.6. Ré-oxydation des DsbA par DsbB de N. meningitidis ou d’E. coli
IV. Expérience de spectroscopie RAMAN
V. Etudes in vivo des activités des NmDsbA
V.1. Suivi de la motilité
V.2. Mesure de l’activité phosphatase alcaline
Annexes
Annexe A : Techniques générales de biologie moléculaire
Préparation de cellules compétentes
Transformation
Préparation d’ADN plasmidique
Restriction et ligation
Mutagenèse dirigée
Annexe B : Clonage
Clonage de dsbA3 dans pET20b(+)
Clonage des parties solubles des NmDsbA
Clonage des DsbB de N. meningitidis
Annexes C : Abréviations
Annexes D : Publications
Références Bibliographiques

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