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Les systèmes de régulation à deux composants
Définition et distribution Historiquement, le terme « système à deux composants » a été utilisé la première fois pour décrire une nouvelle classe de systèmes régulateurs chez les procaryotes (Nixon et coll., 1986,Stock et coll., 1989 ; Parkinson et coll., 1992; Hoch et coll., 1995). A ce jour, plusieurs centaines de systèmes à deux composants ont été décrits chez la plupart des organismes vivants : chez les Archaea et les eubactéries (Alex & Simon, 1994 ; Loomis et coll., 1997 ; Bourret et coll., 1989) et chez des organismes eucaryotes où ils constituent 1% des protéines codées (West et coll., 2001), comme dans la plante Arabidopsis thaliana où ils jouent un rôle dans la régulation de l’utilisation de l’éthylène (Chang et coll., 1999) et la levure Saccharomyces cerevisiae où ils interviennent dans l’osmorégulation (Ota & Varshavsky, 1993). Ces exemples laissent à penser qu’un mode de transmission de certains signaux similaires à celui des bactéries pourrait être aussi présent chez les organismes eucaryotes. Les systèmes à deux composants représentent la forme majoritaire des voies de signalisation cellulaire chez les bactéries et plus de 30 de ces systèmes ont été répertoriés uniquement chez Escherichia coli (West et coll., 2001; Mizuno et coll., 1997). Ils sont présents chez des bactéries Gram-négatives et Gram-positives dans des fonctions aussi différentes que le chimiotactisme (Bischoff & Ordal, 1991), la compétence (Weinrauch et coll., 1990), l’osmorégulation (EnvZ/OmpR) (Stock et coll., 1989 ; Parkinson et coll., 1992; Hoche et coll., 1995) et la sporulation (Burbulys et coll., 1991), et contrôlent en plus la régulation de l’expression de toxines et de protéines impliquées dans la pathogénicité (virulence, résistance aux antibiotiques).
Mécanisme de transduction du signal Un système de transduction du signal fonctionne comme une voie d’information intracellulaire qui relie un stimulus extérieur à une réponse adaptative. En dépit de la grande diversité du nombre des stimuli et des réponses, un petit nombre de stratégies moléculaires est mis en œuvre pour la signalisation. La phosphorylation transitoire est une des stratégies fondamentales. Beaucoup de processus de transduction de signal eucaryotes impliquent des protéines kinases qui s’autophosphorylent et phosphorylent des résidus spécifiques d’autres protéines : sérine, thréonine, tyrosine, et de ce fait régulent leur activité. Dans la signalisation procaryote, les systèmes à deux composants dominent. Ils sont structurés autour de deux protéines conservées: une histidine kinase (HK) et un régulateur de réponse (RR). Les stimuli de l’environnement sont détectés par le domaine senseur de l’histidine kinase et provoquent l’activité enzymatique, par autophosphorylation ATP-dépendante d’un résidu spécifique histidine (H) dans l’histidine kinase. Le régulateur de réponse catalyse ensuite le transfert d’un groupe phosphate à partir de l’histidine phosphorylé vers son propre résidu aspartate. La phosphorylation du domaine de RR active alors un domaine effecteur qui induit une réponse spécifique.
Les domaines PAS
Un grand nombre de protéines senseurs et facteurs de transcription à structures multidomaines, impliquées dans la transduction du signal, possèdent un domaine PAS. L’acronyme PAS a été utilisé à l’origine (Nambu et coll., 1991) pour décrire une région de 270 acides aminés entourant deux régions répétées (PAS A et PAS B) de 50 résidus chacun, laquelle a été identifiée dans trois protéines pour la première fois : PER « Period circadian protein » chez la drosophile (Crews et coll., 1988), ARNT « Aryl hydrocarbon receptor nuclear translocator protein » chez les vertébrés (Hoffman et coll., 1991) et SIM « Single minded protein » chez la drosophile (Crews et coll., 1988). Ces trois protéines (Figure 1.3) sont respectivement impliquées dans la régulation du rythme circadien, l’activation de la réponse xénobiotique et la détermination du devenir des cellules. Les domaines PAS sont présents dans beaucoup de protéines où ils détectent des changements dans la lumière, le potentiel redox, de ligands, l’oxygène, et le niveau énergétique d’une cellule. Ces protéines à domaines PAS se trouvent dans des Bactéries, Archaea et Eucarya (Zhulin et coll., 1997, Taylor & Zhulin, 1999) ; dans les bactéries et Archaea des domaines PAS sont trouvés exclusivement dans les senseurs des systèmes régulateurs à deux composants. Les protéines à domaines PAS comprennent des kinases à histidine et à sérine/thréonine, des récepteurs de lumière, des protéines du rythme circadien, les protéines senseurs (à oxygène et à potentiel redox) et des canaux ioniques (Zhulin et coll., 1997). Les domaines PAS ont le rôle de domaine senseur dans beaucoup de protéines de signalisation où ils sont connus pour détecter leur signal grace à un cofacteur associé : un hème, une flavine ou un chromophore hydroxycinnamyl. Ainsi, le type de réponse de la cellule aux changements des conditions environnementales et intracellulaires est contrôlé par un domaine récepteur, transducteur ou régulateur contenant le domaine PAS. Des similitudes entre les séquences répétées PAS et la protéine PYP « photoactive yellow protein », photorécepteur bactérien, ont été identifiées par Lagarias et coll., (1995). Des études récentes suggèrent que les domaines PAS comprennent une région de 100 à 120 acides aminés et possèdent un repliement tridimensionnel commun très conservé ainsi qu’une région Cterminale variable. La protéine entière PYP (125 acides aminés), l’hémodomaine de la protéine senseur à oxygène FixL et le domaine N-terminal de la protéine HERG du canal potassique eucaryote (Morais Cabral et coll., 1998) ont été proposés comme prototypes d’un domaine PAS.
De la molécule diatomique aux messagers physiologiques
a) Le fer et l’hème :Le fer est utilisé dans beaucoup de centres catalytiques d’enzymes importantes et est un cofacteur indispensable dans nombre de processus biologiques redox ou dans le transport d’oxygène. Sa présence ubiquitaire dans les enzymes redox est liée à ses propriétés d’état de valence et de spin. Le fer est présent dans des cofacteurs sous plusieurs formes (centre Fe-S, fer ‘libre’, hème). Dans le cas des protéines étudiées, c’est le fer hémique qui est impliqué. Outre le rôle senseur, les fonctions les plus connues des hémoprotéines incluent le stockage de l’oxygène par la myoglobine, son transport par l’hémoglobine, le transfert d’électrons par les cytochromes et l’activation catalytique des ligands de l’hème par le cytochrome P450 et les peroxydases. L’hème est un groupement prosthétique contenant un atome de fer au centre d’un anneau hétérocyclique, appelé porphyrine. Dans le cas de l’hémoglobine, la porphyrine coordinant l’atome de fer est la protoporphyrine IX, molécule hautement conjuguée, plane et donneuse d’électrons. Le type d’hème le plus commun est appelé hème b, présent dans l’hémoglobine et la myoglobine (figure 1. 5). Dans les hémoprotéines, l’hème est enchâssé dans le squelette polypeptidique de la protéine à laquelle il est lié. L’atome de fer est à la base des réactions variées rencontrées parmi les hémoprotéines. C’est en se liant à différent ligands diatomiques comme le CO, NO, O2 ou en changeant son état d’oxydation et/ou de spin, que l’atome de fer de l’hème va permettre à la protéine à laquelle il est lié d’accomplir sa fonction.
b) Le monoxyde de carbone :Le monoxyde de carbone (CO) se forme de façon endogène dans l’organisme humain lors du catabolisme de l’hème. Les effets toxiques du monoxyde de carbone sont dus pour une grande partie à la formation de carboxyhémoglobine (COHb), qui empêche le transport de l’oxygène par le sang. L’affinité de l’hémoglobine pour le monoxyde de carbone est d’environ 240 à 250 fois supérieure à celle de l’oxygène.
c) Le monoxyde d’azote (NO) :L’oxyde nitrique, molécule extrêmement réactive et de courte durée de vie en milieu biologique, est produite de façon endogène par l’enzyme oxyde nitrique synthase (NOS). Dans le cas de la guanylate cyclase soluble, l’oxyde nitrique vient se lier à la protéine (voir partie 1.3.3) et activer la production du second messager guanosine monophosphate cyclique (cGMP). La structure électronique du NO est remarquable par la présence d’un électron non apparié qui lui confère une nature de radical libre. Cette propriété domine sa réactivité chimique et biochimique. Le NO réagit avec une autre molécule paramagnétique (exemple; O2, O2- ) ou par liaison avec un atome métallique tel que le fer. Dans ce cas, l’électron non apparié est partagé entre le métal et le NO ce qui explique la forte affinité du NO pour les protéines à hème. Toutefois l’environnement de l’hème influe sur le degré d’affinité de l’hème pour ces différentes molécules.
d) Le dioxygène :Le dioxygène est un gaz nécessaire à la respiration cellulaire qui participe à des réactions d’oxydoréduction. Il est l’accepteur terminal pour la phosphorylation oxydative mais également source de réactions d’oxydation néfastes ou du stress oxydatif lié à la production d’espèces réactives : les radicaux libres et les substances chimiques oxydantes non radicalaires dérivés de l’oxygène. Ces radicaux libres sont des espèces chimiques instables qui possèdent au moins un électron non apparié et donc une haute affinité pour l’hème. Beaucoup de bactéries se sont adaptées pour vivre dans une zone de concentration définie en oxygène tout comme les cellules des organismes multicellulaires eucaryotes se sont adaptées à l’atmosphère. La détection directe de l’oxygène constitue alors une nécessité pour ces cellules. Pour être efficace, les protéines senseurs à hème doivent contrôler nombre de paramètres. Le domaine senseur doit changer après la liaison de son ligand signal, c’est-à-dire déclencher un changement de la forme active à la forme inactive et discriminer les différents messagers physiologiques.
Les hémosenseurs à CO
a) Le facteur de transcription bactérien CooA :La bactérie photosynthétique Rhodospirillum rubrum est capable de croître en présence de CO comme seule source énergétique en condition anaérobie (Kerby et coll., 1995). La CO deshydrogénase et hydrogénase qui sont codées par l’opéron coo sont exprimées dans ces conditions et sont les enzymes clés qui facilitent la croissance dans ce type d’environnement (Kerby et coll., 1992). La protéine CooA est responsable de la régulation transcriptionnelle de l’expression de l’opéron coo en réponse au CO. Ce système permet une protection pour certaines activités métaboliques sensibles au CO, telle que la fixation de l’azote. CooA est un activateur de transcription qui possède un protohème six-fois coordonné (Shelver et coll., 1995). Le CO est l’effecteur physiologique de CooA et remplace un des ligands axiaux de l’hème ferreux pour former la forme active CO-ligandée. L’activité de CooA est également contrôlée si CooA se lie ou pas à sa cible ADN (Aono et coll., 1997). Seule CooA liée à CO peut se fixer sur sa cible ADN, indiquant que le CO liant l’hème active CooA comme de facteur de transcription. CooA est un membre de la famille des protéines réceptrices (CRP) de l’AMPc (identité de séquence de 30%) et des fumarate nitrate réductases (FNR) (Shelver et coll., 1997).
b) La protéine neuronale NPAS2 :La protéine neuronale à hémodomaine PAS est synthétisée principalement dans le cerveau antérieur des mammifères et appartient à la classe des facteurs de transcription bHLH-PAS (basic Helix-Loop-Helix ; voir Tableau 1.1). Dans ces facteurs de transcription, l’extrémité Nterminale bHLH liant l’ADN est suivie de deux domaines PAS, PAS-A et PAS-B (130 acides aminés chacun) et 400 autres acides aminés à l’extrémité C-terminale. Les deux domaines PAS de NPAS2 lient l’hème. Boehning et Snyder (2002) ont rapporté que le CO pourrait avoir un rôle de neurotransmetteur dans le cerveau et que NPAS2 en serait le récepteur.
Le système à deux composants FixL/FixJ
Comme décrit précédemment, toutes les protéines FixL possèdent un domaine enzymatique histidine kinase régulé par l’hémodomaine (Gilles-Gonzalez et coll., 1991 et 1993 ; Lois et coll., 1993 ; Tuckerman et coll., 2001, 2002 ; Dunham et coll., 2003). La saturation de l’hémo-domaine par l’O2 inactive la kinase. En revanche, en absence d’oxygène, ces deux protéines sont capables de catalyser le transfert du phosphate γ de l’ATP vers un résidu conservé aspartate du régulateur FixJ. FixJ amplifie l’autophosphorylation de FixL et agit au final comme ‘substrat’ dans le transfert du phosphate de FixL-P (phospho-FixL) vers FixJ-P (phospho-FixJ) (Tuckerman et coll., 2001, 2002). La formation du complexe FixLJ précède toutes les étapes de phosphorylation et souvent la détection d’oxygène. Il existe de petites différences chimiques entres les protéines FixL, mais la plus surprenante est l’effet de l’état d’oxydation du fer de l’hème sur l’activité kinasique (Tuckerman et coll., 2001, 2002 ; Dunham et coll., 2003). En effet, pour FixL de Bradyrhizobium japonicum l’oxydation de la forme ferreuse (Fe2+) en ferrique (Fe3+) n’affecte pas le taux de renouvellement de FixL en FixJ-P. En revanche, pour FixL de Rhizobium meliloti, l’oxydation vers la forme ferrique inhibe ce ‘turn-over’ d’un facteur 100 (Tuckerman et coll., 2002 ; Dunham et coll., 2003).
Signalisation dans l’hémodomaine FixLH
Comme précédemment décrit, le domaine enzymatique de FixL est homologue aux histidines kinases des systèmes à deux composants (Parkinson & Kofoid, 1992), et le domaine PAS senseur à oxygène ne montre pas d’homologie avec une grande partie des hémoprotéines étudiées, comme la myoglobine, l’hémoglobine ou le cytochrome P450. La poche qui entoure l’hème doit donc jouer un rôle fondamental dans la spécificité pour le ligand physiologique oxygène et dans la signalisation au sein de ce domaine senseur. Néanmoins, c’est le mécanisme moléculaire par lequel la fixation de l’O2 se traduit en signal qui confère un si grand intérêt aux protéines FixL. La comparaison de structures tridimensionnelles de FixLH (Gong et coll., 1998, 2000; Hao et coll., 2002 ; Key & Moffat 2005) a permis d’élucider quelques aspects de la régulation de la fixation du ligand qui se distingue des autres hémoprotéines connues. Dans FixL, l’hème du type b est pentacoordonné et situé dans une poche de caractère hydrophobe, en partie dû à la présence de trois acides aminés Leu 236, Ile 238 et Ile 215 (Gong et coll., 1998). Les deux premiers acides aminés font partie des feuillets β et Hβ, le dernier de la boucle FG (Figure 1.10 et 1.11). Des études structurales montrent des similitudes de l’état de l’hème à l’équilibre entre l’oxy-complexe de FixL et la myoglobine (Gong et coll., 2000) dans les liaisons entre l’hème et l’oxygène (Tamura et coll., 1996). Cependant de petites différences sont observées dans l’organisation de la chaîne peptidique. En effet, après liaison des ligands O2 et CN- , la structure de la poche de l’hème de FixL est très significativement modifiée. Cette modification structurale concerne particulièrement la position de la boucle FG (résidus Thr 209 à Arg 220) et la position spatiale d’un résidu arginine en position 220 (Arg 220), qui se déplace du groupe propionate 7 de l’hème vers l’oxygène (Figure 1.11 B).
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Table des matières
I-Introduction
1.1. Les systèmes de régulation à deux composants
1.1.1. Définition et distribution
1.1.2. Mécanisme de transduction du signal
1.2. Les domaines PAS
1.2.1. Les domaines PAS senseurs
1.3. Les senseurs à hème
1.3.1. Rôle physiologique
1.3.2. De la molécule diatomique aux messagers physiologiques
a) Le fer et l’hème
b) Le monoxyde de carbone
c) Le monoxyde d’azote (NO)
d) Le dioxygène
1.3.3. La guanylate cyclase – hémosenseur à NO
1.3.4. Les hémosenseurs à CO
1.4. Les hémosenseurs à oxygène
1.4.1. La protéine AxPDEA1
1.4.2. Le senseur à oxygène rhizobien FixL
1.4.2.1. Les gènes nif et fix
1.4.2.2. Le système à deux composants FixL/FixJ
1.4.2.3. Organisation en domaine de FixL
1.4.2.4. Structure de BjFixLH
1.4.2.5. Signalisation dans l’hémodomaine FixLH
1.4.3. Le senseur Dos d’Escherichia coli (EcDos)
1.4.3.1. Organisation en domaine
1.4.3.2. Le domaine senseur DosH
1.4.3.3. Structure de l’hémodomaine EcDosH
1.4.3.4. Le site actif senseur
1.4.3.5. Rôle de Dos et partenaires d’interaction possibles
1.5. PA5442 de Pseudomonas aeruginosa, une nouvelle protéine senseur ?
1.5.1. Description de Pseudomonas aeruginosa
1.5.2. Implications cliniques de Pseudomonas aeruginosa
1.5.3. Biofilms et oxygène
1.5.4. Un senseur à hème dans P. aeruginosa
1.6. Problématique de la thèse
II-Résultats et Discussion
2.1. Etudes structure fonction de BjFixLH
2.1.1. Clonage de fixLH
2.1.2. Expression et purification de FixLH
2.1.3. Caractérisation de FixLH purifiée
2.1.4. Analyses de FixLH par spectroscopie d’absorption à l’équilibre
2.1.5. Dynamique des ligands
2.1.6. Le domaine FixLH et l’interaction avec O2
2.1.7. Etudes des mutants R220 de FixLH
2.1.7. Position de l’acide aminé R220
2.1.7.2. Construction des mutants R220 de FixLH
2.1.7.3. Analyse biochimique des produits mutés exprimés et purifiés.
2.1.7.4 Spectroscopie d’absorption à l’équilibre des mutants R220
2.1.7.5 Dynamique des ligands
2.2. Dos : une nouvelle protéine senseur d’Escherichia coli
2.2.1. Clonage de l’hémodomaine DosH
2.2.2. Mutagenèse dirigée de M95
2.2.3. Expression et purification de DosH
2.2.4. Analyses par spectroscopie d’absorption à l’équilibre
2.3. Caractérisation des mutants M95A, M95I et M95H
2.3.1. Analyse biochimique des produits exprimés et purifiés
2.3.2. Analyse par spectroscopie d’absorption
2.3.3. Dynamique des ligands dans DosHwt et les mutants M 95
2.4. Clonage et expression de la protéine entière EcDos
2.4.1. Partenaires possibles de Dos
2.5. Un nouveau senseur à hème chez Pseudomonas aeruginosa ?
2.5.1. Analyses in silico
2.5.2 Clonage du gène pa5442
2.5.3. Purification de la protéine PA5442 de Pseudomonas aeruginosa
2.5.4. Caractérisation spectroscopique
III-Conclusions et Perspectives
IV-Matériels et Méthodes
4.1. Matériels
4.1.1. Origine des réactifs
4.1.2. Souches de bactéries utilisées
4.1.3. Milieux de culture
4.1.4. Les plasmides utilisés
4.2. Methodes
4.2.1. Manipulation de l’ADN
4.2.1.1. Extraction de l’ADN génomique
4.2.1.2. Conditions d’amplification des gènes par PCR
4.2.1.3. Clonage des gènes amplifiés
4.2.1.4. Analyse des produits amplifiés
4.2.1.5. La transformation des produits clonés
4.2.1.6. Extraction et purification de l’ADN plasmidique
4.2.1.7. Digestion de l’ADN par les enzymes de restriction
4.2.1.8. Vérification des constructions plasmidiques
4.2.1.9. Mutagenèse dirigée
4.2.2. Manipulation sur la protéine
4.2.2.1. Système d’expression dans Escherichia coli
4.2.2.2. Expression des protéines et extraction
4.2.2.3. Purification des protéines
4.2.2.4. Détermination de la concentration protéique
4.2.2.5. Analyse qualitative des protéines purifiées
4.2.2.6. Immunoblot
4.2.2.7. Immunoprécipitation
4.2.2.8. Spectroscopie d’absorption
V-Références bibliographiques
VI-Annexes
1.Article I
2.Article II
3.Article III
4. Article IV
5. Article V
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