Soutenance mémoire
Anatomie
La glande thyroïde est la plus vascularisée des glandes endocrines chez l’homme. Située dans la partie inférieure du cou devant la trachée et sous le larynx, elle est constituée de deux lobes latéraux verticaux reliés entre eux par une bande de tissu appelée isthme thyroïdien (Figure 1). Elle est organisée pour l’essentiel en follicules. Les follicules sont des structures sphériques constituées d’une monocouche de cellules épithéliales appelées thyrocytes et d’une cavité contenant une substance visqueuse appelée colloïde. Les thyrocytes représentent l’unité morpho-fonctionnelle de la thyroïde et sont responsables à la fois de l’accumulation d’iodures et de la production de colloïde dont le constituant majeur est la thyroglobuline (Tg). Ces cellules sont nettement polarisées : leur membrane basale, en contact avec la circulation sanguine, est le siège du transport des iodurestandis que la membrane apicale, orientée vers la colloïde, est celui de la synthèse des hormones thyroïdiennes. La polarité des thyrocytes s’observe également dans l’organisation de leurs organites intracellulaires, le noyau étant situé dans la partie basolatérale et l’appareil de Golgi dans la partie apicale. La glande thyroïde compte par ailleurs une minorité de cellules parafolliculaires C produisant une hormone impliquée dans l’homéostasie du calcium, la calcitonine.
Etudes cinétiques et électrophysiologiques
L’analyse cinétique du transport a été réalisée par suivi de l’accumulation d’125I- dans des cellules FRTL-5 qui transportent les iodures sans les organifier. Cette analyse montre une augmentation rapide de la concentration intracellulaire en iodures, suivie d’un ralentissement et de l’atteinte d’un plateau. Ce plateau résulte de l’équilibre qui se met en place entre les vitesses d’influx et d’efflux des ions iodures à travers la membrane basolatérale. L’efflux étant négligeable dans les premières minutes d’accumulation, la vitesse initiale de capture des iodures est linéaire et la constante de Michaelis (Km) a donc pu être déterminée. Elle a été estimée à 30 µM dans des cellules FRTL-522 et à 31 µM dans des tissus thyroïdiens. L’électrogénicité du symport a d’abord été observée sur vésicules membranaires, la génération d’un potentiel membranaire négatif étant capable à elle seule d’engendrer une activité de transport23. La dépendance au sodium suivant une sigmoïde avec un coefficient de Hill égal à 1,6, il a été suggéré qu’au moins 2 ions Na+ étaient transportés pour un ion I-. Des études électrophysiologiques réalisées par la suite ont montré que le transport d’iodures génère un influx net de charges positives, confirmant ainsi la nature électrogénique du symport. Elles ont aussi permis de confirmer la stœchiométrie du transport, à savoir 2 Na+ pour un I-, et d’estimer les constantes d’affinité apparentes du NIS pour I- et Na+ à 33 µM et 28 mM, respectivement24. Les expériences d’électrophysiologie ont montré par ailleurs que les ions sodium pouvaient à eux seuls générer un courant. La capture de sodium en l’absence d’iodures ayant été confirmée par l’utilisation de 22Na+ et le coefficient de Hill pour l’activation des courants par le sodium étant de 1, il a été suggéré qu’en absence d’iodures le NIS se comporte comme un uniporteur de sodium. Ces études ont enfin rapporté des translocations de charge dans la membrane attribuables à des changements de conformation du transporteur. Etant donné que les potentiels auxquels les mouvements de charge ont lieu sont fonction de la concentration en sodium, il a été proposé que la fixation du sodium puisse conduire le symporteur à changer deconformation. L’ensemble de ces résultats combiné à l’étude des paramètres influençant les constantes d’affinité du sodium et des iodures pour le symporteur ont permis de proposer le modèle de symport suivant (Figure 4) :- les deux ions Na+ se fixent en premier sur le symporteur. Ils induisent un changement de conformation qui positionne le site de liaison d’I- hors du champ électrique membranaire et qui permet à cet anion de se fixer- un nouveau changement conformationnel permet la translocation simultanée de l’anion I- et des deux cations Na+ au travers de la membrane- les trois ions sont ensuite libérés à l’intérieur de la cellule puis le transporteur change à nouveau de conformation pour retrouver sa position initiale. Le turnover du NIS a été estimé à 22 s-1 en mode uniport et à 36 s-1 en mode symport. Ce modèle, bien qu’accepté par la communauté scientifique, n’est pas encore fermement établi ; le site de fixation de l’iodure n’est toujours pas connu et celui du sodium n’est pas encore totalement caractérisé. Plusieurs autres anions se sont révélés capables de générer des courants entrants (ClO3->SCN->> SeCN-≥ NO3->> Br-> BF4-> IO4->> SO42- ≥ F-) ou de bloquer les courants induits par les iodures sans générer pour autant de courant par eux-mêmes (ClO4-, ReO4-). Une étude cinétique a permis de définir certains critères de sélectivité du transporteur pour ces anions, à savoir la monovalence, la taille (plus le volume des anions est important, plus leur affinité pour le transporteur est forte) et la géométrie (affinité moindre des anions linéaires (SCN-,ClO3-) par rapport aux anions tétraédriques (ClO4-, ReO4-, TcO4-) ou hexaédriques (PF6-,AsF6-)). Le transport du ClO4- par le NIS a fait l’objet de nombreuses controverses24,26, mais il semblerait finalement qu’une stœchiométrie Na+: ClO4- de 1 : 1 soit à l’origine de l’absence de courants en présence de perchlorate.
Régulation de l’activité
Si la TSH régule la transcription du symporteur, elle en module également la fonction. L’étude de la corrélation entre la présence du symporteur et la présence d’une activité de capture a montré qu’après 5 jours de privation en TSH, les cellules ne possèdent plus aucune activité de transport alors que 30 % des protéines NIS sont encore présentes14. Des vésicules membranaires produites à partir des organites intracellulaires de ces cellules se sont avérées capables de transporter les iodures : l’absence de TSH conduit donc à l’internalisation du transporteur. Le NIS possédant plusieurs sites potentiellement phosphorylables, il a été suggéré que la TSH pourrait contrôler la localisation subcellulaire du NIS via la phosphorylation. Cela est d’autant plus probable que la phosphorylation du NIS in vivo est confirmée et que les motifs de phosphorylation sont différents selon que la TSH soit présente ou non67. D’après une étude récente utilisant la mutagénèse dirigée, la phosphorylation des sérines 43 et 581 modifierait lavitesse du transport et celle de la thréonine 49 pourrait affecter la stabilité de la protéine. Aucun des mutants produits n’a cependant conduit à une localisation membranaire diminuée. Il est néanmoins précisé dans cette étude que les résidus phosphorylés étudiés ont été observés en l’absence de stimulations et après expression du NIS dans des cellules HEK. Il se peut donc que dans d’autres conditions d’autres résidus phosphorylés soient découverts et que ces phosphorylations aient d’autres implications fonctionnelles. De nombreuses questions restent donc ouvertes sur les mécanismes qui conduisent à la phosphorylation du NIS et sur l’implication fonctionnelle de cette phosphorylation pour la protéine. En dehors des sites de phosphorylation, l’extrémité C-terminale du transporteur compte trois éléments susceptibles d’être impliqués dans l’adressage, le maintien à la membrane ou l’internalisation du NIS28 :
• une séquence cible PDZ connue pour permettre l’interaction avec des protéines contenant une séquence PDZ et pouvant empêcher l’internalisation du transporteur
• un motif dileucine responsable à la fois de l’internalisation de certaines protéines membranaires et du tri intracellulaire de ces protéines
• des motifs dipeptidiques acides pouvant fonctionner comme des signaux de récupération ou de rétention des protéines localisées à la membrane
Ces éléments ont néanmoins été très peu étudiés pour l’instant et leur fonction réelle reste inconnue.
Exposition prolongée aux isotopes radioactifs de l’iodure
Le transport d’iodures peut devenir particulièrement problématique lors d’accidents nucléaires tels que ceux de Tchernobyl (1986) et de Fukushima (2011) ou à la suite d’explosions d’armes nucléaires comme à Nagasaki et Hiroshima (1945). La capacité de la glande thyroïde à transporter l’iodure permet à différents radio-isotopes de l’iodure de s’accumuler dans cette glande et d’y être stockés pendant plusieurs jours, ce qui augmente sensiblement le risque de cancer thyroïdien. Suite à l’accident de Tchernobyl, environ 5 millions de russes, d’ukrainiens et de biélorusses ont été exposés à la fois à des radiations externes provenant d’espèces radioactives retombées sur le sol et à des radiations internes provenant de l’ingestion de lait ou de légumes contaminés par de l’iodure 13176. Les enfants et les adolescents ont été les plus touchés, leur glande thyroïde transportant davantage d’iodures que celle des adultes. On estime qu’entre 1986 et 2002, environ 4 000 cas de cancers thyroïdiens ont été diagnostiqués chez des adolescents de moins de 15 ans dans ces trois pays. La meilleure solution à ce jour pour éviter une contamination par des isotopes radioactifs de l’iodure est l’ingestion de pastilles d’iodure de potassium. Le but à court terme est d’empêcher le transport des isotopes radioactifs par compétition. A un terme un peu plus long, la prise de pastilles d’iodure permet d’inhiber transitoirement l’organification de l’iodure (induction de l’« effet Wolff-Chaikoff », cf. 1.1.2.c) i) ce qui permet d’empêcher le stockage des isotopes radioactifs dans la colloïde. Il a néanmoins été observé que la prise de fortes doses de KI pouvait déclencher chez certaines personnes une hypothyroïdie irréversible. Une meilleure compréhension des mécanismes moléculaires contrôlant le transport d’iodures permettrait sans doute de trouver des solutions complémentaires ou alternatives aux pastilles d’iodure. Ces solutions pourraient aussi se révéler intéressantes pour compléter la protection des personnels médicaux qui manipulent fréquemment de faibles concentrations d’isotopes radioactifs transportés par le NIS tels que le 99Tc, l’125I- ou l’131I-.
La chémogénomique : définition
Les années 1990 ont vu se multiplier les projets de séquençage de génomes entiers (virus, bactéries, plantes, mammifères…)83. Ces projets ont mis à jour de nombreux gènes dont la fonction reste encore inconnue. Le défi consiste donc à relier l’ensemble de ces gènes à une ou plusieurs fonctions et à comprendre ce que chacun de ces gènes implique pour l’organisme. Une méthode classiquement utilisée pour répondre à cette question est d’introduire des mutations, ciblées ou aléatoires, et de relier le phénotype induit par ces mutations aux gènes mutés. Il existe cependant différents cas où la génétique conventionnelle ne permet pas d’obtenir les réponses escomptées :
• présence de duplicatas dans le génome permettant la mise en place de mécanismes de compensation pour pallier l’invalidité du gène muté
• aucun effet visible du fait des conditions expérimentales choisies
• mutation létale ne permettant pas de déterminer la fonction du gène muté
• difficulté à manipuler génétiquement certains organismes (faible efficacité de transfection ou de recombinaison homologue, absence de la machinerie nécessaire à l’utilisation de SiRNAs…)
La chémogénomique est une approche multidisciplinaire qui peut être utilisée en complément de la génétique84. Egalement appelée génétique chimique, elle consiste à perturber les systèmes biologiques, non pas par des mutations, mais au moyen de petites molécules organiques qui ciblent le produit des gènes, à savoir les protéines. L’utilisation de petites molécules présente divers avantages : leur action est rapide et contrôlable dans le temps ce qui évite la mise en place de processus de compensation et permet la manipulation de protéines même si elles sont indispensables au développement du sujet d’étude. Elles sont en outre faciles à manipuler, utilisables dans des cas où des mutations ne peuvent être envisagées et peuvent servir à la fois à la compréhension du fonctionnement d’un processus biologique et comme point de départ au développement de médicaments. Comme en génétique, il existe deux manières de procéder pour explorer les fonctions biologiques : la méthode directe et la méthode inverse (Figure 8)85. En génétique chimique directe, des chimiothèques de composés sont criblées sur des cellules, des tissus ou des extraits afin d’identifier des molécules capables d’induire un phénotype donné. Les protéines cibles des molécules sélectionnées sont ensuite identifiées par différentes techniques génomiques ou biochimiques. Ce type d’approche a permis de découvrir, entre autres, la cyclooxygénase, une enzyme inhibée par l’aspirine qui s’est révélée être responsable de la synthèse des prostaglandines et des thromboxanes86. Quant à la génétique chimique inverse, elle consiste à rechercher des molécules capables d’interagir avec une protéine isolée et de moduler son fonctionnement85. Les composés sélectionnés sont ensuite mis en présence de cellules ou de tissus pour observer le phénotype qui se développe lorsque l’activité de la protéine est perturbée et en déduire le rôle de la protéine dans une voie ou un processus biologique donné. Des molécules spécifiques de différentes isoformes de phosphoinositide 3-kinases ont ainsi permis d’élucider les rôles respectifs de ces isoformes dans la signalisation de l’insuline87. Afin d’identifier des acteurs de la régulation du symporteur sodium/iode, notre laboratoire a mis en place une stratégie de génétique chimique directe qui a conduit à l’identification de 10 molécules capables d’inhiber le transport d’iodures88. Il s’agit donc maintenant d’isoler et d’identifier les protéines cibles de ces composés. L’identification des cibles biologiques d’un composé présente un grand nombre d’intérêts à la fois pour le milieu académique et pour l’industrie pharmaceutique : compréhension du mécanisme d’action de la molécule, compréhension du mécanisme biologique sur lequel le composé agit, anticipation des effets secondaires, découverte de potentiels thérapeutiques inattendus… Malgré les avancées technologiques, elle reste cependant un défi de taille avec de nombreux obstacles à surmonter et un grand nombre d’approches différentes ont été développées pour relever ce défi. Les techniques décrites ci-après font partie des plus couramment utilisées.
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Table des matières
Introduction
Chapitre 1 : Rapport bibliographique
1.1. le transport d’iode
1.1.1. La thyroïde : généralités
1.1.1.a) Anatomie
1.1.1.b) Fonction
1.1.2. Le symporteur Na+/I-: un élément clé du transport d’iode
1.1.2.a) Clonage et caractérisation structurale
1.1.2.b) Caractérisation fonctionnelle
i. Etudes cinétiques et électrophysiologiques
ii. Mutagénèse : indices sur la relation structure-fonction
1.1.2.c) Régulation de l’expression
i. TSH, iodure et thyroglobuline
ii. Activité transcriptionnelle
iii. Voies de transduction du signal
iv. Autres facteurs
1.1.2.d) Régulation de l’activité
1.1.2.e) NIS extrathyroïdiens
1.1.3. Transport d’iode : implications cliniques
1.1.3.a) Pathologies non cancéreuses de la thyroïde
i. Hypothyroïdisme congénital et hyperthyroïdie
ii. Maladies auto-immunes
1.1.3.b) Exposition prolongée aux isotopes radioactifs de l’iodure
1.1.3.c) Cancers
i. Cancers de la thyroïde et du sein
ii. Thérapie anticancéreuse par transfert génique
1.1.4. Conclusion
1.2. La chémogénomique
1.2.1. La chémogénomique : définition
1.2.2. Identification des cibles biologiques d’un composé organique
1.2.2.a) Identification par déduction
1.2.2.b) Méthodes génomiques et protéomiques
i. Mutations et modulations d’expression
ii. Profilages transcriptionnel et protéomique
iii. Méthodes basées sur l’affinité du composé pour sa cible
1.2.2.c) Méthodes biochimiques
i. La chromatographie d’affinité
ii. Les sondes fonctionnalisées
Sondes biotinylées
Sondes fluorescentes et radioactives
Sondes électrophiles
Sondes photoactivables
1.2.3. Conclusion
Chapitre 2 : Objectif, intérêts et stratégie envisagée
2.1. Objectif et intérêts
2.2. Stratégie envisagée
Chapitre 3 : A la recherche de la protéine cible de l’inhibiteur ITB5
3.1. Etude de la relation structure-activité de la molécule
3.1.a) Mise au point d’un test biologique non radioactif
i. Sélection d’une méthode de dosage de l’iodure adaptable à la mesure d’IC50
ii. Optimisation du protocole de dosage
Objectifs
Température, temps de réaction, concentrations de cérium et d’arsenic
Présence de détergents
Reproductibilité de la méthode
Influence de solvants organiques sur la reproductibilité
Influence de l’ordre d’addition du cérium et de l’arsenic
Conclusion
iii. Mise au point d’un test cellulaire robuste
Définition du facteur Z’
Principe du test cellulaire
Détermination du facteur Z’
iv. Evaluation de la fiabilité du test
v. Conclusion
3.1.b) Synthèse d’analogues
i. Obtention d’analogues par synthèse parallèle
ii. Synthèses individuelles
3.1.c) Evaluation de l’activité biologique des 184 analogues
i. Déroulement du criblage
ii. Résultats et analyse SAR
3.1.d) Conclusion
3.2. Synthèse d’une sonde biotinylée photoactivable et évaluation de son activité
3.2.a) Conception de la sonde et stratégie de synthèse
3.2.b) Synthèse du groupement photoactivable 22
3.2.c) Synthèse du bras biotinylé 24
3.2.d) Synthèse de la sonde ITB5-P1
i. Introduction d’une fonction amine sur ITB5 par alkylation
ii. Ajout du groupement photoactivable par amination réductrice
iii. Ajout du bras biotinylé par couplage peptidique
3.2.e) Evaluation de l’activité de la sonde et de ses intermédiaires réactionnels
3.3. Photomarquage de la protéine cible
3.3.a) Optimisations préliminaires
i. Culture cellulaire et protocole de lyse
ii. Quantité de protéines à déposer sur gel SDS-PAGE
iii. Quantité de Streptavidine-HRP à utiliser en Western-blot
3.3.b) Optimisation des conditions de photomarquage
i. Concentration de sonde
ii. Temps d’irradiation et expériences de compétition
3.3.c) Tentative de photomarquage sur lysats
3.3.d) Conclusion
3.4. Isolement de la protéine photomarquée
3.4.a) Premier essai de capture sur billes de la protéine photomarquée
3.4.b) Augmentation du rapport protéine spécifique / protéines non spécifiques
i. Contrôle de la stabilité de la protéine
ii. Contrôle de la capture
iii. Préincubation du lysat avec des billes d’agarose-Streptavidine
iv. Comparaison de différents types de billes
v. Optimisation des lavages et des conditions d’élution
3.4.c) Obtention d’un gel analysable en spectrométrie de masse
3.5. Identification de la protéine photomarquée
3.5.a) Première tentative d’identification
3.5.c) Expériences visant à augmenter la quantité de matériel analysable en masse
i. Contrôle des lavages
ii. Recherche de conditions d’élution plus efficaces
Trypsinolyse sur billes
Test de différentes solutions d’élution
iii. Test d’une coloration argentique plus compatible avec les analyses de masse
iii. Utilisation de nouvelles sondes
Synthèse d’une sonde desthiobiotinylée ITB5-P2
Synthèse d’une sonde clivable ITB5-P3
Evaluation de l’activité biologique des nouvelles sondes
Expériences de photomarquage
Expériences de capture sur billes
iv. Exploitation de la sonde desthiobiotinylée
Multiplication par 4 des quantités de protéines
Obtention d’un gel coloré au bleu de Coomassie
3.5.d) Identification de la protéine cible
3.5.e) Discussion
3.6. Conclusion du chapitre 3
Chapitre 4 : Travaux initiés sur le composé ITB2
4.1. Synthèse d’une sonde biotinylée photoactivable et évaluation de son activité
i. Conception de la sonde
ii. Synthèse de la sonde et évaluation de son activité biologique
4.2. Expériences de photomarquage
i. Test d’une gamme de concentration de sonde
ii. Test de différentes durées d’irradiation et expériences de compétition
4.3. Tentative de capture sur billes
4.4. Conclusion du chapitre 4
Conclusion générale
Partie expérimentale
Synthèse organique
Biologie, biochimie et spectrométrie de masse
Annexes
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