Etudes chimiques et biologiques antérieures sur la famille

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PRESENTATION DE Candida albicans ET DE LA CANDIDOSE

GENERALITES SUR LE GENRE Candida

Les Candida sont des microorganismes eucaryotes responsables de nombreuses infections. Le genre Candida comporte plus de 200 espèces. Parmi elles, C. albicans, C. dubliniensiss, C. glabrata, C. krusei, C. lusitaniae, C. parapsilosis et C. tropicalis sont des espèces identifiées comme pathogènes opportunistes chez l’homme. Cependant, l’espèce la plus fréquente, est C. albicans lors de candidoses (MORGAN, 2005).
Candida sont des levures microscopiques opportunistes à l’origine de pathologies graves : elles sont responsables de 80% des mycoses. Ces levures vont profiter d’un changement de contexte environnemental chez l’hôte pour exprimer leur pathogénicité. (CHABASSE et al., 2006).
Candida peut être responsable de 2 types de mycoses:
-les mycoses superficielles ayant pour cible la peau et les muqueuses
-les mycoses profondes provoquant une infection entérique parfois asymptomatique. La plupart des espèces appartenant au genre Candida est responsable de mycoses superficielles. Ces levures se multiplient à des températures comprises entre 20 et 40°C et se développent à un pH compris entre 3 et 8 (CALDERONE, 2002; PFALLER and DIEKEMA, 2007).

GENERALITES SUR Candida albicans

Candida albicans est l’agent responsable des candidoses humaines. Il s’agit d’une levure commensale présente dans le tube digestif dans la sphère oropharyngée et dans le tractus génito-urinaire chez 50 à 70% des sujets sains (RUHNKE and MASCHMEYER, 2002). La transition de l’état commensal à l’état pathogène peut être induite par un déséquilibre environnemental tel que la variation de pH (SLAVENA et al., 2011).
C. albicans est responsable d’infections qui, par leur fréquence et leur gravité, se situent au premier rang des infections fongiques (BODEY et al., 2002; SAMARANAYAKE et al., 2002).

La capacité d’adhérence de Candida albicans L’adhérence dépend des souches et des espèces de Candida concernées.

Candida albicans a la capacité de changer de morphologie. Cette «commutation phénotypique» s’accompagne d’une modification de l’expression de l’antigène, de la morphologie des colonies et des affinités tissulaires. La commutation peut donner aux cellules une souplesse qui conduit à l’adaptation de l’organisme aux conditions hostiles imposées non seulement par l’hôte mais aussi par le traitement prescrit pour la prise en charge de l’infection (CALDERONE et FONZI, 2001).
Les facteurs favorisant leur développement Candida albicans se développe dans un milieu qui pourrait lui fournir ce dont elle a besoin pour son développement. Candida albicans peut par ailleurs s’adapter à tout changement d’environnement tel que la variation du pH ou de la température, en présence ou en absence de sérum. Ces conditions peuvent initier une transition de sa morphologie vers la forme hyphale qui lui permettrait de coloniser et de pénétrer dans les cellules de l’hôte (SUDBERY, 2011).

GENERALITES SUR LES CANDIDOSES

Les candidoses sont des affections provoquées par des levures appartenant au genre Candida. Les candidoses, des infections opportunistes qui sont d’ailleurs les plus fréquentes, sont dues aux levures du genre Candida; elles représentent plus de 80% des infections à levures (BODEY et al., 2002; CHABASSE et al., 1999).

Facteurs de virulence des candidoses

L’adhésine

Les facteurs de virulence associés à la pathogénicité de Candida albicans sont nombreux. Les principaux sont les adhésines qui sont des biomolécules favorisant l’adhérence aux cellules de l’hôte, plus particulièrement les cellules épithéliales (CALDERONE et FONZI, 2001). De plus, la commutation phénotypique jouent aussi un rôle important dans la virulence de ce pathogène (KARKOWSKA-KULETA et al., 2009).
Les candidoses se manifestent surtout lors d’une situation hostile au niveau de l’hôte telle que la prématurité, la malnutrition, les infections bactériennes ou virales, l’âge avancé. Il s’agit là de facteurs généraux. Cependant, il existe des facteurs liés aux terrains tels que l’immunosuppression, le diabète, l’obésité, les menstruations, le SIDA. D’autres facteurs peuvent être locaux tels que l’humidité, la macération, l’acidité.

Le dimorphisme chez Candida albicans

Le dimorphisme correspond à la transition de la forme levure en la forme hyphale induite par certaines conditions environnementales. Candida albicans devient alors pathogène et parfois mortel.

Les enzymes

Les enzymes sont aussi des facteurs favorisant la virulence de Candida albicans. La sécrétion d’enzyme hydrolytique au cours de l’infection favorise la virulence en dégradant les surfaces des muqueuses de l’hôte et en modifiant ses défenses immunitaires (SCHALLER, et al, 2005). Tel est le cas des aspartyl protéinases (Saps) (MONOD and BORG-VON ZEPELIN, 2002), des phospholipases (GHANNOUM, 2000) et des lipases (FU et al, 1997).

LES ANTIFONGIQUES

Les antifongiques peuvent être fongicides ou fongistatiques. Ceux utilisés actuellement pour le traitement des mycoses agissent principalement par une altération de la membrane cellulaire, par une inhibition de la synthèse d’ADN et de l’ergostérol et finalement par une inhibition de la synthèse des glycanes de la paroi cellulaire.
Les antifongiques sont des médicaments conçus pour traiter les maladies causées par certains champignons ou au moins pour réduire leur prolifération. Les antifongiques disponibles sur le marché sont regroupés essentiellement dans quatre classes thérapeutiques (polyènes, dérivés pyrimidiques, dérivés azolés et échinocandines) et ils s’avèrent encore insuffisants (CHABASSE et al, 1999).

Les polyènes

Les polyènes sont classés parmi les antifongiques naturels. La nystatine et l’Amphotéricine B sont les principaux représentants de cette classe. L’Amphotéricine B possède une forte affinité pour la membrane cytoplasmique du champignon avec laquelle elle forme un anneau de 8 molécules reliées de manière hydrophobe au stérol de la membrane fongique (PALACIOS et al, 2011); elle provoque ainsi une altération de la perméabilité de la paroi conduisant à la mort du champignon. L’Amphotéricine B est fongicide (SANGLARD et BILLE, 2003).

Les azolés

Les azolés forment la classe d’antifongique la plus répandue et ils ont une action fongistatique. Ils sont de puissants inhibiteurs de l’enzyme C14 α–diméthylase du cytochrome P450, nommé ERG 11p, produit du gène ERG11, responsable de la conversion de lanostérol en ergostérol. L’exposition du champignon aux azolés provoque une déplétion de l’ergostérol et une accumulation de stérol 14 α-méthyle perturbant la structure de la membrane. Il en résulte un ralentissement de la croissance des cellules fongiques. Les azolés représentent une classe thérapeutique assez homogène au niveau de leur mode d’action, des effets secondaires et des interactions médicamenteuses (SANGLARD et BILLE, 2003).

Les échinocandines

Ce sont des lipopeptides cycliques qui empêchent la synthèse de la paroi fongique par inhibition de l’enzyme β-1,3- glycane synthétase; elles bloquent aussi l’incorporation des glycanes et des protéines au sein de la paroi fongique, provoquant ensuite des anomalies de structure à l’origine de la mort de la cellule. Les échinocandines sont fongicides (LACROIX, 2003).

Les analogues pyrimidiques

Les analogues de la pyrimidine ou les acides nucléiques (par exemple la 5-fluorocytosine ou 5-FC) sont des antifongiques à action fongicide. La 5-FC pénètre dans la cellule fongique et inhibe la synthèse d’ARN et d’ADN.

MATERIEL VEGETAL

SELECTION DE LA PLANTE

Afin d’isoler de nouvelles substances bioactives d’origine végétale et de rendre la stratégie d’isolement moins laborieuse, il convient de sélectionner avec un grand soin la plante à étudier. Pour ce faire, un certain nombre de critères qui permettent de guider ce choix sont pris en considération:
L’endémicité,
L’observation de la plante dans son milieu naturel,
Les aspects botaniques et chimiotaxonomiques,
Les apports de la littérature,

L’endémicité

La distribution géographique des plantes endémiques est restreinte et les travaux chimiques antérieurs sur ces espèces sont rares. En travaillant sur des plantes endémiques, la probabilité de découvrir de nouvelles molécules et de nouvelles voies thérapeutiques serait plus grande.

L’observation de la plante dans son milieu naturel

Abrahamia deflexa a été récolté dans la Région DIANA, à climat tropical chaud et humide. Les antifongiques sont largement utilisés en agriculture pour lutter contre les champignons phytopathogènes. Ainsi, une plante qui apparaît saine, ne présentant aucun signe d’attaque par ces agresseurs, serait susceptible de développer de métabolites secondaires qui lui permettent de se défendre efficacement face à des agressions. Un tel matériel végétal pourrait être une source potentielle de nouvelles molécules dotées d’activités biologiques intéressantes.

Les aspects botaniques et chimiotaxonomiques

Les plantes peuvent être classées selon leurs cartes moléculaires c’est-à-dire en fonction des métabolites secondaires qu’elles contiennent.
Les plantes appartenant aux mêmes familles ou à des familles voisines et/ou qui poussent dans les mêmes biotopes sont susceptibles de synthétiser les mêmes molécules chimiques et pourraient avoir une activité similaire. Ainsi, choisir une plante chimiotaxonomiquement proche d’une autre plante ayant une vertu thérapeutique connue augmenterait la chance de trouver de métabolites secondaires actifs de même famille chimique. Il y a lieu de signaler qu’Abrahamia ditimena a montré une activité antibactérienne notoire (RABODOMALALA., 2008).

Les apports de la littérature

Afin de découvrir de nouvelles molécules antifongiques, il est plus judicieux de travailler sur une plante peu ou pas étudiée. Dans cette optique, nous avons effectué une recherche bibliographique sur les travaux chimiques qui auraient été effectués antérieurement sur le genre Abrahamia et l’espèce deflexa. A notre connaissance, aucune étude chimique et biologique approfondie n’a été publiée sur cette espèce.

RECOLTE

Les rameaux feuillés d’Abrahamia deflexa ont été récoltés au mois d’Avril 2012 dans la forêt sèche dégradée d’Ampasimena, Commune d’Andrafiabe, District Antsiranana II, dans la partie nord de Madagascar. La plante a été identifiée par Dr Stephan RAKOTONANDRASANA du Département d’Ethnobotanique et de Botanique du Centre National d’Application de Recherches Pharmaceutiques, Antananarivo Madagascar. Un spécimen d’herbier a été déposé au Centre d’herbier CNARP Antananarivo, Madagascar sous la référence RAKOTONANDRASANA et al., 1026.

PREPARATION DE L’ECHANTILLON DE LA PLANTE

Les rameaux feuillés collectés, qui constituent notre matériel d’étude, sont étalés dans la chambre d’un séchoir électrique sous un courant d’air chaud à une température constante de 55°C jusqu’à leur séchage effectif. Ils sont ensuite stockés dans des sacs en plastique poreux et conservés à température ambiante à l’abri de la lumière et de l’humidité. Selon le besoin, la quantité nécessaire est broyée avec un broyeur WILLEY MILL modèle 2 afin d’augmenter la surface de contact avec le solvant lors de l’extraction et d’améliorer le rendement des extractions.

MATERIELS ET METHODES POUR L’ETUDE CHIMIQUE

MATERIELS

Instrument de mesure: balance de précision (METTLER PM300, KERN PM 600), Broyeur mécanique de marque WILEY MILL, model n°2, Arthur Thomasoo, PHILADELPHIA; USA, Verreries: ballon à fond rond (1000 ml ; 100ml), réfrigérant, tubes à essai, flacon d’Erlenmeyer de 1,5 l, et de 250 ml, entonnoirs, éprouvettes graduées, ampoule à décanter de 1 l, Schott de verre frité, tubes capillaires, Appareils: évaporateur Rotatif 210 (BUCHI) 3000W, chauffe ballon, Cuve chromatographique, Nécessaire pour l’extraction au Soxhlet, Plaque préfabriquée de gel de silice 60F254; Merck de 0,2 mm d’épaisseur, Appareil U V de révélation: Lumière UV à 254 nm et 366 nm, Spatules

METHODES

Screening Phytochimique

Les composés antifongiques peuvent appartenir à différentes classes de métabolites secondaires. La connaissance des familles chimiques des substances naturelles élaborées par la plante au cours de son évolution permet d’orienter le choix du mode d’extraction et des méthodes d’isolement à adopter.
Afin de déceler les principales classes de métabolites secondaires présents dans la plante, un screening phytochimique a été mené sur un extrait hydroéthanolique à 80 %. Cette analyse qualitative est basée sur des réactions de coloration ou de précipitation spécifique à chaque classe de substances naturelles (HOUGHTON et RAMAN, 1998 ; FONG et FARNSWORTH, 1977). L’extrait hydroalcoolique a été préparé par chauffage au reflux de 50 g de poudre de plante pendant 1 h dans le mélange éthanol / eau (80:20). L’extrait obtenu après filtration et évaporation sous pression réduite du solvant a été soumis aux différents tests phytochimiques. Les réactions de caractérisation des familles chimiques classiques sont résumées dans le tableau II.

Extraction

L’extraction des produits naturels est généralement du type solide-liquide c’est-à-dire un solide, la matière végétale est mélangée avec un liquide, le solvant d’extraction. Des méthodes d’extraction spécifiques peuvent être appliquées selon les classes de métabolites secondaires présents dans la plante.
La méthode utilisée est l’extraction au Soxhlet à l’hexane pour le dégraissage et extraction de produits apolaires ou peu polaires suivie de la macération successive de la plante épuisée par des solvants de polarité croissante : dichlorométhane et méthanol. Elle permet une extraction plus ou moins sélective des constituants selon leur polarité:
 Le dichlorométhane pour les composés moyennement polaires,
 Le méthanol pour l’extraction des produits polaires.
La macération est effectuée à une température ambiante afin d’éviter toute dégradation thermique des principes actifs. La plante broyée est mise en contact avec le solvant d’extraction à raison de 1,750 l pour 300 g de plante.
Au bout de 24 h, le mélange hétérogène est filtré sur papier filtre et le résidu est de nouveau extrait deux fois dans les mêmes conditions. Les filtrats de la macération sont réunis et évaporés sous pression réduite à une température ne dépassant pas 50 °C. La poudre de plante épuisée à l’hexane est ensuite traitée de la même manière respectivement au dichlorométhane et au méthanol. Un tel traitement conduit à l’obtention de l’extrait brut dichlorométhanique et de l’extrait brut méthanolique.
L’extrait méthanolique sec a été repris avec de l’eau et soumis à un partage liquide – liquide successivement avec l’acétate d’éthyle et le n-butanol. Les extraits obtenus sont évaporés à sec sous pression réduite.

Méthode chromatographique analytique

Chromatographie sur couche mince (CCM)

La chromatographie sur couche mince est utilisée pour le suivi du fractionnement et de l’état de pureté des produits obtenus. Elle repose sur les phénomènes d’adsorption, d’interaction et de polarité. Elle est schématiquement basée sur le fait que les constituants d’un mélange peuvent avoir des affinités différentes pour un adsorbant donné.
Le mélange de composés est placé sur un support solide (phase stationnaire) qui est plongé dans un mélange de solvants (phase mobile) qui, par capillarité, se déplace le long de la phase stationnaire. La phase mobile va entraîner les composés qui migreront à une hauteur variant en fonction de leur affinité pour la phase stationnaire et la phase mobile. Les composés peuvent être caractérisés selon leur Rf (Rapport frontal : rapport de la distance de migration du composé sur celle du solvant).
Les chromatographies sur couche mince sont réalisées en phase normale sur des plaques d’aluminium recouvertes de silice avec un indicateur de fluorescence Silicagel 60 F254 (Merck) et mises à migrer dans un système de solvants. Pour ce faire, le produit est déposé sous forme de spot en bas de la plaque à l’aide d’une micropipette. La plaque est placée verticalement dans une cuve conventionnelle en verre remplie à environ 0,5 cm à 1 cm avec une phase mobile, qui peut être généralement un mélange binaire, ternaire ou quaternaire de solvants, selon le type de séparation recherchée. Le système de solvants monte le long de la plaque par capillarité et entraine les différents constituants du mélange déposé en bas de la plaque.
Les constituants les moins retenus par l’adsorbant sont entrainés les plus facilement.
Après une migration de l’éluant sur une distance de 10 cm environ, la plaque est séchée.
Dans notre cas, les systèmes d’éluant utilisés sont les suivants, classés par polarité croissante (les proportions sont données en volume) :
Hexane / Acétate d’éthyle: (7:3) et (5:5)
Hexane/ Acétate d’éthyle / Méthanol: (5:5:1)
Dichlorométhane / Méthanol: (7:3) et (5:5)
Acétate d’éthyle / Méthanol: (9:1) et (7:3)
Acétate d’éthyle / Méthanol: (5: 5 )
Acétate d’éthyle / Méthanol / Eau: (150: 11,5: 2,5).
Acétate d’éthyle / Méthanol / Eau: (150: 13,5: 5)
Acétate d’éthyle / Méthanol / Eau: (10/1, 35/ 1)
Méthanol / Eau: (6:4)
Après leur développement, les plaques sont observées à la lumière du jour et sous une lampe U V à 254 nm et 366 nm avant et après la révélation par des réactifs chimiques appropriés afin de mettre en évidence la présence des constituants ou des classes de métabolites secondaires présents dans l’extrait brut et/ou des fractions récoltées après une chromatographie préparative.
Les réactifs utilisés pour le présent travail sont les suivants: Réactif de Godin (GODIN, 1954) (réactif polyvalent)
Le réactif de Godin est préparé en mélangeant des volumes égaux d’une solution éthanolique de vanilline 1% avec une solution d’acide perchlorique à 3%. Les plaques de silice sont aspergées successivement avec ce réactif, et ensuite avec une solution éthanolique d’acide sulfurique à 10%. Elles sont ensuite chauffées à 100°C jusqu’à l’apparition de taches de couleurs diverses à la lumière visible.

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Table des matières

INTRODUCTION GENERALE
PREMIERE PARTIE: SYNTHESE BIBLIOGRAPHIQUE
I. PRESENTATION DE LA PLANTE
I.1 DONNEES BOTANIQUES
I.2 DONNEES PHYTOCHIMIQUES ET BIOLOGIQUES
I.2.1 Etudes chimiques et biologiques antérieures sur la famille
I.2.2 Etudes antérieures sur le genre Abrahamia
II. PRESENTATION DE Candida albicans ET DE LA CANDIDOSE
II.1 GENERALITES SUR LE GENRE Candida
II.2 GENERALITES SUR Candida albicans
II.2.1 La capacité d’adhérence de Candida albicans
II.2.2 Les facteurs favorisant leur développement
II.3 GENERALITES SUR LES CANDIDOSES
II.3.1 Facteurs de virulence des candidoses
II.3.1.1 L’adhésine
II.3.1.2 Le dimorphisme chez Candida albicans
II.3.1.3 Les enzymes
II.4 LES ANTIFONGIQUES
II.4.1 Les polyènes
II.4.2 Les azolés
II.4.3 Les échinocandines
II.4.4 Les analogues pyrimidiques
DEUXIEME PARTIE : MATERIELS ET METHODES
I. MATERIEL VEGETAL
I.1 SELECTION DE LA PLANTE
I.2 RECOLTE
I.3 PREPARATION DE L’ECHANTILLON DE LA PLANTE
II. MATERIELS ET METHODES POUR L’ETUDE CHIMIQUE
II.1 MATERIELS
II.2 METHODES
II.2.1 Screening Phytochimique
II.2.2 Extraction
II.2.3 Méthode chromatographique analytique
II.2.4 Méthode chromatographique preparative
II.2.5 Elimination des Proanthocyanidols par précipitation
III. MATERIELS ET METHODES POUR L’ETUDE BIOLOGIQUE
III.1 MATERIELS
III.2 METHODES
III.2.1 METHODE DE MICRODILUTION EN MILIEU LIQUIDE
III.2.2 TEST D’ACTIVITE ANTIOXYDANTE PAR LA METHODE DE DPPH (SCHWARZ et al, 2001; CONCEPCION et al, 2003)
III.2.3 EVALUATION DE L’ACTIVITE ANTIANAPHYLACTIQUE PAR LA METHODE DE SCHULTZ-DALE
TROISIEME PARTIE : RESULTATS ET DISCUSSION
I. CRIBLAGE PHYTOCHIMIQUE
II. EXTRACTION
II.1 Extraction par Soxhlet
II.2 Extraction liquide-liquide de l’extrait méthanolique
III. CRIBLAGE BIOLOGIQUE
III.1 EVALUATION DE L’ACTIVITE ANTIBACTERIENNE
III.2 TESTS D’ACTIVITE ANTIFONGIQUE
III.3 TESTS D’ACTIVITE ANTIOXYDANTE
III.4 EVALUATION DE L’ACTIVITE ANTI ANAPHYLACTIQUE PAR LA METHODE DE SCHULTZ-DALE
IV. ETUDE COMPARATIVE PRELIMINAIRE DE ESAc ET ESBu
IV.1 ANALYSE SUR CCM DES EXTRAITS ESAc ET ESBu ACTIFS
IV.2 CARACTERISATION PHYTOCHIMIQUE D’ESAc ET ESBu
V. SEPARATION ET PURIFICATION DE L’EXTRAIT ESAc
V.1 FRACTIONNEMENT DE L’EXTRAIT ESAc
V.2 CHROMATOGRAPHIE D’EXCLUSION DE LA FRACTION M6
V.3 CHROMATOGRAPHIE SUR COUCHE MINCE PREPARATIVE DE LA FRACTION M3.
V.4 CHROMATOGRAPHIE SUR COUCHE MINCE PREPARATIVE DE LA FRACTION M7
VI. RECHERCHE DE COMPOSES ANTIFONGIQUES ISSUS DE L’EXTRAIT BUTANOLIQUE
VI.1 PRECIPITATION DE TANINS CONDENSES DANS L’EXTRAIT BUTANOLIQUE (ESBu)
VI.2 FRACTIONNEMENT DU FILTRAT ESBu
CONCLUSION ET PERSPECTIVES
REFERENCES BIBLIOGRAPHIQUES
ANNEXES

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