Soutenance mémoire
Chez les vertébrés, les informations sont analysées, traitées par les neurones qui enregistrent et organisent les réponses à transmettre à l’ensemble du corps via leurs axones, sous forme d’impulsion électrique : les potentiels d’action. La myélinisation des axones, associée aux nœuds de Ranvier, petits domaines enrichis en canaux sodium voltage dépendants (Nav), assure une conduction saltatoire rapide de l’influx nerveux.
Myélinisation des neurones
Propagation des potentiels d’action
La propagation des potentiels d’action sur les fibres non myélinisées s’opère de proche en proche grâce aux canaux sodium voltage-dépendants (Nav) qui permettent l’entrée de courant dépolarisant sous la forme d’ions sodium Na+ (figure 1b). Ce courant dépolarisant va diffuser passivement de proche en proche le long de la membrane axonale alors que l’efflux d’ions potassium K+ par ouverture des canaux potassium voltage-dépendants (Kv) après le passage du potentiel d’action va inactiver les canaux Nav et lentement permettre la repolarisation de la membrane vers son potentiel de repos. Ces potentiels d’action sont ensuite intégrés au niveau des synapses formées dans la région somatodendritique avec les neurones cibles. Plusieurs paramètres biophysiques gouvernent la vitesse de propagation de l’influx nerveux : le diamètre axonal, la densité des canaux sodium et la température. Mais l’augmentation du diamètre axonal est restreinte par le squelette. La myéline, structure multilamellaire riche en lipides, jouant un rôle d’isolant, permet d’accélérer la vitesse de conduction d’un facteur 50 à 100 pour un axone de même diamètre. La myéline est présente de manière discontinue le long de l’axone, interrompue par des petits domaines enrichis en canaux sodium voltage dépendant (Nav), les nœuds de Ranvier. Ainsi, la présence de myéline restreint la dépolarisation de la membrane des axones seulement aux nœuds de Ranvier ce qui a pour conséquence une conduction rapide et saltatoire (du latin saltare, sauter) des potentiels d’action (Sherman and Brophy, 2005a; Susuki and Rasband, 2008) (figure 1a, 2b).
La gaine de myéline
La gaine de myéline fut initialement décrite par Virchow en 1854. L’apparition de la myéline il y a environ 420 millions d’années chez les poissons ayant une mâchoire est l’une des dernières étapes clés de l’évolution du système nerveux des vertébrés (Zalc et al., 2008). Elle est produite par les oligodendrocytes dans le système nerveux central (SNC) et par les cellules de Schwann dans le système nerveux périphérique (SNP) (Bunge et al., 1962; Del Rio-Hortega, 2012). Contrairement à la cellule de Schwann, un seul oligodendrocyte peut myéliniser plusieurs axones : dans le nerf optique par exemple, il myélinise 20 à 40 axones.
Propriétés
La myéline associée aux nœuds de Ranvier permet une augmentation de la vitesse de conduction des influx nerveux jusqu’à 100 fois plus importante comparée à celle des axones de même diamètre non myélinisés. La myélinisation permet une considérable économie d’espace et d’énergie. A titre d’exemple, l’axone géant de calmar, qui est amyélinique, occupe un espace 15000 fois supérieur à celui d’une fibre myélinisée dont la vitesse de conduction est équivalente chez le mammifère, et a une dépense énergétique qui est plusieurs milliers de fois plus élevée. Généralement, le taux de myélinisation, qui peut atteindre quelques dizaines de spires membranaires, est quantifié en mesurant le g-ratio, rapport entre le diamètre de l’axone et le diamètre externe de sa gaine (figure 1d). L’organisation et la composition de cette gaine de myéline assurent un soutien à la fois trophique et fonctionnel à l’axone, nécessaire à la conduction et à la survie neuronale.
Différentes régions de l’axone myélinisé
Les axones des neurones myélinisés comportent différents domaines (figure 2A) : (1) le segment axonal initial (AIS) où sont générés les potentiels d’action ; (2) les nœuds de Ranvier qui vont permettre la régénération de ces potentiels d’action ; (3) les régions périnodales : paranœuds et juxtaparanœuds qui permettent l’adhésion de la myéline sur l’axone et (4) les internœuds qui sont les régions axonales myélinisées (Desmazières et al., 2012; Freeman et al., 2015).
Composition de la myéline
La composition de la myéline est caractérisée par une très faible hydratation (40% d’eau) et un enrichissement important en lipides plus qu’en protéines contrairement à la plupart des autres membranes cellulaires.
Composition en lipides :
Les principaux lipides sont répartis en trois groupes : les glycolipides, le cholestérol et les phospholipides. Un groupe en particulier, celui des galactolipides, domine la famille des glycolipides de la myéline. Le galactocerebroside (GalC) et son dérivé sulfaté représentent un tiers de la masse lipidique de la myéline (Dupree et al., 1998). Le galactocerebroside est un lipide composé de galactose et de ceramide, lié au premier groupe hydroxyle par la ceramide galactosyltransferase (CGT), alors que le sulfatide est formé par la sulfatation du galactocerebroside par l’enzyme cerebroside sulfotransferase (CST; Morell and Radin, 1969). Les galactolipides ont été très étudiés en raison de leur abondance et de leur expression précoce dans les oligodendrocytes. En utilisant une lignée de souris dont le gène codant pour CGT a été inactivé, plusieurs études ont montré que ces souris ont une myéline avec une ultrastructure anormale, ainsi qu’une rupture au niveau des paranœuds, et une diminution de la vitesse de conduction axonale (Bosio et al., 1996; Coetzee et al., 1996; Dupree et al., 1998). En utilisant une lignée de souris déficiente pour CST, un défaut d’assemblage des paranœuds a été également observé, soulignant l’importance du sulfatide (Honke et al., 2002; Marcus et al., 2006).
Composition en protéines :
Comme mentionné précédemment, certaines protéines bien que présentes en faible proportion dans la myéline sont spécifiques et ont un rôle important. Citons la plus abondante d’entre elles, la protéine protéolipidique ou PLP, protéine de faible masse moléculaire qui n’est pas nécessaire à la myélinisation ou la compaction de la myéline mais est requise pour assurer sa stabilité ainsi que pour la préservation de l’intégrité axonale. En effet, chez les animaux ou les patients qui n’ont pas de PLP on observe une dégénérescence axonale (Garbern et al., 2002; Griffiths et al., 1998). La protéine MBP ou myéline basique protéine constitue 30% des protéines de la myéline. L’absence de MBP chez les souris shiverer se traduit par une hypomyélinisation et une absence de ligne dense majeure (Privat et al., 1979). La 2’,3’-cyclic-nucleotide 3’phosphodiesterase ou CNP joue un rôle important au niveau des jonctions paranodales et pour l’intégrité axonale mais son absence n’a pas d’impact direct sur la structure de la myéline (Lappe-Siefke et al., 2003; Rasband et al., 2005).
Oligodendrocytes (différenciation et myélinisation)
Les différents stades de différenciation
Au cours du développement, les oligodendrocytes se différencient à partir de progéniteurs et passent par différents stades de maturation avant de pouvoir former la myéline. Ces différents stades sont : oligodendrocyte précurseur (OPC), pré-oligodendrocyte, oligodendrocyte immature et oligodendrocyte mature non myélinisant. Puis, après ce stade de différentiation, l’oligodendrocyte est capable de myéliniser et est appelé oligodendrocyte mature myélinisant. Des changements morphologiques sont observés au cours de la maturation. En effet, plus les oligodendrocytes sont matures, plus on observe un nombre important de ramifications. Ces changements morphologiques sont accompagnés d’une évolution de l’expression protéique et glycolipidique. On peut donc repérer les différents stades par immunomarquage de ces protéines et glycolipides. Les principaux marqueurs sont exprimés indiqués sur la figure 3 et sont en particulier : le récepteur PDGFRα (platelet derived growth factor receptor alpha), le ganglioside A2B5 et le chondroïtine sulfate protéoglycan NG2 qui marquent les OPCs ; le sulfatide O4, la galactocérébroside GalC, et CNP qui marquent les oligodendrocytes immatures et la protéine proteolipidique PLP et la MBP, marqueurs des oligodendrocytes matures et myélinisants. Au stade OPC, les cellules sont capables de proliférer et de migrer puis perdent cette capacité et forment des ramifications qui au stade mature pourront s’enrouler autour des axones. Ce processus se produit dans une fenêtre de temps assez courte, tout au moins dans le modèle développemental du poisson-zèbre (Czopka et al., 2013; Watkins et al., 2008).
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Table des matières
Introduction
1. Myélinisation des neurones
a. Propagation des potentiels d’action
b. La gaine de myéline
i. Propriétés
ii. Différentes régions de l’axone myélinisé
iii. Composition de la myéline
c. Oligodendrocytes (différenciation et myélinisation)
i. Les différents stades de différenciation
ii. Facteurs contrôlant la différenciation des OPCs au cours du développement
d. Sclérose en plaques
i. Aspects cliniques et épidémiologiques
ii. Conséquences axonales de la démyélinisation
2. Composition moléculaire des domaines axonaux
a. Les nœuds de Ranvier
b. Les paranœuds
c. Les juxtaparanœuds
3. Mécanismes d’assemblage des nœuds dans le SNP et le SNC
a. SNP
b. SNC
4. Le projet de recherche
Méthodologie
1. Animaux
2. Culture cellulaire
a. Neurones d’hippocampe
i. Culture mixte
ii. Culture de neurones purifiés
b. Cellules gliales
i. Culture des cellules gliales
ii. Culture des Oligodendrocytes
3. Préparation du Milieu Conditionné d’Oligodendrocytes (MCO)
a. Traitement des oligodendrocytes
4. Traitements des neurones purifiés avec le MCO
5. Coupes de tissus au cryostat
6. Coupes de tissus au vibratome
7. Immunofluorescence
a. Anticorps utilisés pour les marquages immunofluorescents
b. Fixation et marquage des cellules en culture
c. Coupes de cerveau flottantes
d. Acquisition et traitement des images
8. Quantification et analyse statistique
9. Analyse protéomique
a. Fractionnement du MCO
b. Préparation des MC (QuaNCAT)
c. Analyse des données (pathway studio/ingenuity)
10. Immunoprécipitation et Western Blot
a. Immunoprécipitation
b. Western Blot
i. Préparation des échantillons
ii. Migration et transfert
iii. Incubation des Anticorps
iv. Electro-ChimioLuminescence (ECL)
Résultats
1. Chronologie d’apparition des nœuds de Ranvier sur les neurones hippocampaux
a. Neurones d’hippocampe en culture
b. Neurones d’hippocampe au cours du développement in vivo
2. L’assemblage de prénœuds est induit par des signaux oligodendrogliaux
a. Effet du milieu conditionné d’oligodendrocytes (MCO)
b. Phénotype des oligodendrocytes produisant le MCO et activité
c. Cinétique d’agrégation des canaux sodium après ajout du MCO à différents temps de culture
3. Caractérisation des propriétés biochimiques du MCO
a. Le(s) facteur(s) responsable(s) de l’activité de clustering est (sont) de nature protéique
b. Fractionnement
c. Exosomes
4. Analyse protéomique
a. Analyse protéomique des fractions actives du MCO
b. Analyse protéomique du MCO par QuaNCAT
c. Différents critères d’analyse
d. Résultats obtenus pour les fractions actives
e. Résultats de la comparaison MCO/MCA et MCN
5. Sélection de protéines candidates et Validation
a. Choix des candidats
b. Vérification de l’expression – western blot et immunoprécipitation
c. Déplétion du MCO par IP
d. Inhibition de la sécrétion par des drogues
6. Etude de la régulation de la sécrétion de facteurs pro-agrégants par la signalisation neuronale
Discussion
Conclusion
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