Etude des monocytes dans le modèle du diabète post-gestationnel – Etude Epitherapie

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Description des sous-types et de leurs fonctions

A l’état basal, les monocytes circulent dans le réseau vasculaire en attente d’un signal d’activation, que ce dernier vienne de médiateurs inflammatoires circulants ou directement de la rencontre avec un pathogène. En l’absence d’activation, une partie des monocytes peut infiltrer les tissus où ils se différencient en macrophages, participant au turn-over de ces derniers.
Les monocytes circulants constituent ainsi une équipe d’urgence, ayant la capacité de réagir très rapidement à une agression. Cette réaction consiste en un déplacement rapide vers le site de l’agression puis en des actions coordonnées anti et pro-inflammatoires, aidant ainsi à la destruction de l’agresseur et à la réparation du tissu lésé. Le déplacement vers le site d’action implique une capacité d’infiltration des tissus puis une capacité de différenciation en macrophage. Les actions pro-inflammatoires consistent majoritairement en la sécrétion de cytokines pro-inflammatoires permettant le recrutement et l’activation de nouvelles cellules de l’immunité innée. Les actions anti-inflammatoires des monocytes sont la sécrétion de cytokines anti-inflammatoires stoppant le recrutement et l’activation de nouvelles cellules de l’immunité innée, et la phagocytose de cellules apoptotiques ou de débris cellulaires. Les caractères antagonistes de certaines de ces actions impliquent l’existence de plusieurs sous-types de monocytes circulants.
Chez l’Homme, les connaissances actuelles sub-divisent les monocytes en 3 sous-groupes que sont les monocytes classiques, les monocytes intermédiaires et les monocytes non classiques. Cette classification en 3 sous–groupes, a été possible grâce à l’apport de la cytométrie en flux qui a permis de mesurer le degré d’expression des protéines de surface CD14 et CD16 (81). CD14 est un corécepteur des TLR-4 qui médie le signal LPS, alors que CD16 est un Récepteur Fc des Immunoglobulines G.
Les monocytes classiques, qui représentent 80 à 90% des monocytes circulants sont CD14+ CD16-, alors que les monocytes intermédiaires (5-10%) sont CD14+CD16+ et les monocytes non classiques sont CD14Low CD16+ (5-10%). (81-82).

Variations des pourcentages des différents sous-types de monocytes en fonction de différentes situations physiologiques ou pathologiques

Nous avons vu précédemment que, même à l’état physiologique, le compte de monocytes variait selon de nombreux critères cliniques simples, il en est de même pour la répartition des 3 sous-groupes décrits plus haut.
Ainsi la proportion de monocytes non classiques serait supérieure chez les hommes par rapport aux femmes (100), les sujets d’origine africaine auraient plus de monocytes non classiques et moins de monocytes classiques et que les caucasiens (101), et il existerait une augmentation avec l’âge du pourcentage de monocytes intermédiaires et non classiques (102–103).
Durant la grossesse, il est connu que le taux de monocytes augmente (104–105), mais il existe aussi une modification de la répartition des sous types. La grossesse est associée à une activation des monocytes se traduisant par une augmentation du taux de monocytes intermédiaires et une diminution du taux de monocytes classiques (106–107). A l’inverse, chez les patientes ayant un diabète gestationnel, on observe une diminution significative des monocytes intermédiaires et une augmentation des classiques (108).
Des variations de répartitions des monocytes ont aussi été décrites entre des états sains et des états pathologiques. Le premier exemple est celui des sepsis durant lesquels les pourcentages de Monocytes Intermédiaires et Non-Classiques augmentent alors que celui des Monocytes Classiques diminue (109).
Dans le cadre des maladies inflammatoires chroniques stériles, les patients porteurs de lupus systémique, de maladies de Crohn, d’asthme ou de polyarthrite rhumatoïde présentent les mêmes variations des différents sous-types de monocytes que durant le sepsis (109–112). Cette constance dans les variations en contexte inflammatoire est un argument supplémentaire en faveur du rôle pro-inflammatoire des MI et MNC.
Enfin, les maladies cardio-métaboliques sont également associées à des variations des sous types de monocytes. Ainsi, chez les patients en surpoids ou obèses, le pourcentage de monocytes classiques diminue par rapport aux patients sains (113–115), avec une augmentation des non classiques (113–116). A l’inverse, la perte de poids associée à la réalisation d’une chirurgie bariatrique de type Bypass gastrique était associée à une rediminution des monocytes intermédiaires et non classiques (113).
L’analyse de la littérature concernant la répartition des sous-types de monocytes chez les patients de la population générale ayant développés de l’athérosclérose montre de manière répétée une augmentation des monocytes intermédiaires et une absence de modification significative des monocytes non classiques (117-119).
Les monocytes sont donc des cellules impliquées dans la mise en route de la réponse inflammatoire puis dans sa résolution, via des sous-types aux propriétés distinctes, pro ou anti-inflammatoires. La rupture de l’équilibre entre ces sous-types, avec augmentation durable de la proportion des sous-types pro-inflammatoires, est associée à l’établissement de maladies inflammatoires chroniques. Comme vu plus haut, certains types de diabète sont eux-mêmes des maladies inflammatoires chroniques, dans lesquelles le rôle des monocytes pourrait être important si ce n’est central. (Figure 8).

Prédiabète et diabète gestationnel

Entre la normoglycémie et le diabète, il existe un état appelé « Prédiabète », basé sur des paramètres glycémiques supérieurs à la normale mais en dessous des seuils de diabète. Pour l’ADA le prédiabète comprend les patients avec une glycémie à jeun entre 1g/l et 1,25g/l, avec une glycémie à 2h lors d’une HGPO 75g entre 1,4 et 2g/l ou avec une HbA1c entre 5,7 et 6,4% (120). Il s’agit d’un état à haut risque de diabète avec un taux de conversion annuel de 5 à 10 % (121- 122), mais avec une proportion bien supérieure de sujets retournant en normoglycémie (121- 123-124). La prévalence du prédiabète augmente dans le monde (125-126) et il est prévu que >470 millions de personnes auront un prédiabète en 2030 (127). Les patients prédiabétiques peuvent être divisés en deux groupes, ceux présentant une hyperglycémie à jeun et ceux présentant une intolérance au glucose.
Comme le diabète, le prédiabète associe à des degrés diverses une résistance à l’insuline et un dysfonctionnement des cellules β; ces anomalies débutent avant que l’élévation du taux de glucose ne soit détectable (128–131).

L’athérosclérose est une maladie inflammatoire chronique

L’OMS définit l’athérosclérose comme étant « une association variable de remaniements de l’intima des artères de gros et moyen calibre consistant en une accumulation locale de lipides, de glucides complexes, de sang et de produits sanguins, de tissu fibreux et de dépôts calcaires ; le tout s’accompagnant de modification de la média ». Ces remaniements sont appelés plaques d’athéromes, ces plaques font saillies dans la lumière artérielle mais n’ont un retentissement clinique que lorsqu’elles diminuent de plus de 50-70% la lumière de l’artère ou quand elles se détachent et provoquent des thromboses qui vont bloquer la circulation sanguine en aval. L’athérosclérose n’est pas spécifique du diabète, mais s’y distingue par sa précocité, sa plus grande fréquence et sa sévérité. Le risque cardiovasculaire est multiplié par 2 à 3 par le diabète, indépendamment des autres facteurs de risque fréquemment associés comme l’HTA. Le sur risque associé au diabète varie selon le lit artériel :  Risque coronarien multiplié par 2 à 4 ;  Risque d’accident vasculaire ischémique multiplié par 1,5 à 2 ;  Risque d’artériopathie oblitérante des membres inférieurs multiplié par 5 à 10. La mortalité des AVC et des infarctus du myocarde est supérieure en cas de diabète (risque de décès multiplié par 2 environ). A. Physiopathologie de l’athérosclérose La constitution de la plaque se fait en plusieurs étapes et dépend d’une part de l’entrée passive des lipoprotéines (LDLc, VLDL) et de leurs oxydations dans l’intima, et d’autre part de la réaction inflammatoire locale impliquant macrophages résidents et monocytes infiltrants. Elle commence par la pénétration passive et l’accumulation de lipoprotéines de basse densité (LDLc) dans l’intima artérielle. Dans l’espace intimal, les LDL sont alors oxydées par différents mécanismes enzymatiques et non enzymatiques. (148). Cette oxydation conduit à l’activation des cellules endothéliales, c’est-à-dire à l’expression à leurs surfaces de molécules d’adhésion (intégrines et sélectines) qui permettent l’adhésion de monocytes circulants à cette surface endothéliale (149-152).
Sous l’influence du MCP-1, les monocytes ayant adhérés à la paroi pénètrent dans l’espace sous endothélial (153–154) ; puis sous l’influence du M-CSF (monocyte-colony stimulating factor) les monocytes s’y différencient en macrophages (149).
Ces macrophages nouvellement différenciés vont d’une part se transformer en cellules spumeuses en captant les LDL-oxydées via des récepteurs « scavengers » (155–156) et d’autre part produire des cytokines pro-inflammatoires (IL-1β, IL-6, TNF-α) responsables de l’amplification et de la pérennisation de l’état inflammatoire local (157). Ces cytokines pro-inflammatoires sont notamment à leurs tours capables de médier l’activation endothéliale, favorisant ainsi l’adhésion et l’internalisation de nouveaux monocytes, faisant rentrer la plaque dans un cercle vicieux d’auto-amplification responsable de la progression de la plaque.
Ce recrutement cellulaire continu favorise la formation de plaques d’athérome avancées, consistant en une région centrale nécrotique entourée d’une chape de cellules musculaires et d’une matrice extra-cellulaire riche en collagène et en protéoglycane. Par la suite, cette chape fibreuse peut être progressivement amincie par l’action de métalloprotéinases matricielles (MMP) sécrétées par les macrophages, rendant les plaques sujettes à la rupture (158).
La rupture d’une plaque d’athérome entraine la libération de son contenu dans la lumière artérielle, occasionnant la formation d’un thrombus qui, en obstruant la lumière artérielle, occasionne une ischémie aigue des territoires en aval (159). Cette ischémie aigue est appelée syndrome coronarien aigu, accident vasculaire cérébrale ou ischémie aigue de jambe suivant le lit artériel intéressé.
En l’absence de rupture de plaque, celle-ci peut progresser jusqu’à occasionner des symptômes (angor d’effort, claudication intermittente) pour des efforts de moins en moins importants.
Cette progression de la plaque d’athérome jusqu’à la constitution d’une sténose significative ou jusqu’à sa rupture, est donc fortement dépendante des cellules de l’immunité innée.

Evaluation de l’athérosclérose

Il est possible d’évaluer le risque de survenue d’un événement cardiovasculaire majeur (ECVM) via la réalisation d’un score calcique coronaire (SCC) (160). Plus l’athérosclérose coronaire est importante, plus la plaque d’athérome contient des dépôts de calcaires qui sont visibles au scanner (hyperdenses). Le calcul du SCC repose sur l’acquisition par un scanner de 20 coupes transversales centrées sur le coeur et les artères coronaires. Pour chaque coupe, ne sont retenues que les régions de plus de 1mm² ayant une densité supérieure ou égale à 130 unités Hounsfield (UH). Ces régions sont affectées d’un score égal à la multiplication de leur surface en mm² par un nombre reflétant leur densité, nombre défini selon le protocole suivant : 1 = 130 à 199 UH, 2 = 200 à 299 UH, 3 = 300 à 399UH et 4 ≥ 400 UH. L’addition du score de chaque région d’une coupe donne le score de la coupe. L’addition du score de chaque coupe donne le score calcique coronaire total.

Association entre les différents sous-types de monocytes et le risque cardiovasculaire dans la population générale

Dans la population générale, l’athérosclérose est associée à une augmentation du pourcentage de monocytes intermédiaires ; dans le même temps le pourcentage de monocytes non-classiques ne change pas, et l’évolution de celui des monocytes classiques varie en fonction des études (163– 165).
Si l’on se focalise sur les atteintes coronariennes, il ne semble pas y avoir de modification du nombre ou du pourcentage de monocytes intermédiaires entre les patients malades et les patients sains (166-171); les données actuelles concernant les monocytes classiques et non classiques sont très hétérogènes et ne permettent pas de conclure (166;168;170).
Enfin, dans le cas précis de la cardiopathie ischémique, la seule étude dédiée ne retrouve pas de changement de répartition ou de nombre des différents sous-groupes de monocytes, entre les sujets sains et malades (172).

Evaluation des facteurs cliniques et biologiques associés au taux de monocytes dans une population diabétique de type 2 non sélectionnée.

Le compte des monocytes n’est pas associé à la durée du diabète, l’IMC et l’HbA1c (p respectivement à 0,63 ; 0,46 et 0,48). Il est inversement corrélé avec le cholestérol circulant, qu’il soit total, HDLc ou LDLc. En revanche on ne retrouve pas cette association avec les triglycérides. (Tableau 5)
Les variables positivement corrélées au compte des monocytes étaient l’âge (r= 0,13 ; p = 0,01), la leucocytémie (r = 0,56 ; p <0,0001) et le résultat du score calcique coronaire (r=0,12 ; p=0,12). (Tableau 5)
Comme attendu, les hommes avaient des taux de monocytes significativement plus élevés que les femmes (p<0,0001), tout comme les tabagiques actifs par rapport aux non-fumeurs (p<0,0001). En ce qui concerne les traitements, les patients sous traitements antihypertenseurs et sous traitements antiagrégants plaquettaire avaient plus de monocytes que les non traités (p=0,03 et 0,02). A l’inverse, aucune différence significative de monocytémie n’a été mise en évidence en fonction du traitement par insuline ou par agonistes du récepteur au GLP-1. (Figure 1) Après ajustement, les variables restant significativement associées au compte de monocytes étaient le sexe masculin, l’IMC, le tabagisme et la taux plasmatique de créatinine. (Tableau 6)

Analyse LC-MS/MS des phospholipides et sphingolipides

– Les lipides ont été quantifiés par LC-ESI/MS/MS à l’aide d’un UFLC Prominence et d’un spectromètre de masse QTrap 4000.
– L’échantillon (4μl) a été injecté dans une colonne Kinetex HILIC 2,6μm 2,1x150mm. Les phases mobiles étaient constituées d’eau et d’acétonitrile contenant de l’acétate d’ammonium et de l’acide acétique.
– Les espèces lipidiques ont été détectées à l’aide de la surveillance programmée des réactions multiples (sMRM) en mode ions positifs reflétant le groupe de tête fragmentation de chaque classe lipidique.

Analyses bio informatiques des résultats

Une première analyse a été réalisée, étudiant chaque espèce lipidique individuellement, puis une deuxième analyse a été réalisé après regroupement des espèces lipidiques en modules en appliquant une méthode habituellement utilisée pour les analyses transcriptomiques : la Weighted Correlation Network Analysis (WGCNA).

Analyse totale

– Un script R développé par l’équipe du Dr Le Goff a été utilisé pour corriger la contribution isotopique sur les signaux MRM des injections HILIC.
– Les caractéristiques avec plus de 80 % de valeurs manquantes ont été supprimées, les valeurs manquantes des caractéristiques restantes ont été imputées à l’aide d’une approche KNN sur le logiciel open source MetaboAnalyst.
– Les caractéristiques lipidiques dont les variabilités dépassaient 30% dans le pool QC ont été supprimées.
– Les données brutes ont été exprimées en nmol/ul comme concentration plasmatique.
Une analyse de variance (ANOVA) a été réalisée pour tous les groupes afin de trouver des caractéristiques séparant les trois groupes. Dans toutes ces analyses, une caractéristique est considérée comme significative lorsque la p-value est inférieure à 0,05 après la correction Benjamini−Hochberg FDR.
– L’analyse s’est concentrée sur les glycérophospholipides et les sphingolipides, car ce sont les deux familles lipidiques les plus connues pour être impliquées dans l’insulinorésistance et la pathogénèse du diabète.
Toutes les analyses statistiques ont été effectuées à l’aide du logiciel Multi Experiment Viewer (MeV) version 4.9 (https://sourceforge.net/projects/mevtm4/)

Analyse WGCNA

La première étape de cette WGCNA, appliquée au lipidome des patientes issues de la cohorte Epithérapie, a été la normalisation des données via une transformation normale inverse basée sur le rang.
Puis le logiciel a étudié les relations entre les concentrations de chaque espèce lipidique de chaque patiente, afin de construire des modules de lipides corrélés entre eux. Cette étape a donnée naissance à 6 modules lipidiques, que nous désignerons selon 6 couleurs (bleu, turquoise, vert, marron, jaune et gris). La composition en lipides de chaque module est détaillée en annexe. Pour chaque module lipidique, il a ensuite été testé l’association avec
– Des variables cliniques: Age, poids, IMC, Pression artérielle Systolique, Pression Artérielle Diastolique.
– Des variables biologiques : HbA1c, pourcentage de Monocytes et des différents sous types monocytaires issues de l’immunophénotypage de la partie a)
– Les différents états de tolérance glucidique.
L’ensemble des lipides quantifiés a été considéré dans cette analyse, et non uniquement les glycérophospholipides et les sphingolipides comme dans la première analyse.

Table des matières

I. INTRODUCTION
1. L’inflammation perturbe la sécrétion et la signalisation de l’insuline
A. Insulino-résistance et inflammation
a) Macrophages
b) Lipotoxicité
B. Insulinosécrétion et inflammation
C. Les monocytes
a) Origine des monocytes et déterminants de leurs taux plasmatiques
b) Description des sous-types et de leurs fonctions
c) Variations des pourcentages des différents sous-types de monocytes en fonction de différentes situations
D. Pré diabète et diabète gestationnel
2. L’athérosclérose est une maladie inflammatoire chronique.
A. Physiopathologie de l’athérosclérose
B. Evaluation de l’athérosclérose
C. Association entre les différents sous-types de monocytes et le risque cardiovasculaire dans la population générale.
3. En pratique clinique générale, l’évaluation de l’inflammation repose sur la quantification des globules blanc plasmatiques, de la CRP(us) et du fibrinogène
4. L’étude de l’inflammation en recherche fondamentale
5. Hypothèse et Objectifs
II. RESULTATS
Chapitre 1 : Etude des monocytes dans une population de patients avec diabète de type 2
1. Introduction
2. Objectif
3. Méthodes
A. Cohorte Angiosafe2
B. Immunophénotypage
C. Analyses statistiques
D. Analyse transcriptomique
4. Résultats
A. Description de la population totale
B. Evaluation des facteurs cliniques et biologiques associés au taux de monocytes dans une population diabétique de type 2 non sélectionnée.
C. Evaluation du risque cardiovasculaire dans cette même population, et son association avec les données monocytaires
D. Description de la sous-population utilisée pour l’analyse transcriptomique
E. Résultats de l’analyse transcriptomique
5. Discussion
Chapitre 2 : Etude des monocytes dans le modèle du diabète post-gestationnel – Etude Epitherapie
1. Introduction
2. Objectif
3. Méthodes
A. Recrutement des sujets
B. Immunophénotypage
C. Biologie moléculaire
D. Analyse lipidomique
4. Résultats
A. Immunophénotypage
B. Biologie moléculaire
C. Analyse lipidomique
5. Discussion
Chapitre 3 : Etude de l’influence de l’inflammation dans les formes sévères d’infection à COVID-19 – PUBLICATION
III. CONCLUSION
IV. BIBLIOGRAPHIE

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