Etude par chromatographie en phase gazeuse couplée à un spectromètre de masse 

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Etat de l’art : analyse des baumes

Diverses techniques analytiques sont employées pour l’analyse chimique de baumes de momies. Il est possible de distinguer deux types d’analyses : celle des matériaux inorganiques, tel que la spectroscopie Raman, la spectroscopie à rayons X à dispersion d’énergie, la diffraction de rayons X etc, et celle des matériaux organiques. Un focus va être fait sur les diverses techniques analytiques possible pour l’identification de la partie organique. Dans la littérature, deux méthodes d’analyses sont principalement utilisées : la spectroscopie infrarouge à transformée de Fourier ainsi que la chromatographie en phase gazeuse couplée à un spectromètre de masse.
Différents modes infrarouges sont cités dans la littérature, il est possible de voir notamment des analyses par pastilles de bromure de potassium avec un détecteur DTGS et des analyses par Réflectance totale atténuée avec un détecteur MCT (l’ensemble de ces techniques est détaillé dans le chapitre 3) (Łucejko et al. 2012; Daher et al. 2013; Ménager, Azemard, et Vieillescazes 2014; Stacey et al. 2018).
L’emploi de la chromatographie gazeuse couplée à un spectromètre de masse est souvent précédé de traitement préalable des échantillons, tel que des réactions de saponification, des extractions à monosolvant à l’hexane ou au dichlorométhane ou à l’éther diéthylique et des triméthylsilylations (Colombini et al. 2000; Łucejko et al. 2012; Ménager, Azemard, et Vieillescazes 2014; Jacqueline et al. 2016; Goyon, Mathe, et Vieillescazes 2016; Brettell et al. 2017; Łucejko et al. 2017; Jones et al. 2018).
Les substances généralement identifiées sont des huiles végétales, des graisses animales, de la cire d’abeille, de la résine de Conifère, de la résine mastic, de la poix et du bitume. Il est à noter qu’à partir du Nouvel Empire (-1500 BC) des mélanges de toutes ces substances sont identifiés dans les baumes de momies contrairement à la période Prédynastique où les baumes étaient composés principalement de corps gras et de traces de résines (Jones et al. 2018).

Matériaux principalement utilisés dans la formulation de baumes

Une grande variété de substances naturelles a été utilisée dans la fabrication de baumes (Fig. 3), telles que les huiles végétales, les graisses animales, les résines, le bitume ou la cire d’abeille et même d’autres additifs tels que le henné ou des épices (Goyon 1972; Nicholson et Shaw 2000; Buckley, Clark, et Evershed 2004; Abdel-Maksoud et El-Amin 2011; Marshall et Lichtenberg 2013). Ces substances possédaient certaines propriétés telles qu’être hydrophobes, antibactériennes ou odoriférantes, mais elles pouvaient aussi avoir un caractère sacré ou être simplement utilisées pour leur esthétisme (Buckley et Evershed 2001; Nicholson et Shaw 2000).
Chaque matériau utilisé dans la formulation d’un baume est soumis à une succession de réactions chimiques liées à son évolution au cours du temps, depuis son obtention jusqu’au vieillissement du baume mais également il peut subir des réactions liées à la préparation, comme le chauffage. C’est le cas par exemple lors de l’exsudation d’une résine végétale qui est dans un premier temps extraite de sa matrice d’origine. Celle-ci peut ensuite être légèrement chauffée pour la rendre plus malléable et favoriser la formulation. Enfin, le passage du baume au travers des siècles entraîne également la poursuite de la vie chimique de la préparation. Ainsi, afin d’appréhender les modes de préparation et d’usage de chaque ingrédient, il est nécessaire de connaître et comprendre chacune des réactions mises en jeu. (Bailly 2015; Ménager, Azemard et Vieillescazes 2014; Vieillescazes et Coen 1993).
Chacune de ces substances va donc être présentée par la suite, avec sa composition chimique ainsi que ses modes de dégradation possibles.

Les huiles végétales et les graisses animales : composition chimique et dégradation

Les huiles végétales et graisses animales étaient très souvent employées pour la réalisation de baumes de momification en Égypte ancienne, mais elles étaient aussi utilisées dans d’autres domaines comme par exemple la cuisine, la parfumerie et pour des préparations médicinales (Nicholson et Shaw 2000). Leur utilisation dans les baumes était due à leur propriété de barrière hydrophobe afin de limiter la réhydratation du corps. Il y avait également un côté religieux dans l’emploi de certaines graisses animales. En effet, la nature de la graisse appliquée pouvait indiquer la volonté d’être pris en charge par le dieu associé dans l’au-delà (Dunand et Lichtenberg 2005). L’utilisation d’un ensemble d’huiles végétales telles que l’huile de ricin, de lin, de palme, d’olive, de carthame et d’un large panel de graisses animales telles que la graisse de chèvre, de mouton, d’oie, a été mentionnée (Clark 2006). Les molécules présentes au sein d’huiles végétales et de graisses animales ont de nombreuses similitudes malgré leur état physique différent. En effet, les huiles végétales sont généralement à l’état liquide (à l’exception de l’huile de palme) et les graisses animales sont à l’état solide à température ambiante (Bastien 2011). Ces corps gras sont principalement constitués de mélange de glycérides notamment des triglycérides et d’autres composés minoritaires tels que les stérols.

Les triglycérides et les acides gras

Un triglycéride est constitué de glycérol estérifié avec trois acides gras (Fig. 4). Les acides gras sont des acides carboxyliques à longue chaine et à nombre pair d’atomes de carbone (Fig. 5) (Bhat, Nagasampagi et Sivakumar 2005). Ils peuvent être saturés ou insaturés. Les acides gras provenant d’huiles végétales sont généralement de nature saturée et insaturée, tandis que pour les graisses animales ils sont principalement de nature saturée ce qui implique une meilleure fluidité des huiles par rapport aux graisses (Nicholson et Shaw 2000). Pour les acides gras insaturés, la double liaison est la plupart du temps en position cis, la position trans est très peu représentée hormis dans les produits laitiers ou les graisses animales de ruminants (Bastien 2011).
Les acides gras les plus communs sont, pour les acides gras saturés, les acides myristique, palmitique (Fig. 6) et stéarique et pour les acides gras insaturés, les acides palmitoléique, oléique (Fig. 7), linoléique et linolénique (Tableau 1).

Autoxydation des acides gras insaturés

Ce type de dégradation des corps gras est naturelle et correspond au rancissement (Fritsch et Deatherage 1956). Il s’agit d’une oxygénation par l’oxygène de l’air des acides gras insaturés. Plusieurs réactions chimiques radicalaires vont former un intermédiaire hydroperoxyde afin d’engendrer in fine des acides monocarboxyliques (C) courts et des acides dicarboxyliques (DC). Les acides dicarboxyliques formés ont généralement entre 4 et 13 carbones ; l’acide azélaïque DC 9 est l’acide majoritairement formé (Fig. 9). Les diacides formés vont dépendre des positions des insaturations des acides gras initialement présents (Passi et al. 1993). Figure 9: Acide dicarboxylique en C9, acide azélaïque, DC 9.

La β oxydation

C’est un processus d’oxydation qui concerne l’ensemble des acides gras afin de former des acides gras saturés avec deux carbones en moins ; par exemple la transformation de l’acide oléique (C 18 :1) en acide palmitoléique (C 16 :1) (Evershed 1992). Cette oxydation se réalise préférentiellement dans les mitochondries des cellules et elle est activée par des enzymes tel que l’acétyl-CoA. Dans le cas du vieillissement d’une huile, cette oxydation peut être réalisée par certaines bactéries. D’autre part, la réduction de la double liaison peut être réalisée par certains microorganismes ou avec le temps et conduire ainsi à l’acide palmitique C 16 :0.

Formation des dihydroxyacides

Ces diols sont formés à partir de la dihydroxylation des doubles liaisons au sein des acides gras insaturés. En milieu archéologique, il est également possible que les diols subissent une déshydratation afin de former un hydroxyacide (Régert et al. 1998).
Au vu de toutes ces dégradations, très peu d’acides gras insaturés vont être rencontrés en milieu archéologique. Ainsi, il sera délicat de conclure quant à la nature du corps gras utilisé.

Autres marqueurs : les stérols

Au sein d’une huile ou d’une graisse, sont présents en minorité d’autres composés que les acides gras : les stérols. Ces molécules dérivent de triterpènes et sont caractéristiques des huiles végétales ou des graisses animales.
Pour les huiles végétales, deux stérols peuvent être rencontrés, le campestérol (Fig. 10) et le sitostérol (Fig. 11) (Hooykaas, Hall, et Libenga 1999).
Pour les graisses animales, le stérol caractéristique est le cholestérol (Fig. 12). Il est à noter que la présence de cholestérol au sein d’un baume de momie peut également être due à celui issu de l’individu.

La cire d’abeille

La cire d’abeille est une substance sécrétée par les abeilles qui l’utilisent pour construire les rayons de leur ruche afin d’y stocker le miel, le pollen et leur couvain. Elle est utilisée depuis l’Antiquité dans de nombreux domaines pour ses propriétés antibactérienne et hydrophobe mais également comme adhésif, par exemple dans des mosaïques de décoration (Duce et al. 2015), comme liant pictural (Peris-Vicente et al. 2006) mais également dans la formulation de baumes de momification (Buckley, Clark, et Evershed 2004; Buckley et Evershed 2001; Colombini et al. 2002; Evershed et al. 2003; Łucejko et al. 2012; Tchapla et al. 1999). La cire d’abeille avait également un caractère sacré pour les Egyptiens. En effet, selon eux, les abeilles naquirent des larmes du dieu Rê (Posener 1959).
Chimiquement, cette substance est composée de diverses familles de composés, des n-alcanes saturés impairs, des esters d’acide gras, de diesters et des acides gras libres (Régert et al. 2001; Régert, Langlois, et Colinart 2005; Čížová et al. 2019; Evershed et al. 2003). Les esters sont des esters de l’acide palmitique avec des alcools à longue chaine carbonée paire (C22 à C34).
Sur des échantillons archéologiques la cire d’abeille peut être hydrolysée et ainsi donner de l’acide palmitique C 16 :0 et des alcools à longue chaîne. Ces alcools avec le temps vont s’oxyder et former des acides gras (Fig. 13). Dans le tableau 2 sont représentés les acides gras caractéristiques qui vont permettre l’identification de la cire d’abeille au sein d’un échantillon archéologique.

Echantillonnage

Tous les échantillons étudiés ont été prélevés en accord avec la norme européenne EN 16085 :2012, Conservation des biens culturels – Méthodologie d’échantillonnage des matériaux – Règles générales. Une quantité minimale d’échantillon a ainsi été récupérée (de l’ordre du mg) puis placée dans du papier aluminium afin d’éviter toute éventuelle contamination due notamment aux phtalates des matières plastiques.

Observation macroscopique et microscopique des échantillons

Dans une première étape, tous les échantillons ont été observés sous loupe binoculaire puis sous microscope optique à lumière polarisée (microscope polariseur analyseur) dans le but de vérifier leur caractère homogène ou hétérogène. Le microscope optique permet également de discriminer la présence de composés organiques et/ou inorganiques à l’aide de la lumière polarisée. Plus précisément, il va permettre de déterminer l’isotropie ou l’anisotropie du matériau. Un matériau isotrope est un matériau dont les propriétés sont identiques quelle que soit la direction d’observation et inversement pour un matériau anisotrope.

Traitement des échantillons

Une description des divers protocoles de traitement des échantillons employés in fine est présentée ici. Certains d’entre eux ont été optimisés et/ou élaborés dans le cadre de ces travaux de recherche ; le détail de leur mise au point est présenté dans la suite de ce manuscrit.

Extraction au dichlorométhane

10 mg d’échantillon sont extraits avec 1 mL de DCM aux ultrasons pendant 10 min puis centrifugés à 6000 rpm pendant 10 min. Le surnageant est mis de côté pour extraire de nouveau le culot solide. Cette étape est répétée 2 fois. Les trois fractions ainsi recueillies sont ensuite rassemblées et évaporées à sec sous flux d’azote. Après avoir subi une réaction de triméthylsilylation, le mélange est de nouveau évaporé à sec sous flux d’azote puis dissout dans 0,2 à 1 mL d’un mélange hexane/DCM (1/1 ; v/v) et filtré sur cartouche de polytétrafluoroéthylène (PTFE ; 0,45 μm ; VWR). 1 μL de la solution est injecté en CPG-SM.

Extraction en Phase Solide (SPE)

10 mg d’échantillon sont extraits avec 1 mL d’hexane/THF (1/1 ; v/v) aux ultrasons pendant 5 min puis centrifugés à 6000 rpm pendant 5 min. Le surnageant est mis de côté pour extraire de nouveau le culot solide, ces étapes sont réalisées 3 fois. Les trois fractions sont rassemblées et évaporées à sec sous flux d’azote, puis reprises dans 500 µL hexane/THF (1/1 ; v/v). Cette solution est appelée la charge.
En parallèle, une cartouche SPE Strata®NH2, 200 mg/3 mL (Phenomenex) est conditionnée avec 4 mL d’hexane. La charge est déposée sur la cartouche, puis une première élution est réalisée avec 4 mL d’hexane et récoltée dans un tube à hémolyse (fraction 1). Une deuxième élution est réalisée avec 4 mL d’EtOH puis récoltée dans un autre tube (fraction 2). Enfin une dernière élution est effectuée avec 4 mL de DEE et AcOH à 2% (fraction 3). Chaque fraction est évaporée à sec sous flux d’azote.
Après triméthylsilylation, les fractions 1 et 2 sont reprises avec 60 µL d’un mélange hexane/ DCM (2/1 ; v/v) tandis que la fraction 3 est reprise dans 1,5 mL d’hexane/DCM (2/1 ; v/v). Les trois fractions filtrées sur cartouche de PTFE (0,45 µm) avant injections respectives en CPG-SM.

Saponification

10 mg d’échantillon sont extraits avec 1 mL de THF aux ultrasons pendant 5 min puis centrifugés à 6000 rpm pendant 5 min. Le surnageant est mis de côté pour extraire de nouveau le culot solide. Cette étape est répétée 2 fois.
Les trois fractions sont alors rassemblées dans un ballon de 25 mL et 2 mL d’une solution de KOH 10% dans MeOH/H2O (9/1 ; v/v) sont ajoutés. Le mélange est mis sous agitation magnétique et chauffé à 65°C pendant 1 heure. Après refroidissement à température ambiante suivi d’une évaporation aux 2/3 de la solution, 3 mL d’eau bidistillée sont ajoutés ainsi que 1 mL d’HCl 5M. Une extraction liquide/liquide de la phase aqueuse est réalisée trois fois avec 5 mL de DEE. La phase organique est récupérée et séchée avec du sulfate de sodium anhydre, puis filtrée sur papier filtre. La solution est alors évaporée à sec sous flux d’azote, triméthylsilylée, reprise dans 1 mL d’hexane/DCM (2/1 ; v/v), filtrée sur cartouche de PTFE (0,45 µm) et injectée en CPG-SM.

Extraction spécifique des résines diterpéniques

10 mg d’échantillon sont extraits avec 1 mL de DCM/acétone (2/1, v/v) aux ultrasons pendant 5 min puis filtrés (cartouche PTFE 0,45 μm, VWR). 1 mL de DCM et 1 mL de KOH (0,5M) sont ajoutés et le mélange est centrifugé à 6000 rpm pendant 15 min. Après séparation des deux phases, seule la fraction organique est conservée à laquelle est ajouté 1 mL de KOH (0,5M), puis centrifugée à 6000 rpm pendant 15 min. Après séparation des deux phases, la phase aqueuse est acidifiée et est extraite avec du DCM, la phase organique est séchée avec du sulfate de sodium anhydre puis filtrée sur cartouche PTFE (0,45 μm). La solution est alors évaporée à sec sous flux d’azote, triméthylsilylée et injectée en CPG-SM.

Techniques analytiques

Plusieurs outils d’analyse ont été utilisés afin d’étudier les baumes de momies. La spectroscopie Infrarouge à Transformée de Fourier (IR-TF) a d’abord été employée afin de caractériser la présence de composés organiques et/ou inorganiques. La fraction organique a été ensuite analysée en Chromatographie en Phase Gazeuse couplée à la Spectrométrie de Masse (CPG-SM).

Table des matières

Chapitre 1. Généralités sur l’Egypte antique et les divers matériaux utilisés dans la formulation de baumes 
1. L’Egypte ancienne et les pratiques de momification
1.1. Les croyances et les rituels
1.2. Les pratiques de momification à travers la chronologie
2. Etat de l’art : analyse des baumes
3. Matériaux principalement utilisés dans la formulation de baumes
3.1. Les huiles végétales et les graisses animales : composition chimique et dégradation
3.1.1. Les triglycérides et les acides gras
3.1.2. Dégradation des acides gras libres
3.1.2.2. La β oxydation
3.1.2.3. Formation des dihydroxyacides
3.1.3. Autres marqueurs : les stérols
3.2. La cire d’abeille
3.3. Les résines
3.3.1. Résines diterpéniques
3.3.1.1. Chimie des diterpènes
3.3.1.2. Dégradation des abiétanes
3.3.2. Résines triterpéniques
3.3.2.1. Chimie des triterpènes
3.4. Le bitume
3.5. Les gommes et polysaccharides
3.6. Autres
3.7. Résumé
Chapitre 2. Présentation des échantillons archéologiques 
Chapitre 3. Méthodologie, démarche expérimentale et techniques 
1. Echantillonnage
2. Observation macroscopique et microscopique des échantillons
3. Traitement des échantillons
3.1. Réactifs et solvants
3.3. Protocoles expérimentaux
3.3.1. Formation de dérivés triméthylsilylés
3.3.2. Ultrasons
3.3.3. Extraction au dichlorométhane
3.3.4. Extraction en Phase Solide (SPE)
3.3.5. Saponification
3.3.6. Extraction spécifique des résines diterpéniques
4. Techniques analytiques
4.1. Infrarouge à transformée de Fourier
4.1.1. Principe de l’infrarouge
4.1.2. Appareillages
4.1.3. Acquisition des données
4.1.3.1. Mode transmission avec pastilles de KBr
4.1.3.2. Mode transmission avec micro-compression diamant et mapping
4.1.3.3. Réflectance totale atténuée (ATR)
4.2. Extraction en phase solide (Solid Phase Extraction, angl., SPE)
4.3. Chromatographie en Phase gazeuse couplée à la Spectrométrie de Masse
4.3.1. Principe de la chromatographie en phase gazeuse
4.3.2. Principe de la spectrométrie de masse
4.3.3. Appareillage
4.3.4. Gradient de température
4.3.4.1. Pour le protocole d’extraction globale et saponification
4.3.4.2. Pour le protocole d’extraction spécifique par SPE
Chapitre 4. Observation et analyses spectroscopiques par IR-TF et traitements statistiques des données 
1. Observation macroscopique des échantillons archéologiques
2. Traitement des échantillons amorphes par IR-TF
2.1. Choix du module et du détecteur adéquat
2.2. Etude des substances naturelles contemporaines par IR-TF
2.2.1. Caractérisation des corps gras
2.2.2. Caractérisation de la cire d’abeille
2.2.3. Caractérisation des résines
2.2.4. Caractérisation du bitume
2.2.5. Caractérisation de la gomme arabique
2.2.6. Récapitulatif des bandes de chaque substance
2.3. Application aux échantillons archéologiques
2.3.1. Classification Ascendante Hiérarchique
2.3.2. Clusters et spectres infrarouge
2.3.2.1. Analyse du cluster 1
2.3.2.2. Analyse du cluster 2
2.3.2.3. Analyse du cluster 3
2.3.2.4. Analyse du cluster 4
2.3.2.5. Analyse du cluster 5
2.3.3. Analyse en Composantes Principales (ACP)
3. Traitement des échantillons d’aspect sableux
3.1. Observation par microscopie optique à lumière polarisée
3.2. Analyse par IR-TF par micro-compression diamant
4. Conclusion de l’étude spectroscopique
Chapitre 5. Etude par chromatographie en phase gazeuse couplée à un spectromètre de masse 
1. Etude des substances naturelles contemporaines
1.1. Caractérisation des corps gras
1.2. Caractérisation de la cire d’abeille
1.3. Caractérisation des résines
1.3.1. Résine diterpénique
1.3.2. Résine triterpénique
1.4. Caractérisation du bitume
2. Application aux échantillons archéologiques : approche conventionnelle
2.1. Résultats : Composés identifiés par CPG-SM
2.1.1. Composés identifiés dans les échantillons du cluster 1
2.1.2. Composés identifiés dans les échantillons du cluster 2
2.1.3. Composés identifiés dans les échantillons du cluster 3
2.1.4. Composés identifiés dans les échantillons du cluster 4
2.1.5. Composés identifiés dans les échantillons du cluster 5
2.2. Discussion : apport de la chromatographie gazeuse
2.2.1. Corps gras
2.2.2. Cire d’abeille
2.2.3. Résines et dégradation des diterpènes : utilisation de traitements statistiques de données
2.2.4. Bitume
2.2.5. HAP
2.3. Conclusion de l’approche conventionnelle
3. Développement analytique d’un protocole d’extraction en phase solide
3.1. Mise au point du protocole par Extraction en Phase Solide (SPE)
3.1.1. Choix de la cartouche
3.1.2. Choix du solvant d’extraction
3.1.3. Choix des solvants d’élution
3.1.4. Théorie de l’élution des différents composés
3.2. Application du protocole de SPE sur les échantillons archéologiques
3.2.1. Fraction 1
3.2.2. Fraction 2
3.3. Comparaison de l’extraction conventionnelle à la SPE
3.4. Conclusion de l’extraction par SPE
4. Conclusion de l’étude chromatographique
Conclusion générale et perspectives
Bibliographie 

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