Soutenance mémoire
Les alcaloïdes
Le résidu d’évaporation à sec de l’extrait à tester est laissé macérer pendant au moins 12 h dans 3 ml d’acide chlorhydrique (HCl) 2 N. Après filtration sur coton, la solution obtenue est répartie dans 4 tubes à essai (1 ml dans chaque tube) dont le premier sert de témoin, les trois autres étant utilisés pour la détection des alcaloïdes, respectivement à l’aide des réactifs de MAYER, de WAGNER et de DRAGENDORFF (Annexe 2).
a) Test de MAYER : Cinq gouttes de réactif de MAYER sont ajoutées dans le second tube à essai. L’apparition d’une floculation ou d’un précipité indique la présence d’alcaloïdes.
b) Test de WAGNER : Cinq gouttes de réactif de WAGNER sont versées dans le troisième tube. L’apparition d’un précipité indique la présence d’alcaloïdes.
c) Test de DRAGENDORFF : Cinq gouttes de réactif de DRAGENDORFF sont versées dans le quatrième tube. Le résultat est positif s’il y a apparition d’un précipité. Si les précipités formés durant les tests précédents sont solubilisés par addition de 0,5 ml de mélange hydroéthanolique à 80%, l’extrait contient des alcaloïdes.
Les flavonoïdes (test de WILLSTÄTTER)
Le second tube est additionné de 0,5 ml de HCl (12 N) et de 2 tournures de magnésium. Dans le troisième tube, l’opération précédente est répétée, puis 1ml d’eau distillée et 1ml d’alcool isoamylique sont ajoutés au mélange. Au bout de 10 min, la présence de flavonoides dans le second et le troisième tube est observée. Elle se traduit par le changement de coloration : le virage au rouge dans le second tube indique la présence de flavones, tandis qu’un changement de la coloration au rouge-pourpre ou rouge-violacé dans le troisième tube indique celle de flavonols ou flavonones
EXTRACTION A FROID
EXTRACTION AQUEUSE Dix grammes de poudre de feuilles sont délayés dans 100 ml d’ED (rapport 1/10, P/V). L’extraction se poursuit selon la méthode décrite au § II.2.1.1 (p. 8). Le surnageant obtenu après centrifugation est évaporé et le résidu sec obtenu est repris dans 10 ml d’ED (rapport 1/1, P/V). Si un précipité apparait, une deuxième centrifugation pendant 5 min à 10 000 trs/min est nécessaire. Le surnageant limpide, fluide, de couleur marron obtenu est toxique sur souris (voir méthode d’estimation de la toxicité au § II.2.1.1, p. 27). Cet extrait concentré selon le rapport 1/1 constitue l’extrait brut (EB).
EXTRACTION HYDROETHANOLIQUE 75% Un mélange hydroéthanolique 75% est utilisé pour l’extraction de 10 g de poudre de feuilles, selon la méthode décrite au § II.2.1.1 (p. 8). Un extrait brut limpide de volume 10 ml, fluide et de couleur marron est obtenu. Il est toxique sur souris (voir méthode d’estimation de la toxicité au § II.2.1.1, p. 27)
DEGRE D’HOMOGENEITE DES DIFFERENTS EXTRAITS
Le chromatogramme de la figure 4 (p. 21) montre l’évolution de l’homogénéité des différents extraits obtenus au cours de la purification. Après avoir été observé à la lumière ultraviolette de longueurs d’ondes égales à 254 nm et 366 nm, le chromatogramme a été révélé par le réactif à la vanilline sulfurique (cf. § II.2.5.1.2, p. 12). Les différents constituants apparaissent sous forme de taches fluorescentes avec la vanilline sulfurique (figure 4, p. 21). Ainsi, l’extrait brut comporte trois bandes majeures sous UV à 254 nm, alors que l’extrait E3 n’en présente qu’une. La purification a donc permis d’éliminer 2 bandes majeures.
EFFETS DE L’EXTRAIT BRUT SUR LA CROISSANCE DES JEUNES PLANTULES
Les effets de l’EB sur les représentants des Liliopsida (riz) et des Magnoliopsida (petit pois) ont été évalués à différentes doses. L’expérience se déroule suivant la méthode décrite au § II.2.2.2 (p. 30). Sept lots de 30 graines ont été utilisés pour le riz et le petit pois : 6 parmi les 7 lots trempés dans l’eau de robinet sont mis à germer en présence de l’EB à des concentrations allant de 0,22 à 7,2 mg/ml. Le lot restant est arrosé avec de l’eau de robinet et sert de témoin.
Pour le riz : L’EB a inhibé la croissance des épicotyles et hypocotyles du riz. Les taux d’inhibition de la croissance des épicotyles et hypocotyles au 15ème jour de l’expérience sont montrées sur les figures 7 et 8 (p. 38, 39) et présentés dans le tableau°10 (p. 40).
Pour le petit pois : Les jeunes plantules ont montré une croissance puis ont pourri au bout de 5 jours. L’extrait brut a inhibé complètement la croissance des jeunes plantules de petit pois au 15ème jour du test. Les inhibitions de la croissance des épicotyles et hypocotyles au 15ème jour de l’expérience sont montrées sur les figures 9 et 10 (p. 39, 40) et présentés dans le tableau 10 (p.40).
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Table des matières
LISTE DES ABREVIATIONS
GLOSSAIRE
LISTES DES FIGURES
LISTE DES TABLEAUX
INTRODUCTION GENERALE
Première partie : ETUDE CHIMIQUE
1. INTRODUCTION
II. MATERIELS ET METHODES
II.1 MATERIELS
II.1.1 MATERIEL VEGETAL
II.1.1.1 Classification
II.1.1.2 Description botanique des Connaracées
II.1.1.2.1 Description du genre Cnestis
II.1.1.2.2 Description de l’espèce Cnestis polyphylla
II.1.1.3 Distribution géographique de la plante
II.1.1.4 Date et lieu de récolte
II.1.1.5 Préparation et conservation du matériel végétal
II.1.1.6 Utilisation de la plante
II.1.2 LES PRODUITS CHIMIQUES
II.2 METHODES
II.2.1 METHODES D’EXTRACTION
II.2.1.1 Extraction à froid
II.2.1.2 Extraction à chaud
II.2.2 METHODE DE PURIFICATION
II.2.2.1 Précipitation par l’acétone 50%
II.2.2.1.1 Principe
II.2.2.1.2 Mode opératoire
II.2.2.2 Précipitation par l’éthanol 50%
II.2.2.2.1 Principe
II.2.2.2.2 Mode opératoire
II.2.2.3 Précipitation par l’hexane
II.2.2.3.1 Principe
II.2.2.3.2 Mode opératoire
II.2.2.4 Précipitation par l’acétate neutre de plomb
II.2.2.4.1 Principe
II.2.2.4.2 Mode opératoire
II.2.2.5 Filtration sur charbon actif
II.2.2.5.1 Principe
II.2.2.5.2 Mode opératoire
II.2.2.6 Précipitation par le n-butanol
II.2.2.6.1 Principe
II.2.2.6.2 Mode opératoire
II.2.3 METHODE DE CONCENTRATION
II.2.4 METHODE DE DETERMINATION DU RENDEMENT
II.2.5 METHODES D’ANALYSE
II.2.5.1 Chromatographie sur couche mince
II.2.5.1.1 Principe
II.2.5.1.2 Mode opératoire
a) Dépôt de l’échantillon
b) Développement de la plaque
c) Révélation du chromatogramme
II.2.5.2 Réaction de détection des familles chimiques
II.2.5.2.1 Les alcaloïdes
a) Test de MAYER
b) Test de WAGNER
c) Test de DRAGENDORFF
II.2.5.2.2 Les flavonoïdes et leucoanthocyanes
a) Les flavonoïdes (test de WILLSTÄTTER)
b) Les leucoanthocyanes (test de BATE-SMITH)
II.2.5.2.3 Les tanins et autres polyphénols
a) Test à la gélatine
b) Test à la gélatine salée
c) Test au chlorure ferrique
II.2.5.2.4 Les anthraquinones (test de BORNTRAGER)
II.2.5.2.5 Les désoxyoses (Test de KELLER-KILIANI)
II.2.5.2.6 Les iridoïdes
II.2.5.2.7 Les stéroïdes, les triterpènes et les stérols insaturés
a) Test de LIEBERMANN-BURCHARD
b) Test de SALKOWSKI
II.2.5.2.8 Les coumarines
II.2.5.2.9 Les saponosides
II.2.5.2.10 Les acides aminés
a) Principe
b) Mode opératoire
III. RESULTATS
III.1 EXTRACTION DES PRINCIPES TOXIQUES
III.1.1 EXTRACTION A FROID
III.1.1.1 Extraction aqueuse
III.1.1.2 Extraction hydroéthanolique 75%
III.1.2 EXTRACTION AQUEUSE A CHAUD
III.1.2.1 Extraction aqueuse
III.1.2.2 Extraction hydroéthanolique 75%
III.2 PURIFICATION
III.2.1 PRECIPITATION PAR L’ACETONE 50%
III.2.2 FRACTIONNEMENT PAR LE n-BUTANOL
III.2.3 FILTRATION SUR CHARBON ACTIF
III.3 DEGRE D’HOMOGENEITE DES DIFFERENTS EXTRAITS
III.4 RENDEMENTS
III.5 CARACTERISATION CHIMIQUE
III.5.1 PROPRIETES PHYSICO-CHIMIQUES
III.5.2 NATURE CHIMIQUE
IV. DISCUSSION ET CONCLUSIONS
Deuxième partie : ETUDE TOXICOLOGIQUE
I. INTRODUCTION
II. MATERIELS ET METHODES
II.1 MATERIELS
II.1.1 LES ANIMAUX D’EXPERIMENTATION
II.1.1.1 Les animaux à sang chaud
Les souris
II.1.1.2 Les animaux à sang froid
Les larves de moustique
II.1.2 LES VEGETAUX D’EXPERIMENTATION
II.1.3 LES MICROORGANISMES UTILISES
II.1.4 MILIEUX DE CULTURE
II.1.5 LES DISQUES POUR LES TESTS D’ANTIBIOGRAMME
II.1.6 LES STERILISATEURS
II.2 METHODES
II.2.1 METHODES D’ETUDE DES EFFETS SUR LES ANIMAUX
II.2.1.1 Méthodes d’étude des effets sur les animaux à sang chaud
Test sur souris
a) Influence des voies d‘administration
b) Estimation de la toxicité aigüe
c) Détermination de la DL50 (24 h)
II.2.1.2 Méthodes d’étude des effets sur les animaux à sang froid
II.2.1.2.1 Principe
II.2.1.2.2 Mode opératoire
II.2.1.2.3 Détermination de la concentration létale 50% (CL50) 24 h
II.2.2 METHODES D’ETUDE DES EFFETS SUR LES VEGETAUX
II.2.2.1 Etude des effets sur le pouvoir germinatif des graines
II.2.2.2 Eude des effets sur la croissance des jeunes plantules
II.2.2.2.1 Principe
II.2.2.2.2 Mode opératoire
a) Trempage
b) Germination
II.2.3 METHODES D’ETUDE DES EFFETS SUR LA CROISSANCE DES MICROOGANISMES
II.2.3.1 Test d’antibiogramme
II.2.3.1.1 Principe
II.2.3.1.2 Mode opératoire
II.2.3.2 Détermination de la CMI en milieu liquide
III. RESULTATS
III.1 EFFETS DES EXTRAITS SUR LES ANIMAUX
III.1.1 EFFETS DES EXTRAITS SUR LES ANIMAUX A SANG CHAUD
Effets sur les souris
a) Influences de différentes voies d’administration
b) Description des symptômes
c) Détermination de la DL50 (24h)
III.1.2 EFFETS DE L’EXTRAIT BRUT SUR LES ANIMAUX A SANG FROID
III.1.2.1 Effets sur les larves de moustique
III.1.3 EFFETS DE L’EXTRAIT BRUT SUR LES VEGETAUX
III.1.3.1 Effets de l’extrait brut sur le pouvoir germinatif des graines
III.1.3.2 Effets de l’extrait brut sur la croissance des jeunes plantules
III.1.4 EFFETS DES EXTRAITS BRUT ET PURIFIE SUR LES MICROORGANISMES
III.1.4.1 Activité antimicrobienne des extraits
III.1.4.1.1 Sensibilité des germes
III.1.4.1.2 Détermination de la CMI
IV. DISCUSSION ET CONCLUSION
CONCLUSION GENERALE ET PERSPECTIVES
REFERENCES BIBLIOGRAPHIQUES
ANNEXES
RESUME
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