Etude des composes phenoliques de tephrosia deflexa

IDENTIFICATION DES COMPOSES PHENOLIQUES

Des méthodes chromatographiques sont utilisées pour :
• contrôler la pureté des produits obtenus,
• avoir des indications sur la fluorescence, les Rf dans divers systèmes.

La fluorescence d’un flavonoïde examiné sous lumière UV à 365 nm et la coloration ou la fluorescence obtenue avec des réactifs spécifiques donnent des indications sur la nature des aglycones et, parfois, sur la position des substituants (Marbry, 1970).

La spectroscopie UV est utilisée pour la détermination structurale des flavonoïdes purs. Le spectre UV des flavonoïdes en solution dans le méthanol ou l’éthanol présente généralement deux maxima :
• Le premier situé entre 320 et 360 nm, bande I, dû au chromophore cinnamoyle résultant de la conjugaison du noyau B avec le carbonyle.
• Le second situé entre 240 et 285 nm, bande II, dû au chromophore benzoyle résultant de la conjugaison du noyau A avec le carbonyle.

Trois cas peuvent se présenter :
a- les deux chromophores cinnamoyle et benzoyle seront d’égale importance. Le spectre composé des bandes I et II toutes deux intenses. Il peut s’agir d’une flavone ou d’un flavonol. La position de la bande I permet de les distinguer :
• dans le cas d’une flavone, la bande I se situe entre 304 et 350 nm
• pour le flavonol, la bande I est déplacée vers les grandes longueurs d’ondes : 360 à 385 nm. La substitution de l’hydroxyle en 3 d’un flavonol provoque un effet hypsochrome sur la bande I qui ramène celle-ci entre 345 et 365 nm.

La bande II permet dans une certaine mesure de connaître le nombre d’hydroxyle du noyau B ; une monosubstitution en 4’ se traduit par un pic unique entre 265 et 270 nm. Une orthodisubstitution se traduit par deux pics ou par un pic suivi d’une inflexion situés respectivement vers 255 nm et 268 nm et une trisubstitution par un pic et un épaulement de position variable entre 250 et 270 nm.

b- L’absorption de type cinnamoyle prédomine : la bande I est intense et déplacée vers les grandes longueurs d’onde. La bande II est mineure. Il peut s’agir d’une chalcone ou d’une aurone. La bande I des chalcones se situe le plus souvent entre 340 et 390 nm. Un hydroxyle en 2’ et/ou en 4 déplace très nettement la bande I vers les grandes longueurs d’onde :

Exemple : 2-OH-chalcone : absorption maximale : bande I à 346 nm 2, 2’, 4-trihydroxychalcone présente le maximum d’absorption pour la bande I à 391 nm.

Dans le cas des aurones, la bande I est située entre 370 et 430 nm. Un hydroxyle libre en 4’ provoque un déplacement bathochrome important de la bande I.

c- L’absorption de type benzoyle prédomine : le spectre comporte une bande intense entre 240 et 285 nm et une bande I à peine marquée vers 330nm. Il s’agit de flavonoïdes à noyaux A et B non conjugués, comme dans le cas des flavanones et des flavanonols.

Contrairement aux flavones, l’introduction d’un hydroxyle sur le noyau B ne modifie guère le spectre d’une flavanone dû à l’absence de conjugaison des noyaux A et B. Une flavanone et le flavanonol correspondant présenteront des spectres UV-visible presque identiques.

Flavonoïdes ne possédant pas de carbonyle dans leur hétérocycle

La conjugaison ou non de deux cycles A et B influe également sur l’allure du spectre UV-visible de la molécule. Deux cas peuvent se présenter :
a- Une bande I intense vers 465 à 550 nm accompagnée d’une bande II de faible intensité située entre 270 et 280 nm ; le produit est coloré en rouge : il s’agit d’anthocyanidine. Les noyaux A et B sont conjugués.
b- Une bande d’absorption peu intense vers 280 nm ; les deux noyaux phénoliques A et B ne sont pas conjugués : il s’agit de flavan-3-ol (catéchol) ou flavan-3,4-diols appelés proanthocyanidines ou leucoanthocyanidines.

Le spectre est caractéristique de l’aglycone et n’est pas affecté par la nature des molécules glucidiques. L’emploi de réactifs spécifiques permet de localiser les groupements hydroxyles sur la molécule.

L’addition d’hydroxyde de sodium provoque l’ionisation de tous les hydroxyles du noyau flavonique et permet la détection d’un hydroxyle en 4’. On constate alors un déplacement bathochrome de la bande I de l’ordre de 40 à 60 nm par rapport au spectre dans le méthanol, sans diminution de l’intensité du pic.

Le chlorure d’aluminium (AlCl3) peut former des complexes avec les deux hydroxyles libres en ortho (complexes labiles en milieu acide) ou des complexes avec le carbonyle en 4 et un hydroxyle en 5 ou en 3 (complexes stables en milieu acide).

L’action chélatant de AlCl3 se traduit par un effet bathochrome par rapport au spectre méthanolique. On compare dans un premier temps les spectres enregistrés en présence de AlCl3 puis en présence de AlCl3+HCl : Un déplacement hypsochrome de la bande I provoqué par l’addition de HCl est significatif d’un système orthohydroxylé dans la molécule .

Dans un deuxième temps, on compare le spectre révélé en présence de AlCl3+HCl à celui dans la solution méthanolique : Un déplacement bathochrome de la bande I est caractéristique de la présence d’un hydroxyle libre au voisinage du carbonyle en 4 (C-3 ou C-5).

L’addition d’acétate de sodium, base faible, ionise les groupes hydroxyles les plus acides, dont l’hydroxyle en position 7. Un déplacement bathochrome de la bande II de 5 à 20 nm indique la présence d’un hydroxyle en 7.

L’acide borique en présence d’acétate de sodium forme avec les groupements orthodihydroxylés (en 3’ et 4’) des complexes qui provoquent un déplacement bathochrome de la bande I de 12 à 20 nm. Si le spectre obtenu est voisin de celui de la substance en solution dans le méthanol, on peut conclure à l’absence de groupement orthodihydroxyle (Mabry, 1970).

Spectres RMN 

L’étude est réalisée selon les méthodes spectroscopiques RMN mono et bidimensionnelle (RMN 1 H, RMN 13C, COSY, HMQC, HSQC, HMBC…). Les spectres des composés sont généralement enregistrés en solution dans le diméthylsulfoxyde deutéré (DMSO-d6) et parfois dans le méthanol deutéré (CD3OD) pour éviter que les spectres ne soient dominés par les signaux du solvant. Dans les spectromètres modernes, on n’a pas besoin d’ajouter une référence telle que (CH3)4Si car ils peuvent utiliser le signal du solvant comme référence. Ceci est également valable pour le 13C. Les déplacements chimiques δ 1H et 13C de quelques solvants usuels sont consignés dans le tableau ci dessous. La multiplicité est donnée entre parenthèses : 1 pour singulet, 2 pour doublet, 3 pour triplet, etc.

La RMN est une technique basée sur l’absorption du rayonnement électromagnétique par la matière. Lorsque les noyaux à spin non nul (1 H, 13C, 15N, 17O, 19F et 31P) sont placés dans un champ magnétique, ils peuvent prendre différentes orientations, et à chacune de ces orientations il correspondra un niveau énergétique donné. Il existe des valeurs particulières du champ magnétique et de la fréquence pour lesquelles les noyaux entrent en résonance. La RMN consiste à faire varier l’orientation en induisant les transitions entre les différents niveaux énergétiques.

Table des matières

INTRODUCTION
PREMIERE PARTIE
I GENERALITES SUR LES PAPILIONACEES ET SUR LE GENRE TEPHROSIA
I.1 Tephrosia
I.1.1. Systématique botanique
I.1.2. Caractères botaniques
I.2. Caractéristiques de Tephrosia deflexa Bak
I.3. Caractéristiques de Tephrosia albifoliolis A. Nongonierma et T. Sarr
I.4 Utilisations de quelques Tephrosia
II. FLAVONOIDES
II.1. Les flavonols
II.2. Les flavones
II.3. Les flavanones
II.4. Les flavan-3-ols
II.5. Anthocyanidines
II.6. Isoflavonoïdes
II.7. Propriétés biologiques
DEUXIEME PARTIE: ETUDE PHYTOCHIMIQUE
III. IDENTIFICATION DES COMPOSES PHENOLIQUES
IV. ETUDE DES COMPOSES PHENOLIQUES DE TEPHROSIA DEFLEXA
IV.1 Extraction et purification des composés phénoliques
IV.1.1. Extraction
IV.1.2. Caractérisation des composés phénoliques
IV.1.3. Isolement des composés phénoliques
IV.1.3. Extractions des feuilles de Tephrosia deflexa au soxhlet
IV.1.4. Isolement et purification des composés TDFng et TDFn8-4
IV.2 .RESULTATS ET DISCUSSION
IV.2.1. Elucidation structurale du composé 1 (TA1)
IV.2.2. Elucidation structurale du composé 2 (TDF-d2)
IV.2.2. Elucidation structurale du composé 2 (TDF-d2)
IV.2.3. Elucidation structurale du composé 3 (TDF-d3)
IV.2.4. Elucidation structurale du composé 4 (TDF-d4)
IV.2.5. Elucidation structurale du composé 5 (TDFng)
IV.2.6. Elucidation structurale du composé 6 (TDF n8-4)
V Etudes des composés phénoliques de Tephrosia albifoliolis
V.1. Matériel végétal
V.2. Extraction et isolement
V.3. RESUTATS ET DISCUSSION
V.3.1. Elucidation structurale du composé 7 (TSO2)
V.3.2. Elucidation structurale du composé 8 (Ta-d6)
V.3.3. Elucidation structurale du composé 9 (Tab9-3)
V.3.4. Elucidation structurale du composé 10 (Ta-c7)
V.3.5. Elucidation structurale du composé 11 (Ta-e3)
V.3.6. Elucidation structurale du composé 12 (Ta-g2)
CONCLUSION
ANNEXES
VI. MATERIEL ET METHODES
VI.1. Matériel végétal
VI.2. Broyage
VI.3. Extraction
VII. CHROMATOGRAPHIE
VII.1. Contrôle CCM
VII.1.1 Supports
VII.1.2 Systéme support-solvant utilisés en CCM
VII.1.3. Révélateurs
VII.2. Chromatographie sur colonne ouverte
VII.3. Chromatographie préparative sur plaques
VII.4. Chromatographie liquide haute performance (CLHP)
VII.4.1. CLHP analytique
VII.4.2. CLHP analytique couplée à un détecteur UV à barrette de diodes
VII.4.3. CLHP préparative
VII.5. Colonne de Sephadex® LH-20

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