Rรฉcolte et prรฉparation du matรฉriel vรฉgรฉtal
ย ย ย ย ย ย ย ย ย Les feuilles de Dombeya macrantha ont รฉtรฉ rรฉcoltรฉes sur le mont Ibity (S : 20ยฐ 03สน 56. 7โณ ; E : 047ยฐ 00โฒ 02. 2โณ) au mois de juin 2014. Au moment de la rรฉcolte, la plante รฉtait en fleurs et en fruits. Les feuilles sont sรฉchรฉes ร lโair libre, ร lโabri du soleil pendant deux semaines, puisย broyรฉes ร lโaide dโun mixer de marque Blender (Robot coupe GT550) afin dโobtenir une poudre fine qui est conservรฉe dans une boรฎte hermรฉtique ร la tempรฉrature du laboratoire. Elle constitue notre matรฉriel vรฉgรฉtal de dรฉpart (figure 3, p. 13).
Chromatographie sur couche mince
Principe La chromatographie sur couche mince (CCM) est un procรฉdรฉ de microanalyse basรฉ sur les phรฉnomรจnes physico-chimiques de partage et dโadsorption. Les substances ร sรฉparer migrent suivant une direction dรฉterminรฉe sur un support solide : le gel de silice. La vitesse de dรฉplacement des molรฉcules dรฉpend de leur affinitรฉ pour la phase mobile organique dโune part et des forces dโadsorption dues au support dโautre part.
Mode opรฉratoire
๏ Dรฉpรดt de lโรฉchantillon : Les extraits ร analyser sont dรฉposรฉs ร lโaide dโun capillaire sur la plaque en fins traits horizontaux de 7 mm espacรฉs de 6 mm, ร 1,5 cm du bord infรฉrieur et ร 1,3 cm de chaque bord latรฉral de la plaque. Chaque dรฉpรดt est immรฉdiatement sรฉchรฉ au sรฉchoir ร main.
๏ท Dรฉveloppement du chromatogramme : La plaque ainsi prรฉparรฉe est mise ร dรฉvelopper dans une cuve ร chromatographie (Desaga) dont lโatmosphรจre a รฉtรฉ prรฉalablement saturรฉe par les vapeurs du solvant de migration. Il sโagit dโun mรฉlange constituรฉ par 60 parties de n-butanol ; 20 parties dโacide acรฉtique et 20 parties dโeau distillรฉe, en poids : B/A/E (60/20/20) (p/p/p). Quand le front du solvant parvient ร 0,5 cm du bord supรฉrieur de la plaque (chromatographie ascendante), la plaque est retirรฉe de la cuve puis sรฉchรฉe au sรฉchoir ร main.
๏ Rรฉvรฉlation du chromatogramme : La rรฉvรฉlation permet de mettre les substances incolores qui ont migrรฉ en รฉvidence. Deux mรฉthodes de rรฉvรฉlation ont รฉtรฉ adoptรฉes :
๏ Examen sous lumiรจre ultraviolette (UV) : Grรขce ร lโabsorption de la lumiรจre ultraviolette, certains produits deviennent visibles. Ils apparaissent sous forme des bandes ou spots, ร des longueurs dโondes caractรฉristiques : 254 nm et 366 nm.
๏ Rรฉactions colorรฉes : Plusieurs composรฉs peuvent รชtre rรฉvรฉlรฉs au moyen de rรฉactifs trรจs gรฉnรฉraux comme le rรฉactif ร vanilline sulfurique dont la composition est donnรฉe en Annexe 1. Le rรฉactif est pulvรฉrisรฉ sur la plaque. Les substances apparaissent ainsi sous forme de taches colorรฉes qui peuvent รชtre trรจs claires, dโoรน la nรฉcessitรฉ de chauffer la plaque ร 100ยฐC. On obtient alors des taches plus foncรฉes.
METHODES NON ADOPTEES DANS LE PROTOCOLE DE PURIFICATION
Prรฉcipitation par la chaleur LโEB (5 ml) est chauffรฉ pendant 15 min au bain-marie bouillant (voir ยง 2.2.2.1.2, p. 14). Aucun prรฉcipitรฉ nโapparait lors du chauffage et aucun culot nโest obtenu par centrifugation. Lโextrait est actif sur les microorganismes, mais lโactivitรฉ reste comparable ร celle de lโEB. Cette mรฉthode peu performante nโa donc pas รฉtรฉ retenue dans le protocole dรฉfinitif.
Prรฉcipitation par lโacรฉtate neutre de plomb Aprรจs traitement par lโANP (voir ยง 2.2.2.3.2, p. 15), lโEB (5 ml) est devenu presque incolore mais nโa montrรฉ aucune activitรฉ sur les microorganismes. Nous nโavons pas retenu cette technique, mais elle a montrรฉ que les principes toxiques sont prรฉcipitables par lโANP.
Elimination des tanins LโEB (5 ml) traitรฉ par la poudre de peau comme dรฉcrit au ยง 2.2.2.4.2. (p. 15) est devenu pratiquement incolore mais nโa aucune activitรฉ sur les microorganismes. Nous nโavons pas retenu cette technique, mais elle nous a informรฉ que les principes toxiques sont retenus par la poudre de peau et pourraient รชtre des tanins.
Traitement par le charbon actif Lโextrait E1 (5 ml) obtenu aprรจs fractionnement par le n-butanol est filtrรฉ sur une couche de charbon actif (cf. ยง 2.2.2.5., p.15), il est devenu incolore mais inactif sur les microorganismes. La technique a permis de noter que les principes actifs sont adsorbรฉs sur le charbon actif.
Les milieux de culture
Les milieux solides Deux milieux solides ont รฉtรฉ utilisรฉs pendant cette รฉtude :
– le milieu de MUELLER-HINTON : Cโest un milieu de culture solide utilisรฉ pour mettre en รฉvidence lโactivitรฉ des extraits vis-ร -vis des germes pathogรจnes telles que : Salmonella enterica, Bacillus cereus, Staphylococcus aureus, Escherichia coli, Enterobacter cloaceae, Klebsiella oxytoca, Streptococcus pneumoniae et Bacillus megaterium.
– le milieu SABOURAUD : cโest un milieu sรฉlectif pour les levures (Candida albicans). Le milieu prรฉparรฉ est stรฉrilisรฉ ร lโautoclave ร 121ยฐC pendant 20 min, ensuite coulรฉ dans de boites de Petri stรฉriles de 90 mm de diamรจtre ; lโรฉpaisseur de la gรฉlose est de 4 mm environ.
Le milieu liquide Le milieu liquide utilisรฉ est le bouillon nutritif (Nutrient Broth) qui sert ร la conservation et la culture des souches. Il permet le dรฉveloppement et la croissance des bactรฉries qui ne prรฉsentent pas dโexigences particuliรจres comme Salmonella enterica, Bacillus cereus, Staphylococcus aureus, Escherichia coli, Enterobacter cloaceae, Klebsiella oxytoca, Streptococus pneumoniae et Bacillus megaterium.
Dรฉtermination de la CMI
ย ย ย ย ย ย ย ย ย La CMI ou concentration minimale inhibitrice est la concentration minimale de lโantibiotique pour laquelle il y a inhibition de la croissance microbienne. Elle est dรฉterminรฉe sur le germe le plus sensible, par la mรฉthode des disques en milieu solide et par la mรฉthode de dilution en milieu liquide.
a). Mรฉthode des disques en milieu solide
๏ Principe : La technique est la mรชme que celle dรฉcrite au ยง 2.2.3.2.1 (p. 37). Ainsi, la CMI est la plus faible concentration dโextrait donnant un rรฉsultat positif.
๏ Mode opรฉratoire : Une gamme de 6 concentrations de lโextrait ร รฉtudier diluรฉ avec de lโED est prรฉparรฉe selon la mรฉthode de dilution en cascade avec un coefficient de dilution de 0,5. Six disques stรฉriles sont imprรฉgnรฉs de 10 ยตl des extraits ร tester, puis dรฉposรฉs sur le milieu de MUELLER-HINTON uniformรฉment ensemencรฉ avec 10 ml dโinoculum de concentration 106 cellules/ml. La CMI est dรฉterminรฉe aprรจs incubation ร 37ยฐC pendant 24 h. La CMI correspond ร la plus petite concentration donnant le plus faible diamรจtre de halo dโinhibition. Lโantibiotique de rรฉfรฉrence utilisรฉ est le Netilmicine (CA-SFM, 2010).
b). Mรฉthode de dilution en milieu liquide
๏ Principe : En milieu liquide, la croissance des bactรฉries se traduit par un aspect trouble du milieu de culture ensemencรฉ. Par contre, en cas dโinhibition de la multiplication cellulaire, le milieu reste limpide. Ainsi, la CMI correspond ร la plus faible concentration dโantibiotique pour laquelle une inhibition de la concentration bactรฉrienne, aprรจs un temps dโincubation de 24 h (KIL et coll., 2009) est notรฉe.
๏ Mode opรฉratoire : Le test est effectuรฉ dans 8 tubes ร vis dont 2 tubes sont utilisรฉs comme tรฉmoin :
๏ง tรฉmoin nรฉgatif (T-) : 5 ml de milieu liquide (absence de croissance bactรฉrienne) ;
๏ง tรฉmoin positif (T+) : 5 ml de milieu liquide et 1 ml dโinoculum (prรฉsence de croissance bactรฉrienne) ;
Dans les tubes restants, lโextrait ร รฉtudier est diluรฉ avec le milieu liquide (dilution en cascade avec un facteur de dilution de 0,5) pour avoir des concentrations allant de 1,56mg/ml ร 100 mg/ml dans un volume final de 5 ml. 1ml dโinoculum sont introduits ร lโaide dโune pipette stรฉrile dans chaque tube. Les tubes sont incubรฉs pendant 24 h ร 37ยฐC. Aprรจs 24 h, la lecture se fait ร lโลil nu par comparaison avec les 2 tรฉmoins et la CMI correspond ร la plus faible concentration de lโextrait pour laquelle la culture reste limpide.
CONCLUSION GENERALE ET PERSPECTIVES
ย ย ย ย ย ย ย Les rรฉsultats des travaux rรฉalisรฉs dans le cadre de ce mรฉmoire, bien quโils soient prรฉliminaires, nous ont permis :
๏ถ de mettre au point une technique dโextraction et de purification des principes actifs prรฉsents dans les feuilles de Dombeya macrantha, en vue dโen dรฉduire leur nature chimique, leurs propriรฉtรฉs physico-chimiques et toxicologiques ;
๏ถ de mettre en รฉvidence la toxicitรฉ des feuilles de cette plante sur diverses espรจces animales, vรฉgรฉtales et microorganismes.
Cette รฉtude est prรฉliminaire et pourrait รชtre approfondie. Ainsi, dans lโavenir nous envisageons :
๏ผ dโamรฉliorer les diffรฉrentes mรฉthodes dโextraction et de purification afin dโobtenir les principes toxiques en plus grande quantitรฉ et ร lโรฉtat pur ;
๏ผ de dรฉterminer exactement la nature chimique des toxines ;
๏ผ dโรฉtudier leur mรฉcanisme dโaction ;
๏ผ dโรฉlargir lโรฉtude des propriรฉtรฉs toxicologiques ร dโautres animaux, vรฉgรฉtaux et microorganismes ;
๏ผ dโรฉtudier les possibilitรฉs dโexploitation des effets toxiques.
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Table des matiรจres
REMERCIEMENTS
GLOSSAIRE
LISTE DES ABREVIATIONS
LISTE DES TABLEAUX
LISTE DES FIGURES
INTRODUCTION GENERALE
SYNTHESE BIBLIOGRAPHIQUE
I. DONNEES SUR LES Dombeya
II. DONNEES SUR Dombeya macrantha
II.1.Classification
II.2. Description botanique
II.3. Utilisations
II.4. Rรฉpartition gรฉographique
Premiรจre partie : ETUDE chimique
1.INTRODUCTION
2.MATERIELS ET METHODES
2.1. Matรฉriels
2.1.1. Matรฉriel vรฉgรฉtal
2.1.1.1. Rรฉcolte et prรฉparation du matรฉriel vรฉgรฉtal
2.1.2. Produits chimiques
2.2. Mรฉthodes
2.2.1. Mรฉthodes dโextraction
2.2.1.1. Extraction ร froid
2.2.1.2 Extraction ร chaud
2.2.2. Mรฉthodes de purification
2.2.2.1. Traitement par la chaleur
2.2.2.1.1. Principe
2.2.2.1.2. Mode opรฉratoire
2.2.2.2. Fractionnement par le n-butanol
2.2.2.2.1. Principe
2.2.2.2.2. Mode opรฉratoire
2.2.2.3. Traitement par lโacรฉtate neutre de plomb
2.2.2.3.1. Principe
2.2.2.3.2. Mode opรฉratoire
2.2.2.4. Elimination des tanins
2.2.2.4.1. Principe
2.2.2.4.2. Mode opรฉratoire
2.2.2.5. Traitement par le charbon actif
2.2.2.5.1. Principe
2.2.2.5.2. Mode opรฉratoire
2.2.3. Calcul des rendements
2.2.4. Mรฉhode de concentration
2.2.5. Mรฉthodes analytiques
2.2.5.1. Chromatographie sur couche mince
2.2.5.1.1. Principe
2.2.5.1.2. Mode opรฉratoire
2.2.5.2. Rรฉactions de dรฉtection des familles chimiques
2.2.5.2.1. Prรฉparation des extraits
a). Extrait aqueux
b). Extrait hydroรฉthanolique
c). Extrait acide
d). Extrait chloroformique
2.2.5.2.2. Dรฉtection des alcaloรฏdes
a). Test de MAYER
b). Test de WAGNER
c). Test de DRAGENDORFF
2.2.5.2.3. Dรฉtection des flavonoรฏdes : Test de WILLSTรTTER
2.2.5.2.4. Dรฉtection des leucoanthocyanes : Test de BATE-SMITH
2.2.5.2.5. Dรฉtection des stรฉrols insaturรฉs : Test de SALKOWSKI
2.2.5.2.6. Dรฉtection des stรฉroรฏdes et triterpรจnes : Test de LIEBERMANNBURCHARD
2.2.5.2.7. Dรฉtection des tanins et polyphรฉnols
a) Test ร la gรฉlatine
b) Test ร la gรฉlatine salรฉe
c) Test au FeCl3
2.2.5.2.8. Dรฉtection des dรฉsoxyoses : Test de KELLER-KILIANI
2.2.5.2.9. Dรฉtection des iridoรฏdes
2.2.5.2.10. Dรฉtection des saponines
3.RESULTATS
3.1. Extraction
3.1.1. Extraction ร froid
3.1.2. Extraction aqueuse ร chaud ร reflux
3.2. Purification
3.2.1 Mรฉthodes adoptรฉes dans le protocole de purification
3.2.1.1 Fractionnement par le n-butanol
3.2.2 Mรฉthodes non adoptรฉes dans le protocole de purification
3.2.2.1. Prรฉcipitation par la chaleur
3.2.2.2 Prรฉcipitation par lโacรฉtate neutre de plomb
3.2.2.3. Elimination des tanins
3.2.2.4 Traitement par le charbon actif
3.4. Analyse des extraits
3.5. Caractรฉrisation chimique
3.5.1. Propriรฉtรฉs physico-chimiques
3.5.2. Nature chimique des principes actifs
4. DISCUSSION ET CONCLUSION
Deuxiรจme partie : ETUDE TOXICOLOGIQUE
1.INTRODUCTION
2.MATERIELS ET METHODES
2.1.Matรฉriels
2.1.1. Les animaux dโexpรฉrimentation
2.1.1.1. Les animaux ร sang chaud
2.1.1.2. Les animaux ร sang froid
2.1.2. Les plantes dโexpรฉrimentation
2.1.3. Les microorganismes utilisรฉs
2.1.3.1. Les souches microbiennes utilisรฉes
2.1.3.2. Les milieux de culture
2.1.3.2.1. Les milieux solides
2.1.3.2.2. Le milieu liquide
2.1.3.3. Les disques pour les tests dโantibiogramme
2.2. Mรฉthodes
2.2.1. Mรฉthode dโรฉtude des effets sur les animaux
2.2.1.1. Evaluation de la toxicitรฉ sur les animaux ร sang chaud
2.2.1.1.1. Estimation de la toxicitรฉ sur les souris
2.2.1.2. Evaluation de la toxicitรฉ sur les animaux ร sang froid
2.2.1.2.1. Principe
2.2.1.2.2. Mode opรฉratoire
2.2.1.2.3. Dรฉtermination de la CL50 (24 h)
2.2.2. Mรฉthodes dโรฉtude des effets sur les vรฉgรฉtaux
2.2.2.1. Etude des effets sur le pouvoir germinatif des graines
2.2.2.1.1 Principe
2.2.2.1.2. Mode opรฉratoire
a). Trempage
b). Germination
2.2.2.2. Dรฉtermination des effets sur la croissance des jeunes plantules
2.2.2.2.1. Principe
2.2.2.2.2. Mode opรฉratoire
a). Trempage
b). Germination
2.2.3.1. Stรฉrilisation
2.2.3.2. Etude de lโactivitรฉ antimicrobienne des extraits
2.2.3.2.1. Principe
2.2.3.2.2. Mode opรฉratoire
2.2.3.3. Dรฉtermination de la CMI et de la CMB
2.2.3.3.1. Dรฉtermination de la CMI
a). Mรฉthode des disques en milieu solide
b). Mรฉthode de dilution en milieu liquide
2.2.3.3.2. Dรฉtermination de la CMB
a). Dรฉfinition
b). Mode opรฉratoire
3.RESULTATS
3.1. Effets sur les animaux
3.1.1. Effets sur les animaux ร sang chaud
3.1.1.1. Description des symptรดmes dโintoxication chez la souris
3.1.2. Effets sur les animaux ร sang froid
3.1.2.1. Effets sur les tรชtards de grenouille
3.1.2.2. Effets sur les alevins de carpe
3.1.2.3. Effets sur les larves de moustique
3.2. Effets sur les vรฉgรฉtaux
3.3. Effets des extraits sur les microorganismes
3.3.1. Effets des extraits bruts
3.3.2. Effets des extraits obtenus au cours des รฉtapes de purification sur les microorganismes
3.3.3. Dรฉtermination de la CMI et de la CMB
3.3.3.1. Dรฉtermination de la CMI
3.3.3.2. Dรฉtermination de la CMB
4.DISCUSSION ET CONCLUSIONS
Conclusion gรฉnรฉrale et perspectives
Rรฉfรฉrences bibliographiques
Annexes
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