Etude sérologique chez les bovins laitiers

Etude sérologique chez les bovins laitiers

Choix des couples d’amorces

Neuf couples d’amorces ont été initialement introduits dans l’étude. Les séquences des amorces ont été conformes aux publications originales, et soumises au laboratoire spécialisé (Biodesign, Bangkok, Thaïlande), pour leur production. Les volumes calculés par le laboratoire permettaient de reconstituer les amorces à une concentration de 100 mM, constituant la solution stock, rediluée à 20 mM et aliquotée pour la solution de travail.
Comme ceci a été évoqué précédemment, trois jeux d’amorces n’ont donné aucun résultat satisfaisant au cours des premières étapes de l’évaluation, malgré le respect des protocoles publiés (cf. Partie I 3.2.5). Pour ne pas retarder la réalisation du protocole d’évaluation, et puisque ces 3 couples d’amorces ont jusqu’alors été très peu usités, ils ont été écartés de notre étude. Six jeux d’amorces, incluant les 4 jeux les plus classiquement utilisés par divers laboratoires ont donc été évalués comparativement.

Réalisation des PCR

Les PCR ont été réalisées dans un volume final de 11μl, contenant 10μl de réactifs constitués du tampon (buffer 10x : 10mM Tris; 0 mMMgcl2; 50mMKcl), du MgCl2, de la Taq-Polymérase (Taq DNA Polymérase, Recombinant, Invitrogen), des dNTP (dNTP Set, Fermentas), des 2 amorces (Biodesign), de l’eau distillée et éventuellement du DMSO, selon les quantités indiquées dans le Tableau 2. L’échantillon à tester était introduit dans ce milieu sous un volume de 1μl.
Les cycles d’amplification ont utilisé un thermocycleur (Px2 Thermal Cycler, Thermo Electron Corporation) programmé pour chaque amorce selon un protocole en accord avec les recommandations de leurs auteurs (cf. Tableau 2). A l’issue du thermocycle, il a été réalisé une migration des 11μl de produits de PCR, dans un gel d’agarose (Agarose D1 Low EEO, pronadisa, Condia) à 2%, dans une cuve à électrophorèse (Wealtec et Biorad) contenant du tampon TEB 1x (Tris base 0.89 mol/L, Acide borique 1.54 mol/L, EDTA sel dissodique 0.025 mol/L). L’introduction dans les puits se faisait après mélange du produit de PCR avec 2μl d’une solution aqueuse contenant 40% de glycérol et 0,25% de bleu de romophénol. Une tension de 120V (500 mA) était appliquée pendant 1 heure. Le marquage de l’ADN a été réalisé après la migration par incubation du gel pendant 5 min dans une solution de bromure d’éthidium (environ 0,3 mg/l) puis lavage dans l’eau distillée pendant 15 minutes. La lecture des gels s’est faite après photographie sous éclairage UV (λ=302nm, DyNA Light, Labnet).
Lorsque les PCR étaient effectuées sur les dilutions successives d’ADN ou de sang parasité, l’introduction de l’échantillon dans le mélange réactionnel (master mix) se faisait systématiquement dans le sens des dilutions décroissantes de manière à éviter les risques de contamination d’une dilution par une dilution inférieure. Toutefois, le contrôle négatif était toujours manipulé en dernier afin de détecter une éventuelle contamination avec un risque maximal.
Toutes les manipulations ont été répétées plusieurs fois et par plusieurs manipulateurs, afin d’obtenir les résultats les plus stables et concordants possibles.

Table des matières

Table des illustrations
Introduction générale
Partie I : Etude bibliographique
1. Généralités : Trypanosomose à T evansi
1.1. Le parasite
1.2 L’hôte et les effets sur hôte
1.2.1 Les principaux hôtes de T. evansi
1.2.2 L’immunodépression induite par T. evansi
1.2.3 Les traitements
1.3 Les vecteurs
1.4 Epidémiologie, facteurs de risques et contrôle du Surra
1.5 L’importance de Trypanosoma evansi en Asie
1.5.1 La présence du Surra en Asie
1.5.2 L’impact du Surra en Asie et dans le monde
1.5.3 Le projet initié sur T. evansi en Asie du Sud-Est
2. Description de l’élevage bovin laitier en Thaïlande
3. Les outils de diagnostics de l’infection à T. evansi
3.1 Les outils d’utilisation courante
3.2 La détection de Trypanosoma evansi par technique PCR
3.2.1 Principe
3.2.2 Historique
3.2.3 Les paramètres de la PCR
3.2.4 Précautions lors de la réalisation pratique au laboratoire
3.2.5 Les amorces candidates
3.3 La détection sérologique de Trypanosoma evansi par technique Ac- ELISA
3.3.1 Rappel sur le principe de l’Ac-ELISA
3.3.2 Le développement de l’Ac-ELISA au cours des précédentes études
Partie II : Evaluation comparée de différents couples d’amorce pour la détection de Trypanosoma evansi par PCR
1. Introduction 
2. Matériel et méthode
2.1 Dilutions d’ADN purifié
2.2 Dilutions de sang de rat parasitémique
2.3 Echantillons de bovins issus du terrain
2.4 Choix des couples d’amorces
2.5 Réalisation des PCR
3. Résultats
3.1 Dilutions d’ADN purifié
3.2 Dilution de sang de rat parasitémique
3.3 Echantillons de terrain
4. Discussion
5. Conclusion
Partie III : Etude sérologique chez les bovins laitiers en Thaïlande
1. Mise au point et standardisation d’un outil Ac-ELISA
1.1 Méthode de sélection des échantillons de référence
1.2 Méthodes de préparation et validation d’un antigène produit localement pour l’ELISA
1.3 Résultats de la mise en place de l’outil Ac-ELISA
1.3.1 Préparation d’antigènes de T. evansi
1.3.2 Sélection des échantillons de référence
1.3.3 Comparaison des résultats obtenus avec les deux types d’antigènes
1.3.4 Discussion/conclusion
2. Matériel et méthode de l’enquête sur l’élevage bovin laitier
2.1 Echantillonnage et réalisation des prélèvements
2.2 Réalisation des ELISA T.evansi
2.3 Réalisation des analyses PCR
2.4 Analyses statistiques
3. Résultats
3.1 Echantillonnage
3.2 Résultats généraux
3.3 Groupes d’âges
3.4 Distribution géographique
3.5 Résultats des PCR
4. Discussion
4.1 Discussion générale des résultats
4.2 Discussion théorique de la méthodologique
4.3 Retour sur le contexte de l’étude : apports et les perspectives
Conclusion
Conclusion générale
ANNEXE 1 : Préparation d’antigènes solubles de T. evansi pour l’Ac-ELISA
ANNEXE 2 : Préparation des échantillons au phénol chloroforme pour la réalisation
de PCR
Bibliographie

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