Etude du Système de Sécrétion de Type III S P I-1

Etude du Système de Sécrétion de Type III S P I-1

Etat de l’art sur l’étude de la pathogénie de Xanthomonas albilineans

X. albilineans est une bactérie peu étudiée et nous ne disposons que de peu d’éléments sur les bases moléculaires sa pathogénie. Bien que la manipulation de sa plante hôte (la canne à sucre) soit difficile à cause notamment de sa taille et sa vitesse de croissance limitée, une série d’outils destinés à évaluer le pouvoir pathogène de différentes souches a été développée. Le séquençage récent du génome de la souche GPE PC73 (Pieretti et al. 2009) a ouvert de nouvelles perspectives de recherche afin d’accroître nos connaissances sur cette bactérie. Une synthèse des résultats obtenus ces dernières années est présentée ci-après.

Méthodologie

Des outils adaptés à la mesure de la production d’albicidine in vitro et de la colonisation de la tige de canne à sucre ont été développés au sein de l’équipe.

La mesure de la production d’albicidine

Des bioessais utilisant la souche DH5a d’E. coli permettent d’évaluer la production d’albicidine in vitro. Ces bioessais consistent à faire croître pendant cinq à sept jours une culture circulaire de la souche de X. albilineans à tester au centre d’une boîte de milieu Wilbrink sans antibiotique afin que l’albicidine produite se diffuse dans le milieu. Au terme de cette période de croissance, un « top agar » (surcouche d’agar noble) contenant la souche rapportrice d E.  d’albicidine réalisés in vitro et
basés sur la capacité de l’albicidine à inhiber la croissance à’Escherichia coli. A gauche une souche de Xanthomonas albilineans productrice d’albicidine (Tox+) et à droite un mutant non producteur .

SYNTHESE BI BLIOGRAPHIQUE

Mesure du pouvoir pathogène de Xanthomonas albilineans At Les inoculations de X albilineans sur canne à sucre sont réalisées par décapitation au niveau du troisième ochréa d’une tige ayant au moins 4-5 entre-nœuds. La décapitation est immédiatement suivie du dépôt d’une solution bactérienne à 10 UFC/ml sur la partie sectionnée. Les symptômes sont observés sur les feuilles inoculées un mois après inoculation. La colonisation des feuilles ou de la tige de la canne à sucre par X. albilineans est évaluée deux mois après inoculation.

La mesure de l’intensité des symptôm es foliaires

La mesure de l’intensité des symptômes foliaires permet également d’évaluer le pouvoir pathogène d’une souche. L’observation des symptômes est réalisée environ un mois après l’inoculation sur les
feuilles inoculées (Figure 29) et les feuilles non inoculées. Des lignes blanches provoquées par l’albicidine, des nécroses ou un dessèchement de la feuille sont communément observés (Figure 29). Des symptômes similaires à des lignes blanches peuvent être observés sur les feuilles de plantes inoculées avec des souches non  Plus le pouvoir pathogène de la souche inoculée sera important, plus les symptômes seront visibles et sévères. Cette sévérité de la maladie sera estimée à l’aide du nombre de lignes blanches et de l’importance des nécroses. Néanmoins, la mesure des symptômes doit rester corrélée avec la mesure de la colonisation du xylème de la plante.

La mesure de la colonisation de la canne à sucre par Xanthomonas albilineans

Une des méthodes d’analyse consiste à réaliser des empreintes sur milieu sélectif de tous les entre-nœuds de la canne afin d’évaluer le niveau de colonisation par la bactérie. Cette méthode, bien que simple et rapide à mettre en place, ne permet cependant pas de mesurer de faibles variations dans la capacité à coloniser la tige. La mesure du nombre de bactéries par gramme de matière fraîche est plus longue à mettre en oeuvre mais elle est plus précise. Des prélèvements sont réalisés au niveau des feuilles inoculées, des feuilles non inoculées, ainsi qu’à différents niveaux de la tige (Figure 30). Les feuilles inoculées correspondent aux feuilles sectionnées lors de
décapitation de la plante et qui ont émergé par la suite du fuseau foliaire (Figure 30). Les feuilles non inoculées correspondent aux feuilles qui ont émergé après les feuilles inoculées (Figure 30). La présence ou l’absence de l’agent pathogène à différents points de prélèvement de la tige permet également d’évaluer la capacité de la bactérie à coloniser le xylème caulinaire. La bactérie atteint le xylème de la tige au niveau de la zone d’inoculation qui correspond aux derniers entre-nœuds en formation au moment de la décapitation de la plante. Lors de la décapitation, cette zone se situe juste à deux ou trois cm au dessus du méristème et correspond à la base des feuilles inoculées. A
partir de la zone d’inoculation, la bactérie va coloniser le xylème caulinaire soit en direction de l’apex (en suivant le flux de sève), soit en direction de la base de la tige (en se déplaçant contre le flux de sève). La présence de la bactérie dans une feuille non inoculée indique que la bactérie a colonisé le xylème d’une feuille inoculée, puis a réussi à passer du xylème foliaire au xylème caulinaire. Elle s’est ensuite multipliée dans le xylème caulinaire pour coloniser une feuille non inoculée.
Feuilles non inoculées (feuilles à l’extrémité intacte : ayant poussé après l’inoculation et qui n’ont pas été en contact direct avec 1’inoculum) Feuilles inoculées (feuilles en contact direct avec 1’inoculum) Zones de prélèvement dans la tige. La zone d’inoculation est indiquée en rouge. Afin de mesurer l’importance de la colonisation, on effectue également des prélèvements au dessus (exemple indiqué en bleu) et en dessous (exemple indiqué en orange) de cette zone d’inoculation. Les prélèvements sont broyés en milieu aqueux et étalés sur milieu sélectif contenant plusieurs antibiotiques et fongicides afin de n’isoler que X. albilineans. Après comptage, on estime le nombre de bactéries par gramme de matière fraîche. Ce type de mesures permet de détecter des faibles différences de colonisation entre deux souches.

La variabilité du pouvoir pathogène

L ’étude des deux composantes essentielles de la pathogénie de X. albilineans – l’induction des symptômes foliaires et la capacité de colonisation de la tige de carme à sucre – ont permis de mettre en évidence (i) l’existence de variants de sévérité de la maladie, sur la base de l’intensité des symptômes foliaires, et (ii) l’existence de variants de colonisation de la tige, basés sur l’importance des densités de populations bactériennes à différents niveaux de la tige de canne à sucre. Les recherches réalisées au CIRAD ont tenté de mettre en évidence une relation entre la variabilité du pouvoir pathogène et la variabilité génétique d’une part et la variabilité du pouvoir pathogène et la production d’albicidine d’autre part. Par ailleurs les variétés de canne à sucre présentent des niveaux de résistance différents à l’échaudure des feuilles. En conséquence, les recherches réalisées au CIRAD ont aussi été orientées vers la compréhension des mécanismes de résistance à l’échaudure des feuilles de la canne à sucre.

Relation entre variabilité du pouvoir pathogène et variabilité génétique de Xanthomonas albilineans

Deux approches ont été mises en oeuvre pour étudier la relation entre la variabilité du pouvoir pathogène et la variabilité génétique. La première a consisté à i comparer le pouvoir pathogène de souches de X. albilineans appartenant aux différents groupes génétiques caractérisés à l’aide de marqueurs moléculaires (groupes PFGE et RFLP, voir paragraphe 4.3.5). Cette approche n’a pas permis de mettre en évidence une telle relation (Tableau 1, Champoiseau et al. 2006a). La deuxième approche a consisté à comparer le pouvoir pathogène de souches génétiquement très proches (souches appartenant toutes au groupe ALB-RFLP-B2). Cette approche a permis d’identifier des souches génétiquement très proches mais dont le pouvoir pathogène est différent (Tableau 1). La variabilité génétique de ces souches a alors été étudiée à l’aide de nouveaux marqueurs moléculaires (AFLP et polymorphismes de gènes de pathogénie identifiés chez les autres Xanthomonas). Cependant, cette étude n’a pas non plus permis de mettre en évidence une relation entre la variabilité génétique et la variabilité du pouvoir pathogène au sein de ces souches appartenant au groupe ALBRFLP-B2 (Champoiseau et al. 2006b). Cette étude sera prochainement complétée par le séquençage du génome complet de ces souches (Projet en collaboration avec le Génoscope et l’UMR LIPM).

SYNTHESE BIBLIOGRAPHIQUE

Relation entre la variabilité du pouvoir pathogène et la production d’albicidine

L’albicidine étant un facteur de pathogénie important de X. albilineans, des travaux ont été menés pour étudier la relation entre la variabilité de la production d’albicidine in vitro et la variabilité du pouvoir pathogène. Cependant, aucune relation n’a pu être mise en évidence. La capacité des souches de X. albilineans à produire l’albicidine in vitro n’est donc pas liée à la capacité de ces souches à coloniser la tige de canne à sucre (Tableau 1 ; Champoiseau et al. 2006a). Ces travaux n’ont pas non plus mis en relation le niveau de production d’albicidine des souches et leur 100 appartenance à un groupe génétique précis (Tableau 1). Par ailleurs, aucune relation entre la variabilité génétique des gènes de biosynthèse de l’albicidine et la capacité des souches de X. albilineans à produire l’albicidine in vitro n ’a été mise en évidence (Renier et al. 2007).

Etude de la résistance de la canne à sucre à l’échaudure des feuilles

Les variétés de canne à sucre présentent des niveaux de résistance très différents à l’échaudure des feuilles. Des études ont été menées sur plusieurs couples variété de canne à sucre-souche de X albilineans (Mohamed, 1995; Rott et al. 1997). Trois souches de X. albilineans appartenant à des groupes génétiques différents (MTQ058,groupe PFGE-I ; HV0005, groupe PFGE-F et GPE5, groupe PFGE-B) ont été inoculées par la technique de décapitation sur six variétés de canne à sucre présentant différents niveaux de résistance à l’échaudure des feuilles. Les plantes ont été analysées trois mois après inoculation. Les souches MTQ058 et HV0005 semblent moins pathogènes que la souche GPE5 qui appartient au groupe PFGE B. L’indice de maladie observée pour la souche GPE5 est bien corrélé au niveau de résistance des variétés de canne à sucre. La taille des populations bactériennes de la souche GPE5 dans la partie supérieure de la tige et dans l’apex est également bien corrélée au niveau de résistance ou de sensibilité des variétés de canne à sucre (Figure 31). La résistance variétale semble donc liée à la capacité de X albilineans à coloniser les parties de la tige de canne à sucre qui se trouvent au-dessus du point d’inoculation dont l’apex (voir paragraphe 5.1.2.2, Figure 30). Les mécanismes de résistance à l’échaudure desfeuilles restent inconnus. Ils pourraient être liés à la morphologie du xylème caulinair  qui serait moins favorable à la multiplication de la bactérie chez les variétés résistantes. Des expériences de protéomique et de microarray ont été conduites dans le but d’identifier des protéines ou des gènes de la canne à sucre dont l’expression serait induite ou réprimée lors de l’infection parX albilineans (Dabbas et al. 2006; Garces et al. 2010). Cependant, à ce jour, aucun mécanisme moléculaire de résistance à l’échaudure des feuilles n’a été décrit.

Table des matières

Table des matières
Liste des figures
Liste des tableaux
Abréviations
Objectifs de la thèse
Chapitre 1. Synthèse bibliographique
1 Les bases moléculaires des interactions plante-bactérie
2 Modes de transmission et de dissémination des bactéries phytopathogènes
3 La colonisation du xylème par les bactéries phytopathogènes
4 Présentation du pathosystème canne à suerel Xanthomonas albilineans
5 Etat de l’art sur l’étude de la pathogénie de Xanthomonas albilineans
5.1 Méthodologie
Chapitre 2. Etude du Système de Sécrétion de Type III S P I-1
1…Introduction
2 Article
3 Conclusion et perspectives
Chapitre 3. Etude du rôle des gènes NRPS
1 Introduction
2 Article
3 Conclusion et perspectives
Chapitre 4. Discussion et perspectives
Références bibliographiques

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