Soutenance mémoire
Plasmodium
L’agent pathogène du paludisme est un hématozoaire du genre Plasmodium, appartenant à l’embranchement des Sporozoa et à l’ordre des Hæmosporidae. Cent vingt-trois espèces du genre Plasmodium ont été répertoriées. Ce sont des parasites intracellulaires obligatoires des vertébrés transmis par des moustiques femelles. On distingue quatre espèces de Plasmodium spécifiquement humains : Plasmodium falciparum : c’est l’espèce la plus pathogène. Elle peut être responsable de cas mortels en se multipliant dans les micro vaisseaux vitaux comme le cerveau, les reins ou les poumons. Elle est présente dans toute la zone tropicale, mais dominante en Afrique. Plasmodium malariae : cette espèce est responsable de la fièvre quarte (fièvre survenant toutes les 72 h). Sa répartition mondiale est très inégale. Plasmodium ovale : elle ne provoque pas d’accès palustre grave mais peut entraîner des rechutes 4 à 5 ans après la primo-infection. On la trouve principalement en Afrique de l’Ouest. Plasmodium vivax : cette espèce peut entraîner des rechutes 4 à 5 ans après la primo-infection. Elle est étendue à l’ensemble de la zone tropicale, excepté l’Afrique noire. P. vivax est également présente dans certaines régions tempérées.
Plasmodium falciparum in vitro
Trager et Jensen (1976) ont décrit un protocole pour la culture des stades érythrocytaires de P. falciparum in vitro. Desjardins et al., (1979) ont proposé une miniaturisation et semi-automatisation permettant la culture sur des plaques de microtitration et la quantification de la croissance parasitaire par l’incorporation d’un précurseur d’acides nucléiques radio marqué. Cette technique nous a permis de déterminer l’activité antipaludique du BM et des autres drogues. Elle est aussi le point de départ des techniques de détermination du stade sensible et de combinaison de drogues.
a. Entretien de la culture de Plasmodium falciparum in vitro : Les souches sont maintenues en culture continue au laboratoire selon la technique de Trager et Jensen (1976). Les GRP sont cultivés dans des flacons de 25 cm3 (Corning Costar Corporation, USA) contenant 8,5 ml de milieu RPMI 1640, 0,7 ml de SH, 0,1 ml de L-glut. et 400 µl de sang parasité (hématocrite = 4 %). La parasitémie est maintenue entre 0,7 et 3 % (autour de 2 %). Les ajustements de parasitémie sont réalisés avec des hématies saines lavées (Annexe 2). Les cultures sont incubées dans une étuve à 37°C, avec 5% de CO2, et une humidité autour de 90%. Le milieu est renouvelé quotidiennement et un contrôle microscopique (x 1000) de la parasitémie est effectué par la réalisation d’un frottis sanguin fixé au méthanol, coloré au Giemsa, afin de vérifier le bon état de la culture (Annexe 2).
Test de stade sensible in vitro
Une culture parasitaire synchronisée à 0,5 % de parasitémie a été répartie dans trois plaques de 96 puits (voir chapitre précédent). A partir de T0, toutes les 8 h, des drogues sont apportées a des concentrations 50, 100, 200, 400, 800, 1600, 3200 et 6400 % de la CI50 sur une période de 48 h (0, 8, 16, 24, 32, 40 h). Un témoin de croissance et un témoin négatif ont été effectués en parallèle. L’état de développement du parasite a été suivi par coloration de Giemsa et observation au microscope. Après chaque période d’incubation de 8 h avec la drogue, les GRP sont lavés trois fois avec le milieu RPMI 1640 puis remis en culture avec du milieu de culture RPMI 1640 complémenté de SH et de la L-glut (Benoit-Vical et al., 1998). Après 48 h d’incubation (premier cycle de croissance), 0,25 µCi/puits d’hypoxanthine tritiée sont ajoutes et continué l’incubation jusqu’à la 84ème heure. Puis, les plaques on été congélées à -18 ºC (Whitehead et Peto, 1990). La parasitémie de chaque puits a été mesurée selon la méthode décrite au chapitre précédent. Les résultats sont exprimés en pourcentage de croissance, par rapport à un témoin de culture. Voir le plan de plaque et le protocole à l’Annexe 4 (Valentin et al., 1997).
Détermination du stade sensible à la chloroquine in vitro
Les essais initiaux ont montré des pourcentages d’inhibition très élevés ne permettant pas de calculer les CI50 mais qui cependant montrent une diminution significative de la sensibilité de P. falciparum FcB1 à la CQ vers la fin du cycle (schizontes et mérozoïtes). La Figure 14 montre les stades les plus sensibles anneaux agés, trophozoïtes jeunes et trophozoïtes agées; les anneaux jeunes et schizontes jeunes ont montré une sensibilité moyenne et les schizontes agés et les mérozoïtes ont présenté une faible sensibilité. Nos résultats coïncident avec ceux de Ter-Kuile et al. (1993) et Zhang et al. (1986) qui, in vitro sur P. falciparum, ont trouvé que les stades les plus sensibles étaient les anneaux et les trophozoïtes. Yayon et al. (1983) ont montré la sensibilité des trophozoïtes et la sensibilité moyenne des schizontes et anneaux jeunes. D’autre part Caillard et al., (1992) et Chimanuka et al., (2001) ont reporté sur le modèle in vivo avec P. vinckei petteri et P. chabaudi chabaudi respectivement, les trophozoïtes comme le stade le plus sensible, ce qui est aussi en accord avec nos résultats. Pour la CQ les CI50 obtenues présentent les valeurs les plus basses sur les stades anneaux agés, trophozoïtes jeunes et trophozoïtes agées; ensuite les valeurs de CI augmentent en montrant la faible sensibilité des schizontes agés et des mérozoïtes.
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Table des matières
I. Introduction
1. Le paludisme
2. Le bleu de méthylène
3. L’interaction hème/glutathion
II. Matériel et méthodes
1. Matériels et Réactifs
1.1. Le bleu de méthylène
1.2. Drogues antipaludiques
1.3. Matériels
1.4. Réactifs
2. Matériel biologique
2.1. Les souches de plasmodies
a. Plasmodium falciparum
b. Plasmodium de rongeur
2.2. La lignée cellulaire
2.3. Les animaux
a. Comportement éthique vis-à-vis de l’expérimentation animale
b. Les rongeurs
c. Le vecteur expérimental
3. Culture/élevage et maintenance
3.1. Plasmodium falciparum in vitro
a. Entretien de la culture de Plasmodium falciparum in vitro
3.2. Plasmodium de rongeur
a. Constitution des stocks de sang parasité et conservation
b. Infestation et suivi de l’infection
3.3. Les cellules
a. Culture et conservation de la lignée cellulaire BJAB
3.4. Anophèles stephensi
a. Elevage
b. Production de sporozoïtes de Plasmodium yoelii yoelii
4. Techniques particulières
4.1. Techniques d’étude de l’activité antipaludique in vitro
a. Test de chimiosensibilité de Plasmodium falciparum
b. Détermination de la parasitémie
c. Détermination des Concentrations Inhibitrices 50% (CI50)
d. Evaluation du potentiel antipaludique
e. Détermination du stade érythrocytaire sensible
f. Synchronisation de la souche
g. Test de stade sensible in vitro
h. Etude de combinaison de drogues
4.2. Techniques d’étude de l’activité antipaludique in vivo
a. Test suppressif de 4 jours ou test de Peters
b. Evaluation de l’activité sur stades hépatiques (inhibition de l’invasion)
c. Test de l’activité sur stages hépatiques
4.3. Technique d’étude de la cytotoxicité
a. Test de cytotoxicité
b. Détermination des Concentrations Toxiques 50% (CT50)
c. Détermination d’un index de sélectivité (IS)
4.4. Etude des mécanismes d’action
a. Modèle pharmacologique sur l’interaction hème/glutathion
a.1. Préparation des produits à tester
a.2. Étude de l’interaction hème-glutathion
a.3. Essai de fixation à l’hémozoïne par espectrofotometrie UV VIS
a.4. Essai de fixation a l’hémozoïne par chromatographie sur couches minces CCM
a.5. Essai de fixation à l’hémozoïne par spectrométrie de masses
III. Résultats
1. Évaluation in vitro de l’activité antipaludique sur les souches de Plasmodium falciparum
1.1. Détermination des profils de chimiosensibilité des souches F32, HB3, FcB1 et FcM29 de P. falciparum
1.2. Activité antipaludique du bleu de méthylène in vitro
2. Détermination in vitro du stade érythrocytaire de Plasmodium falciparum sensible aux composés
2.1. Détermination du stade sensible au bleu de méthylène in vitro
2.2. Détermination du stade sensible à la quinine in vitro
2.3. Détermination du stade sensible à la chloroquine in vitro
2.4. Détermination du stade sensible au artéméther in vitro
3. Etude in vitro de combinaison entre la bleu de méthylène et divers composés antipaludiques
3.1. Combinaison entre le bleu de méthylène et l’amodiaquine
3.2. Combinaison entre le bleu de méthylène et l’artéméther
3.3. Combinaison entre le bleu de méthylène et l’atovaquone
3.4. Combinaison entre le bleu de méthylène et la chloroquine
3.5. Combinaison entre le bleu de méthylène et la doxycycline
3.6. Combinaison entre le bleu de méthylène et la méfloquine
3.7. Combinaison entre le bleu de méthylène et la primaquine
3.8. Combinaison entre le bleu de méthylène et la pyriméthamine
3.9. Combinaison entre le bleu de méthylène et la quinine
4. Technique d’étude de l’activité antipaludique in vivo
4.1. Test suppressif de 4 jours ou test de Peters
4.2. Evaluation de l’activité sur stages hépatiques (inhibition de l’invasion)
5. Technique d’étude de la cytotoxicité
5.1. Essais préliminaires
a. Optimisation de la concentration cellulaire pour les essais
b. Détermination d’un contrôle de cytotoxicité
5.2. Test de cytotoxicité
5.3. Index de sélectivité (IS)
6. Etude des mécanismes d’action
6.1. Modèle pharmacologique sur l’interaction hème/glutathion
a. Essaies préliminaires
a.1. Stabilité de bleu de méthylène
a.2. Stabilité de Glutathion réduit
a.3. Stabilité de l’hème
a.4. Stabilité de l’o-phthalaldehyde
a.5. Temps d’incubation
a.6. Température d’incubation
a.7. Effet de solvant (méthanol)
b. Test sur l’interaction hème/glutathion
b.1. Amodiaquine
b.2. Artemether
b.3. Atovaquone
b.4. Bleu de méthylène
b.5. Chloroquine
b.6. Doxycycline
b.7. Mefloquine
b.8. Primaquine
b.9. Pyrimethamine
b.10. Quinine
6.2. Les interactions physique chimiques drogue-hème
a. Essai de fixation à l’hémozoïne par espectrofotometrie UV VIS
b. Essai de fixation a hémozoïne par chromatographie sur couches minces CCM
c. Essai de fixation à hémozoïne par spectrométrie de masses
IV. Discussion et perspectives
Chapitre 1 – Évaluation in vitro de l’activité antipaludique sur les souches de Plasmodium falciparum
1. Détermination des profils de chimiosensibilité des souches F32, HB3, FcB1 et FcM29 De P. falciparum
2. Détermination in vitro du stade érythrocytaire de Plasmodium falciparum sensible aux composés
2.1. Détermination du stade sensible au bleu de méthylène in vitro
2.2. Détermination du stade sensible à la quinine in vitro
2.3. Détermination du stade sensible à la chloroquine in vitro
2.4. Détermination du stade sensible au artéméther in vitro
3. Etude in vitro de la combinaison entre bleu de méthylène et divers composés antipaludiques
3.1. Interactions générales
Chapitre 2 – Techniques d’étude de l’activité antipaludique in vivo
1. Test suppressif de 4 jours ou test de Peters
2. Evaluation de l’activité sur stades hépatiques (inhibition de l’invasion)
Chapitre 3 – Technique d’étude de la cytotoxicité
1. Essais préliminaires
2. Test de cytotoxicité
Chapitre 4 – Etude des mécanismes d’action
1. Modèle pharmacologique sur l’interaction hème/glutathion
1.1. Essaies préliminaires
a. Stabilité des composés
a.1. Bleu de méthylène
a.2. Glutathion réduit
a.3, L’hème
a.4. L’o-phthalaldehyde
b. Temps d’incubation
c. Température d’incubation
d. Effet de solvant (méthanol)
1.2. Test sur l’interaction hème/glutathion
a. Amodiaquine
b. Artemether
c. Atovaquone
d. Bleu de méthylène
e. Chloroquine
f. Doxycycline
g. Mefloquine
h. Primaquine
i. Pyrimethamine
j. Quinine
1.3. Résultats généraux d’activité des drogues
1.4. Combinaisons des drogues
a. Combinaison BM+ATO
b. Combinaison BM+CQ
c. Combinaison BM+Q
2. Les interactions physique chimiques drogue-hème
2.1. Essai de fixation à hémozoïne par espectrofotometrie UV VIS
2.2. Essai de fixation à hémozoïne par chromatographie sur couches minces CCM
2.3. Essai de fixation à hémozoïne par spectrométrie de masses
V. Résumé – conclusion
Bibliographie
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