Etude des effets des extraits sur les fonctions rénales et hépatiques

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PROPRIETES PHARMACOLOGIQUES

Les AG sont des composés particulièrement intéressants en raison de leurs multiples activités biologiques telles que les activités anticancéreuses et antitumorales (Makarieva et al., 2012), antifongiques (Rubiolo et al., 2013), antibactériennes (Laville et al., 2009), anti-VIH (Hua et al., 2007), antimalariales et antiparasitaires (Hua et al., 2004), antileucémiques (Makarieva et al., 2011), anti-inflammatoires, antivirales et antidiabétiques (Carbone et al., 2017).
Les AG sont toxiques pour certains animaux. Par ailleurs, il existe peut-être un risque pour l’homme à très forte dose (Peirs, 2005).
Certains AG de synthèse présentent toutefois un réel intérêt, agissant comme catalyseurs, édulcorants puissants, désinfectants ou comme substances mimétiques de nucléotides, de sucres, de lipides et de peptides.

STRUCTURE ET CLASSIFICATION

Du point de vue structural, les flavonoïdes se répartissent en plusieurs classes de molécules. En effet, plus de 6400 structures ont été identifiées (Harborne et Wiliams, 2000). Ils ont en commun la structure du diphénylpropane à 15 atomes de carbone constitué de deux noyaux aromatiques (désignés par les lettres A et B), reliés par un hétérocycle oxygéné (désigné par la lettre C) (figure 10) (Dacosta, 2003).
D’une façon générale, les flavonoïdes se trouvent soit à l’état libre, auquel cas ils sont dits « aglycones », soit sous forme de « C- ou O-glycosides », auquel cas ils sont liés à des sucres tels que le glucose, le rhamnose, l’arabinose (Dacosta, 2003). Dans la plupart des cas, les flavonoïdes aglycones, notamment les flavonoïdes simples et polymethylés, sont présents sous forme de cires dans les feuilles, les écorces et les bourgeons floraux tandis que les flavonoïdes sous forme glycosidique sont plutôt présents dans les vacuoles des fleurs, des feuilles, des tiges ou des racines (Iwashina, 2000).
La famille des flavonoïdes peut se diviser en deux grands groupes : les flavonoïdes au sens strict et les isoflavonoïdes. (Bruneton, 2009).

LES FLAVONOÏDES AU SENS STRICT

Dans ce groupe se trouvent les chalcones, les aurones, les flavones, les flavonols, les flavanones, les flavanonols, les flavanes, les flavan-3-ols, et les flavyliums (figure 11, page 25). A l’exception des chalcones et des aurones, les flavonoïdes au sens strict dérivent d’une structure 1,3-diphénylpropane.

ACTIVITES ANTIBACTERIENNES

Les extraits éthanoliques de graines et de fleurs de C. juncea sont actifs contre Staphylococcus aureus, Escherichia coli ; Klebsiella pneumoniae ; Pseudomonas aeruginosa et Vibrio cholerae (Chouhan et Singh, 2010).
Le Cp-AMP, un peptide isolé de graines de C. pallida, est un agent antibactérien efficace contre Escherichia coli et Proteus sp (Pelegrini et al., 2009). En outre, les extraits méthanoliques de ses feuilles possèdent une activité significative contre Escherichia coli ; Klebsilla pneumoniae ; Pseudomonas aeruginosa ; Bacillus sp. et Staphylococcus aureus (Kiruthiga et al., 2014).
Les extraits méthanoliques de tiges et de graines de C. incana ont montré un effet antibactérien sur Staphylococcus aureus, Escherichia coli, Klebsiella pneumoniae et Salmonella typhi (Alemu et al., 2015).

ACTIVITES ANTIFONGIQUES

Les extraits méthanoliques de feuilles de C. quartiniana ont une activité antifongique contre C. albicans (Omori, 2011).
Les extraits aqueux de fruits de C. trichotoma ont montré une activité inhibitrice sur la croissance d’Alternaria solani, un champignon phytopathogène responsable des maladies nommées « brûlures alternariennes » chez les tomates (Ravikumar et al., 2013).
Les extraits aqueux de feuilles de C. juncea inhibent la croissance d’Aspergillus flavus, Aspergillus niger, Fusarium solani, et Rhizoctonia solani (Hussain et al., 2015).

PROPRIETES ANTIOXYDANTES

L’orientin et l’isoorientine, des composés isolés des extraits acétate d’éthyle de la partie aérienne de C. sessiliflora, ont montré une forte activité antioxydante (Mun’im et al., 2003).
Les extraits des organes de C. retusa ; C. pallida ; C. juncea ont aussi révélé des propriétés antioxydantes intéressantes (Govindappa et al., 2011 ; Devendra et al., 2012 ; Dinakaran et al., 2014).

PROPRIETES ANTI-INFLAMMATOIRES

L’acide crotalique, un triterpène isolé de la partie aérienne de C. emarginella, a présenté une activité anti-inflammatoire significative chez le rat. Son activité est similaire à celle de l’oxyphényl butazone, un anti-inflammatoire standard (Ahmed et al., 2006).
Les extraits méthanoliques de tiges de C. pallida et éthanoliques de racines de C. burhia ont montré une activité anti-inflammatoire (Weng et al., 2003 ; Talaviya et al., 2014).

PROPRIETES ANTICANCEREUSES

Les extraits éthanoliques de feuilles et de fleurs de C. agatiflora ont révélé une bonne activité anticancéreuse. Ils ont provoqué un signe d’apoptose et de nécrose dans la culture d’une lignée cellulaire cancéreuse HeLa (Le Roux et al., 2009).
Les extraits éthanoliques de racines de C. burhia ont montré une activité anti-cancéreuse chez la souris (Kataria, 2012).

PROPRIETES ANALGESIQUES

Les extraits méthanoliques de racines de C. burhia ont exercé une activité analgésique significative chez le rat et la souris. Cette activité est similaire à celle de l’aspirine et la morphine (Vyas et al., 2016).

PROPRIETES CYTOTOXIQUES

La madurensine et la doronénine, alcaloïdes isolés des extraits éthanoliques de feuilles de C. agatiflora, ont un effet cytotoxique sur les cellules cancéreuses U-937 (Le Roux et al., 2011).
Les extraits méthanoliques et éthanoliques de feuilles de C. juncea avaient un effet inhibiteur de 50% sur la prolifération des cellules HeLa (Khanra et al., 2015).

DETECTION DES FAMILLES CHIMIQUES

Un criblage phytochimique a été effectué sur les poudres de différents organes de chaque espèce de Crotalaria selon la méthode décrite au § 2.2.5 (pages 34-37) afin de déterminer les différentes familles chimiques présentes. Les résultats sont montrés dans le tableau 9 (pages 49-51).
D’après ces résultats, les différents organes des espèces de Crotalaria étudiés contenaient principalement des alcaloïdes, des flavonoïdes, des tanins et polyphénols, des stéroïdes, des triterpènes, des stérols insaturés et des désoxyoses. Les saponosides n’ont été trouvés que dans les feuilles de C. tanety et C. trichotoma ainsi que dans les graines de C. cleomifolia, C. spinosa, C. micans, C. pallida et C. spectabilis. Les leucoanthocyanes et les anthraquinones n’étaient présents que dans les graines de C. cleomifolia et les feuilles de C. tanety, respectivement. Les iridoïdes n’ont pas été détectés dans tous les différents organes.

EFFETS DES EXTRAITS SUR LES MICROORGANISMES

Un criblage des différentes espèces de Crotalaria à activité antimicrobienne s’avère nécessaire pour identifier les potentialités curatives intéressantes. Le but de cette partie est d’abord de déterminer si les extraits des organes de chaque espèce ont une activité antimicrobienne qui mérite d’être approfondie pour le développement de molécules à orientation thérapeutique et de justifier le bien-fondé scientifique de son utilisation médicinale.
A cet effet, des tests d’antibiogramme ont été réalisés. L’activité antimicrobienne de chaque EB a été évaluée sur 9 souches de bactéries (Gram (+) et Gram (-)) et une souche de levure selon la méthode de diffusion en milieu solide décrite au § 2.2.7.4 (pages 39 à 40).
Des disques pré-imprégnés d’antibiotique ont été utilisés comme témoin :
 acide nalidixique 30 μg : pour les bactéries Gram (-).
 netilmicine 30 μg : pour les bactéries Gram (+) et.
 nystatine 100 μg pour la levure.
Tous les tests ont été effectués en double et chaque extrait a été testé à raison de 1mg/disque. Les résultats obtenus exprimés en DHI (mm) sont résumés dans le tableau 12 (pages 56-57).

HABITAT ET REPARTITION GEOGRAPHIQUE (Polhill, 1982)

Crotalaria bernieri se rencontre fréquemment dans les savanes boisées, dans les terres abandonnées, dans les champs de maïs et manioc ainsi qu’au bord des routes et au voisinage des habitations.
Plante native de l’Île, elle pousse dans presque toutes les zones, à savoir : Antananarivo, Antsirabe, Betafo, Ankazobe, Alaotra, Moramanga, Sambirano. Mais elle est largement répandue dans les parties Ouest (Maevatanana) et Nord (Massif d’Ankarana, Massif de Bemaraha, Montagne d’Ambre) à partir de 800 à 1300 m d’altitude. Elle a été introduite dans plusieurs pays tropicaux comme les Comores, Kenya, Tanzanie, Ouganda et Mozambique.

RECOLTE ET IDENTIFICATION BOTANIQUE

C. bernieri a été récoltée à Ibity (Commune rurale d’Antsirabe, Région de Vakinankaratra), située à 175 Km au Sud d’Antananarivo avec les coordonnées GPS S : 20°03′46.2″, E : 046°59′27.9″. La collecte a été effectuée au mois d’Avril 2013, période durant laquelle la plante était au stade de fructification.
La plante a été identifiée par Roger Marcus POLHILL, Botaniste au Royal Botanic Gardens de Kew et un spécimen, sous la référence HERIZO R. 010, a été déposé à l’herbarium du Département de Biologie et Ecologie Végétale de la Faculté des Sciences de l’Université d’Antananarivo.

UTILISATIONS EMPIRIQUES

Les enquêtes menées auprès des villageois ont révélé que le décocté de feuilles de C. bernieri est utilisé traditionnellement pour soigner les maux de ventre et la diarrhée. En dehors de ses usages thérapeutiques, la plante entière est aussi utilisée pour nourrir les boeufs.
D’après la littérature, cette plante a été anciennement utilisée en teinturerie, d’où son appellation vernaculaire « ranomanja » de « rano » : eau, et « manja » : brune (http://www.ilerouge.org).

PREPARATION DES ORGANES

Les feuilles, les graines, les cosses et les racines de C. bernieri constituent les organes utilisés dans ce travail. Ils sont préparés selon la méthode décrite dans la deuxième partie, § 2.2.4.1 (page 33). Il faut noter que la majeure partie des travaux a été réalisée avec les feuilles, l’organe le plus disponible en quantité suffisante.

LES CONSOMMABLES UTILISÉS

Les produits chimiques ainsi que les solvants utilisés (de marque Prolabo®, Merck® ou NLabosi®) sont de qualité pure ou « pour analyse ».
Des plaques de gel de silice, 60 F254 Merck®, sur support en aluminium de dimensions 20 x 20 cm ont été utilisées pour la chromatographie sur couche mince (CCM) ; ces plaques peuvent être découpées aux dimensions voulues.
Du gel réticulé de dextrane (Sephadex ® LH-20, 25-100 μm; Pharmacia Biotech Ltd) et de silice RP8 (LiChroprep ® ; 25-40 μm ; Merck) ont été utilisés pour la chromatographie sur colonne.

Table des matières

PREMIERE PARTIE : SYNTHESE BIBLIOGRAPHIQUE
1.1 LES PLANTES MEDICINALES
1.1.1 GENERALITES
1.1.2 UTILISATIONS DES PLANTES MEDICINALES
1.1.3 LE POTENTIEL ANTIMICROBIEN DES PLANTES MEDICINALES
1.2 DONNEES SUR LES ESPECES DU GENRE Crotalaria
1.2.1 GENERALITES
1.2.2 DESCRIPTION BOTANIQUE
1.2.3 REPARTITION GEOGRAPHIQUE
1.2.4. LES ESPECES PRESENTES A MADAGASCAR
1.2.5 UTILISATIONS DES ESPECES DE Crotalaria DANS LE MONDE
1.2.5.1. Utilisations en alimentation humaine et animale
1.2.5.2. Utilisations en médecine traditionnelle
1.2.5.3. Autres utilisations
1.2.6. IMPORTANCE ECONOMIQUE DES ESPECES DE Crotalaria
1.3 TRAVAUX PHYTOCHIMIQUES ANTERIEURS SUR LE GENRE Crotalaria
1.3.1 GENERALITES SUR LES ALCALOIDES
1.3.1.1. Les alcaloïdes dérivés de la Pyrrolizidine (AP)
1.3.1.1.1. Définition
1.3.1.1.2. Structure
1.3.1.1.3. Toxicité
1.3.1.1.4. Propriétés pharmacologiques
1.3.1.1.5. Exemples d’AP isolés du genre Crotalaria
1.3.1.2. Les alcaloïdes dérivés de la Guanidine (AG)
1.3.1.2.1. Définition
1.3.1.2.2. Structure et classification
1.3.1.2.3. Propriétés pharmacologiques
1.3.2 GENERALITES SUR LES FLAVONOIDES
1.3.2.1. Définition
1.3.2.2. Structure et classification
1.3.2.2.1. Les flavonoïdes au sens strict
1.3.2.2.2. Les isoflavonoïdes
1.3.2.3. Propriétés pharmacologiques
1.3.2.4. Exemples de flavonoïdes isolés du genre Crotalaria
1.4. DONNEES SUR LA TOXICITE DU GENRE Crotalaria
1.4.1. TOXICITE CHEZ LES ETRES HUMAINS
1.4.2. TOXICITE CHEZ LES ANIMAUX
1.5. PROPRIETES PHARMACOLOGIQUES DES Crotalaria
1.5.1. PROPRIETES ANTIMICROBIENNES
1.5.1.1. Activités antibactériennes
1.5.1.2. Activités antifongiques
1.5.2. PROPRIETES ANTIOXYDANTES
1.5.3. PROPRIETES ANTI-INFLAMMATOIRES
1.5.4. PROPRIETES ANTICANCEREUSES
1.5.5. PROPRIETES ANALGESIQUES
1.5.6. PROPRIETES CYTOTOXIQUES
1.5.7. PROPRIETES ANTIPARASITAIRES
1.5.7.1. Activité anti-Leishmaniose
1.5.7.2. Activité anthelminthique
1.5.7.3. Activité nématicide
DEUXIEME PARTIE : ETUDES PRELIMINAIRES DES DIFFERENTES ESPECES DE Crotalaria PRESENTES A MADAGASCAR
2.1. INTRODUCTION
2.2. MATERIELS ET METHODES
2.2.1. ENQUETES ETHNOBOTANIQUES ET COLLECTE DES ECHANTILLONS
2.2.2. MATERIELS D’ETUDE
2.2.3. IDENTIFICATION BOTANIQUE
2.2.4. PREPARATION DES EXTRAITS
2.2.4.1. Préparation du matériel végétal
2.2.4.2. Préparation des extraits bruts
2.2.5. DETERMINATION DES FAMILLES CHIMIQUES
2.2.5.1. Détection des alcaloïdes
2.2.5.2. Détection des flavonoïdes (Test de WILLSTÄTTER)
2.2.5.3. Détection des leucoanthocyanes (Test de BATE-SMITH)
2.2.5.4. Détection des saponosides (Test de mousse)
2.2.5.5. Détection des tanins et polyphénols
2.2.5.6. Détection des désoxyoses (Test de KELLER-KILIANI)
2.2.5.7. Détection des iridoïdes
2.2.5.8. Détection des anthraquinones (Test de BORNTRAGER)
2.2.5.9. Détection des stéroïdes et triterpènes
2.2.6. ETUDE DES EFFETS DES EXTRAITS SUR LES SOURIS
2.2.6.1. Les souris
2.2.6.2. Méthodes utilisées dans l’étude de la toxicité aigüe chez la souris
2.2.6.2.1. Administration de l’extrait à tester
2.2.6.2.2. Observation des symptômes
2.2.7. ETUDE DES EFFETS DES EXTRAITS SUR LES MICROORGANISMES
2.2.7.1. Les milieux de culture
2.2.7.2. Les germes
2.2.7.3. Les antibiotiques de référence
2.2.7.4. Etude du spectre d’activité antimicrobienne
2.3. RESULTATS
2.3.1. ENQUETES ETHNOBOTANIQUES
2.3.1.1. Les différents sites d’enquête
2.3.1.2. Les différentes espèces de Crotalaria inventoriées
2.3.1.3. Choix des matériels d’étude
2.3.2. DETECTION DES FAMILLES CHIMIQUES
2.3.3. EXTRACTION
2.3.4. EFFETS DES EXTRAITS SUR LA SOURIS
2.3.5. EFFETS DES EXTRAITS SUR LES MICROORGANISMES
2.4. DISCUSSION ET CONCLUSION
2.5. PERSPECTIVES
TROISIEME PARTIE : ETUDE DE Crotalaria bernieri Baill.
Chapitre 1: ETUDE CHIMIQUE
1.1. INTRODUCTION
1.2. MATERIELS ET METHODES
1.2.1. MATERIEL D’ETUDE
1.2.1.1. Position Systématique
1.2.1.2. Description botanique
1.2.1.3. Habitat et répartition géographique
1.2.1.4. Récolte et identification botanique
1.2.1.5. Utilisations empiriques
1.2.1.6. Préparation des organes
1.2.2. LES CONSOMMABLES UTILISES
1.2.3. METHODE D’EXTRACTION
1.2.3.1. Préparation des extraits
1.2.3.2. Extraction des alcaloïdes totaux
2.2.6.2.1. Extraction des alcaloïdes totaux à partir de la poudre de feuilles
2.2.6.2.2. Extraction des alcaloïdes totaux à partir de l’EMF
1.2.4. PURIFICATION DES ALCALOIDES
1.2.4.1. Chromatographie préparative
1.2.4.1.1. Chromatographie liquide sur colonne à pression atmosphérique
1.2.4.1.2. Chromatographie liquide sur colonne à haute performance
1.2.5. METHODES ANALYTIQUES
1.2.5.1. Chromatographie sur couche mince (CCM)
1.2.5.2. Détermination des familles chimiques
1.2.4. CALCUL DU RENDEMENT D’EXTRACTION ET DE PURIFICATION
1.3. RESULTATS
1.3.1. EXTRACTION
1.3.1.1. Les extraits bruts d’organes
1.3.1.2. Les alcaloïdes totaux
1.3.2. LES FAMILLES CHIMIQUES PRESENTES DANS LES EXTRAITS
1.3.3. PURIFICATION DES ALCALOIDES
1.3.3.1. Chromatographie de l’EAT sur colonne de gel sephadex ® LH-20
1.3.3.2. Chromatographie de la fraction AT2 sur colonne de silice RP8
1.3.3.3. Purification de AT2 par HPLC
1.4. DISCUSSION ET CONCLUSION
Chapitre 2: DETERMINATION STRUCTURALE DES COMPOSES ISOLES
2.1. INTRODUCTION
2.2. MATERIEL ET METHODES
2.2.1. ACTIVITE OPTIQUE
2.2.2. SPECTROMETRIE DE MASSE
2.2.3. SPECTROMETRIE DE RMN
2.2.3.1 Les spectres monodimensionnels (1D)
2.2.3.2 Les spectres bidimensionnels (2D)
2.3. RESULTATS ET DISCUSSION
2.3.1. STRUCTURE DU COMPOSE C1
2.3.2. STRUCTURE DU COMPOSE C2
2.3.3. STRUCTURE DU COMPOSE C3
2.4. DISCUSSION ET CONCLUSION
Chapitre 3: ETUDE DES EFFETS DES EXTRAITS SUR LES ANIMAUX
3.1 INTRODUCTION
3.2. MATERIEL ET METHODES
3.2.1. MATERIELS
3.2.1.1. Les animaux d’expérimentation
3.2.1.1.1. Les souris
3.2.1.1.2. Les poussins
3.2.1.1.3. Les têtards de grenouille
3.2.1.1.3. Les alevins de poisson
3.2.1.1.3. Les puces
3.2.1.2. Les extraits utilisés
3.2.2. METHODES
3.2.2.1. Etude de la toxicité aigüe chez la souris
3.2.2.1.1. Voies d’administration des extraits
3.2.2.1.2. Détermination de la DL50 chez la souris
3.2.2.2. Etude des lésions anatomo-pathologiques
3.2.2.2.1. Prélèvement et fixation des organes
3.2.2.2.2. Inclusion
3.2.2.2.3. Microtomie et étalement des coupes
3.2.2.2.4. Coloration des coupes et montage des lames
3.2.2.3. Etude des effets des extraits sur les fonctions rénales et hépatiques
3.2.2.3.1. Détermination enzymatique du taux d’ALAT dans le sang
3.2.2.3.2. Détermination enzymatique du taux d’ASAT dans le sang
3.2.2.3.3. Dosage de la créatinine
3.2.2.3.4. Dosage de l’urée
3.2.2.4. Etude des effets des extraits sur les poussins
3.2.2.5. Etude des effets des extraits sur les animaux à sang froid
3.2.2.6. Etude des effets des extraits sur les puces
3.3. RESULTATS
3.3.1 EFFETS DES EXTRAITS SUR LA SOURIS
3.3.1.1. Effets des extraits des différents organes de la plante
3.3.1.2. Les symptômes d’intoxication selon la voie d’administration
3.3.1.2.1. Voie intrapéritonéale
3.3.1.2.2. Voie sous-cutanée
3.3.1.2.3. Voie orale
3.3.1.3. Détermination de la DL50 de l’EMF sur souris
3.3.1.4. Effets des extraits et fractions partiellement purifiés sur les souris
3.3.1.4.1. Effets des alcaloïdes totaux (EAT) et non alcaloïdes totaux (nEAT)
3.3.1.4.2. Effets des fractions obtenues par chromatographie sur gel LH20
3.3.1.4.3. Evolution de la toxicité des extraits
3.3.1.5. Lésions anatomo-pathologiques
3.3.1.5.1. Lésions macroscopiques
3.3.1.5.2. Lésions microscopiques
3.3.1.6. Effets de l’EMF sur les fonctions hépatiques et rénales
3.3.2. EFFETS DE L’EMF SUR LES POUSSINS
3.3.3 EFFETS DE L’EMF SUR LES ANIMAUX A SANG FROID
3.3.3.1. Effets de l’EMF sur les têtards de grenouille
3.3.3.2. Effets de l’EMF sur les alevins de poisson
3.3.3.2. Effets de l’EMF sur les puces
Chapitre 4 : ETUDE DES EFFETS DES EXTRAITS SUR LES MICROORGANISMES
4.1 INTRODUCTION
4.2 MATERIEL ET METHODES
4.2.1 MATERIELS
4.2.1.1. Les milieux de culture
4.2.1.2. Les microorganismes
4.2.1.4. Les extraits utilisés
4.2.2 ETUDE DU SPECTRE D’ACTIVITE ANTIMICROBIENNE
4.2.2.1. Activités antibactériennes et antilevuriennes
4.2.2.2. Activité antimoisissure
4.3. RESULTATS
4.3.1. ACTIVITE ANTIMICROBIENNE DES EXTRAITS BRUTS DE DIFFERENTS ORGANES DE LA PLANTE EN MILIEU SOLIDE
4.3.2. ACTIVITE ANTIMICROBIENNE DES ALCALOIDES TOTAUX ET DES FRACTIONS PURIFIEES EN MILIEU SOLIDE
4.3.3. DETERMINATION DES CMI, CMB ET CMF EN MILIEU LIQUIDE
4.4. DISCUSSION ET CONCLUSION
REFERENCES BIBLIOGRAPHIQUES ET WEBOGRAPHIQUES

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