ETUDES CHIMIQUE ET TOXICOLOGIQUE DES EXTRAITS DE FEUILLES DE Smilax kraussiana

Description du genre Smilax (PERRIER ,1937 ; ANDRAMIHAJA, 1986)

Smilax est le seul genre de la famille des Liliacées qui existe à Madagascar. Ce sont des lianes grêles de 6 à 7m de long, souvent épineuses. Les feuilles sont alternes, à stipules adnées au pétiole, à limbe membraneux, large, 3-5 nerve et à nervation secondaire réticulée. Les fleurs sont dioïques, en ombelles introrses, à sacs confluents. L’ombelle a 10-30 fleurs, avec un pédoncule de 5-12 mm, un peu plus allongé sous les fleurs, périanthe de 4 mm. Les étamines ont la mêmelongueur que le périanthe ; les filets sont un peu épaissis sous les anthères oblongues, obtuses de 1mm. L’ovaire est triloculaire, à loges 1-2 ovulées. Le fruit est une baie à 1-3 graines. Ce genre comprend 200 espèces environ, qui poussent dans les régions tempérées et tropicales du monde entier.

Description de l’espèce Smilaxkraussiana

Smilax kraussiana est une liane grêle, diffuse, à rameaux les uns traînant sur le sol, les autres plus ramifiés, grimpants, étalant leurs ramifications au sommet des arbres ou des arbustes souvent simples, ou munies d’une ligne saillante au-dessous de chaque pétiole, épineuses, parfois plus ou moins verruqueuses, à feuilles grandes (12 à 20 cm × 6 à 10 cm), largement ovales, souvent subcordées, arrondies au sommet ou courtement acuminées, à pétiole tordu, long de 12 à 30 mm, souvent muni sur le côté dorsal d’une côte saillante. Les rameaux supérieurs sont inermes, à tige cylindrique ou presque, finement striée. Le fruit est en grappe et de couleur grenat à maturité (figure 1, p. 7).

Précipitation par l’acétate neutre de plomb

Principe L’acétate neutre de plomb (ANP) est un sel de métal lourd qui a la capacité de précipiter les macromolécules comme les acides nucléiques, les protéines, les polysaccharides ainsi que les acides organiques. Le traitement est utilisé pour clarifier les extraits en éliminant ces molécules.
Mode opératoire On verse goutte à goutte la solution d’ANP 20% (p/v) de volume déterminé dans l’extrait à traiter sous agitation magnétique. Le précipité formé est éliminé par centrifugation à l’aide d’une centrifugeuse de marque JOUAN (modèle TH12) à 12 000 trs/min, pendant 10 min. Pour éliminer l’excès de plomb dans le surnageant, une solution aqueuse de phosphate disodique (Na2HPO4) à 10% (P/V) est ajoutée. Il se forme un précipité. Celui-ci est écarté par centrifugation à 16 000 trs/min pendant 10 min.

Préparation du boudin de dialyse

Le boudin de dialyse utilisé se présente sous forme d’un cylindre en cellophane de marque Cellu Sep, de 32mm de large, avec un seuil de 6000 à 8000 Da. Il contient de la glycérine, des composés sulfureux et des métaux lourds qu’il faut éliminer en faisant bouillir la membrane dans de l’ED pendant 15 min, puis l’ED est éliminée. Cette opération est répétée 3 à 4 fois. Après refroidissement, la membrane ainsi traitée est conservée à + 4°C pendant 2 à 3 jours dans la dernière eau bouillie. Avant son utilisation, la membrane doit être rincée à l’ED.

Estimation de la toxicité

La toxicité aiguë est estimée par injection de l’extrait à tester par voie intrapéritonéale (i.p.).Un lot de trois souris mâles de 25±2g est utilisé pour chaque test. Un volume de 0,3 ml d’extrait à tester est injecté à chaque souris de 25g. Un autre lot de trois souris mâles de 25±2g servant de témoin, reçoit 0,3 ml de sérum physiologique. L’observation des symptômes d’intoxication commence immédiatement après l’injection.

Test sur les larves de moustique(OMS, 1970)

Les larves sont réparties par lots de cinq dans des petits cristallisoirs contenant 100ml d’eau de pluie.L’extrait à tester est ajouté de manière à avoir des concentrations en progression géométrique de raison r.Celles-ci s’échelonnent entre la concentration la plus haute provoquant 0% de mortalité et la concentration la plus basse provoquant 100% de mortalité. L’expérience dure 24h.Pour calculer le pourcentage de mortalité à chaque concentration, les larves moribondes et les larves mortes sont comptées. Les larves sont considérées comme :
 moribondes, quand les larves ne peuvent plus monter à la surface ou plonger quand on agite l’eau ;
 mortes, quand elles ne bougent plus lorsqu’on les touche avec une aiguille dans le siphon ou la région cervicale.
La CL50 est calculée selon la méthode donnée au § 2.2.1.2 (p. 34).

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Table des matières

INTRODUCTION GENERALE
Première partie : ETUDE CHIMIQUE
1- INTRODUCTION
2- MATERIELS ET METHODES
2.1 MATERIELS
2.1.1 MATERIEL VEGETAL
2.1.1.1 Classification de la plante
2.1.1.2 Identification
2.1.1.3 Description du genre Smilax
2.1.1.4 Description de l’espèce Smilax kraussiana
2.1.1.5 Répartition géographique de l’espèce
2.1.1.6 Date et lieu de récolte
2.1.1.7 Organe utilisé
2.1.1.8 Préparation et conservation du matériel d’étude
2.1.2 LES PRODUITS CHIMIQUES
2.2. METHODES
2.2.1. METHODES D’EXTRACTION
2.2.1.1 Extraction à froid
2.2.1.2 Extraction à chaud
2.2.2 METHODES DE PURIFICATION
2.2.2.1 Précipitation par l’acétate neutre de plomb
2.2.2.1.1Principe
2.2.2.1.2. Mode opératoire
2.2.2.2 Dialyse
2.2.2.2.1 Principe
2.2.2.2.2 Mode
2.2.2.2.2.1 Préparation du boudin de dialyse
2.2.2.2.2.2 Mise en œuvre de la dialyse
2.2.2.3 Précipitation par l’éthanol 50%
2.2.2.3.1 Principe
2.2.2.3.2 Mode opératoire
2.2.2.4 Fractionnement par le n-butanol
2.2.2.4.1 Principe
2.2.2.4.2 Mode opératoire
2.2.2.5 Fractionnement par l’acétate d’éthyle
2.2.2.5.1 Principe
2.2.2.5.2 Mode opératoire
2.2.2.6 Chromatographie sur gel Sephadex
2.2.2.6.1 Principe
2.2.2.6.2 Mode opératoire
2.2.2.7 Chromatographie sur résine échangeuse d’ions
2.2.2.7.1 Principe
2.2.2.7.2 Mode opératoire
2.2.3 METHODE DE CONCENTRATION
2.2.4 REDEMENT DE PURIFICATION
2.2.5 METHODES D’ANALYSE
2.2.5.1 Chromatographie sur couche mince
2.2.5.1.1 Principe
2.2.5.1.2 Mode opératoire
2.2.5.1.2.1 Dépôt des échantillons
2.2.5.1.2.2 Développement du chromatogramme
2.2.5.1.2.3 Révélation du chromatogramme
2.2.5.2 Criblage phytochimique
2.2.5.2.1 Les alcaloïdes
2.2.5.2.1.1 Mode opératoire
2.2.5.2.2 Tanins et polyphénols
2.2.5.2.2.1 Mode opératoire
2.2.5.2.3. Les saponines
2.2.5.2.4. Les flavonoïdes et leucoanthocyanes
2.2.5.2.4.1 Test de WILSTATER
2.2.5.2.4.2. Test de BATE-SMITH
2.2.5.2.5. Les anthraquinones (Test de BORNSTRÄGER)
2.2.5.2.6. Les iridoïdes
2.2.5.2.7 Les stéroïdes, les triterpènes et les stérols insaturés
2.2.5.2.7.1 Test de LIEBERMANN-BURCHARD
2.2.5.2.7.2 Test de SALKOWSKI
2.2.5.2.8 Les désoxyoses (Test de KELLER-KILLIANI)
3. RESULTATS
3.1 EXTRACTION
3.1.1 EXTRACTION AQUEUSE A FROID
3.1.2 EXTRACTION AQUEUSE A CHAUD
3.1.3 EXTRACTION HYDROETHANOLIQUE A FROID
3.1.4 EXTRACTION HYDROETHANOLIQUE A CHAUD
3.1.5 EXTRACTION ALCOOLIQUE 100%
3.2 PURIFICATION
3.2.1 Traitement par l’acétate neutre de neutre de plomb
3.2.2 Dialyse
3.2.3 Traitement par l’éthanol 50%
3.2.4 Traitement par le n-butanol
3.2.5 Fractionnement par l’acétate d’éthyle
3.2.6 Chromatographie sur gel Sephadex
3.2.7 Chromatographie sur résine échangeuse d’ions
3.3 ANALYSE DES EXTRAITS PAR CHROMATOGRAPHIE SUR COUCHE MINCE
3.4 RENDEMENT EN PRINCIPES TOXIQUES
3.5. CARACTERISATION CHIMIQUE
3.5.1 Propriétés physico-chimiques
3.5.2 Nature chimique
4. DISCUSSION ET CONCLUSION
Deuxième partie : ETUDE TOXICOLOGIQUE
1. INTRODUCTION
2. MATERIELS ET METHODES
2.1 MATERIELS
2.1.1 LES ANIMAUX D’EXPERIMENTATION
2.1.1.1 Les souris
2.1.1.2 Les têtards
2.1.1.3 Les alevins de poissons
2.1.1.4 Les larves de moustique
2.1.2 LES VEGETAUX D’EXPERMENTATION
2.1.3 LES MICROORGANISMES UTILISES
2.1.4 LES MILIEUX DE CULTURE
2.1.5. LES DISQUES POUR LES TESTS D’ANTIBIOGRAMME
2.2 METHODES
2.2.1 METHODES D’ETUDE DES EFFETS SUR LES ANIMAUX
2.2.1.1 Tests sur les animaux à sang chaud
2.2.1.1.1 Etude de la toxicité sur souris
2.2.1.1.1.1 Estimation de la toxicité
2.2.1.1.1.2 Détermination de la DL50 (24h)
2.2.1.2. Tests sur les animaux à sang froid
2.2.1.2.1 Expérience sur les têtards de grenouille
2.2.1.2.2 Expérience sur les alevins de poisson
2.2.1.2.3 Test sur les larves de moustique
2.2.2 METHODES D’ETUDE DES EFFETS SUR LES VEGETAUX
2.2.2.1 Méthodes d’étude des effets sur le pouvoir germinatif de graines
2.2.2.2 Méthodes d’étude des effets sur la croissance des jeunes plantules
2.2.2.2.1 Trempage
2.2.2.2.2 Germination
2.2.2.3 Méthodes d’étude des effets sur le développement des bourgeons axillaires
2.2.3 METHODES D’ETUDE DES EFFETS SUR LA CROISSANCE DES MICROORGANISMES
2.2.3.1 Stérilisation
2.2.3.2 Spectre d’activité antimicrobienne des extraits
2.2.3.2.1 Préparation des extraits
2.2.3.2.2 Inoculation des milieux
2.2.3.2.3 Préparation des disques
2.2.3.2.4 Norme de lecture des résultats
2.2.3.3 Détermination de la CMI
3. RESULTATS
3.1 EFFETS DES EXTRAITS SUR LES ANIMAUX
3.1.1 EFFETS DES EXTRAITS SUR LES ANIMAUX A SANG CHAUD
3.1.1.1 Effets sur la souris
3.1.1.1.1 Description des symptômes d’intoxication
3.1.1.1.2 Détermination de la DL50 (24h)
3.1.2 EFFETS DE L’EXTRAIT BRUT SUR LES ANIMAUX A SANG FROID
3.1.2.1 Effets sur les alevins de poisson
3.1.2.2 Effets sur les têtards de grenouille
3.1.2.3 Effets sur les larves de moustique
3.2 EFFETS DES EXTRAITS SUR LES VEGETAUX
3.2.1 Effets de l’extrait brut sur le pouvoir germinatif des graines
3.2.2 Effets de l’extrait brut sur la croissance des jeunes plantules
3.2.3 Effets de l’extrait brut et de E2 sur le développement des bourgeons axillaires
3.3 EFFETS DES EXTRAITS SUR LES MICROORGANISMES
3.3.1 Les souches utilisées
3.3.2 Spectre d’activité des extraits
4. DISCUSSION ET CONCLUSION
CONCLUSION GENERALE ET PERSPECTIVES
REFERENCES BIBLIOGRAPHIQUES
ANNEXES