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Reproduction des levures
Les levures présentent un mode de reproduction bien particulier. Elles se multiplient aussi bien par voie asexuée (végétative) que par voie sexuée (sporulation) en fonction des conditions favorables ou défavorables du milieu (Larpent et Larpent-Gourgaud, 1990). Pour la plupart des levures, la reproduction asexuée est la forme majeure de multiplication (Bonaly, 1991). Cette dernière s’effectue par bourgeonnement ou par fission (scissiparité) à partir d’une cellule mère. La figure2 ci-après représente la reproduction asexuée des levures.
Figure 2 : Division de cellules levuriennes par bourgeonnement (Source : Leclerc et al) La reproduction sexuée s’effectue par conjugaison de deux cellules haploïdes donnant naissance à un zygote formant après différenciation et méiose un asque à 4 ascospores.
Toutefois, les populations levuriennes connaissent un cycle de vie complexe, dans lequel on trouve alternativement des cellules haploïdes et des cellules diploïdes. La figure3 ci-dessous représente le cycle de reproduction des levures.
Le métabolisme
Les levures présentent une grande diversité métabolique dans leur façon de produire et de consommer l’énergie à partir de substrats dégradés. La majorité des levures sont capables de dégrader le glucose, le fructose et le mannose en présence d’oxygène, par un métabolisme oxydatif conduisant à la formation de CO2 et H2O (Pol, 1996). En plus des sucres simples, certaines levures utilisent d’autres glucides (mono, di ou tri saccharides et des polysaccharides comme l’amidon), mais aussi des alcools, des acides et des alcanes (Larpent, 1991).
La dégradation de la plupart des glucides se fait par glycolyse, qui convertit les sucres en pyruvate. La destinée du pyruvate dépend à la fois du sucre utilisé et de l’espèce de levure considérée. En prenant l’exemple du catabolisme du pyruvate formé à partir du glucose, on distingue deux types de métabolisme (Botton, 1991) :
Le métabolisme oxydatif : les levures utilisent le glucose en présence d’oxygène, par conséquent ce métabolisme est exclusivement respiratoire et le pyruvate est oxydé par le cycle de Krebs. Cette voie métabolique est très énergétique et permet une multiplication importante des levures. L’équation bilan de la respiration se résume ainsi : C6H12O6 + 6O2 → 6CO2 + 6H2O + 36 ATP.
Le métabolisme fermentaire : en plus du métabolisme oxydatif, les levures privilégient le métabolisme fermentaire pour dégrader les glucides en absence d’oxygène conduisant à la formation d’éthanol et de CO2. Hormis ces composés majoritaires, des alcools, des aldéhydes, des esters et des acides sont formés en plus petites quantités. Ce métabolisme est moins énergétique que le métabolisme oxydatif (Guiraud et Rosec, 2004) et l’équation bilan est : C6H12O6 —> 2C2H5OH + 2CO2 + 2 ATP.
Utilisations des levures en biotechnologie
Grâce à un métabolisme diversifié, les levures occupent une place centrale quant à leurs utilisations en biotechnologie. Elles participent à l’élaboration de nombreux produits alimentaires (panification, fromagerie, brasserie,), la production d’enzymes (invertase, lactase, lipase, amylase,), d’alcool (glycérol,), de vitamines et de solvants ainsi que certaines molécules d’intérêt médical mais aussi à la valorisation de déchets agricoles, industriels et à la production des protéines (Scriban, 1984 ; Lecterc et al., 1995). Ces différentes utilisations sont résumées dans la figure4 ci-dessous.
Symbiose microorganisme-plante
Le mot symbiose, selon Heinrich Anton Bary (1879), vient du latin « syn » (ensemble) et biosis (vivant) et signifie littéralement « vivant ensemble » ; ce qui suppose au moins deux partenaires. Dans notre contexte, il s’agit de micro-organisme (bactéries, champignons, protozoaires…) et de plante servant d’hôte.
Dans les écosystèmes, la matière carbonée provient, directement ou non, d’organismes autotrophes pour le carbone. La modalité d’autotrophie la plus répandue dans la biosphère actuelle est la photosynthèse des plantes.
Or, la majorité des champignons (les levures en particuliers) et des bactéries du sol est hétérotrophe. Pour assurer leurs besoins carbonés, la plupart de ces micro-organismes établit Principaux Composants Composition en élément pour 100 g Glucides 4,80 g Fibres alimentaires des relations avec des phototrophes (les plantes en l’occurrence) sur lesquels ils prélèvent de la matière carbonée. Ce type de relation entre les deux organismes est appelé symbiose.
Dans notre approche, la symbiose est considérée au sens large et originel incluant des associations favorables ou négatives, et ce bien qu’il soit souvent utilisé pour des associations étroites et positives. Les associations favorables (ou positives) sont profitables aux deux ou à l’un des deux partenaires. Ainsi, lors de l’association champignon-plante (mycorhize), les réseaux d’hyphes fongiques, spécialisés dans l’absorption des minéraux du sol et de l’azote organique, agissent comme une extension du système racinaire, augmentant ainsi l’assimilation par la plante de nutriments essentiels tels que le phosphore, l’azote, le soufre et l’eau (Smith et Read, 2008). A travers cette symbiose, les espèces végétales sont en mesure d’acquérir des capacités métaboliques leur permettant l’utilisation de niches écologiques inaccessibles auparavant. Les champignons peuvent obtenir de leur hôte des sucres dérivés de la photosynthèse, et ce jusqu’à environ 20% des éléments carbonés issus des plantes terrestres leur sont alloués (Högberg et al, 2001). Par contre, les associations négatives en font bénéficier seulement le micro-organisme qui parasite l’hôte, voire même jusqu’à sa disparition.
Mutualisme
Il s’agit d’une association qui profite aux deux partenaires (plante et microorganisme). Elle se caractérise par le fait qu’elle est obligatoire, il y a donc une dépendance. En général, elle nécessite une adaptation de part et d’autre. Ainsi, les caractères spécifiques sont inscrits dans les gènes des deux partenaires. Par exemple, 40% du carbone de la plante (glucose, fructose) passe dans le micro-organisme. Ce dernier sécrète des enzymes (phosphatases) et des protons, qui protègent la plante contre des parasites.
Protocoopération
Comme le mutualisme, l’association est bénéfique pour les deux partenaires, mais elle n’est pas obligatoire, chacun peut avoir une vie indépendante.
Commensalisme
Le commensalisme correspond à un type de relation où une espèce en exploite une autre, mais sans établir de relation de nature parasitaire. Ce type de relation nécessite une certaine proximité dans l’espace des deux partenaires ; l’un utilise les substances nutritives produites en excès par l’hôte.
Parasitisme
Cette association lèse l’un des partenaires, mais ne le tue pas forcément. Le parasite tire profit de son hôte d’un point de vue trophique et facilite ainsi sa recherche dans les sources de nourriture. Ce type d’interaction oppose les deux organismes et l’un lutte constamment pour se débarrasser de l’autre. Toutefois, si l’hôte meurt, le parasite ne peut plus se développer ni se multiplier et disparaît à son tour.
Préparation de la suspension mère (norme : NFV 08 002)
La préparation de la suspension mère (SM) est réalisée suivant les directives de la norme NFV 08 002 en vue d’un examen microbiologique. Les manipulations se font de manière aseptique sous hotte à flux laminaire.
25g de l’échantillon de carotte à analyser, découpés en petite tranche sont mis en suspension dans 250 ml de NaCl 9%0 dans un ballon. La solution est ensuite homogénéisée manuellement pendant 10 à 15 minutes.
Préparation des dilutions décimales (norme : NFV 08 010)
Une dilution en cascade est réalisée à partir de la suspension mère (SM) dans des tubes stériles contenant au préalable 9ml d’eau distillée. 1ml de la SM est introduit dans un tube (c’est la dilution 10-1) puis 1ml de ce mélange est ensuite versé dans un autre tube (c’est la dilution 10-2) et ainsi de suite jusqu’à la dilution 10-4 (dilution finale).
Dénombrement de la flore fongique (norme : NFV 08 059)
La flore fongique est formée par les levures et les moisissures.
Principe
Le milieu sélectif pour ces germes est le milieu Sabouraud additionné de Chloramphénicol 5%. La plupart des levures sont aéro-anaérobies facultatives donc peuvent se développer aussi bien en surface qu’en profondeur. La technique d’ensemencement en profondeur a été privilégiée pour la mise en culture de l’inoculum provenant de la suspension mère ou de sa dilution. Le dénombrement concerne toutes les colonies formées sur le milieu.
Mode opératoire
1ml de l’inoculum provenant de la suspension mère, ou de la dilution 10-1, est ensemencé en profondeur dans une boite de Pétri stérile. Le milieu Sabouraud-Chloramphénicol 5% est ensuite versé dans la boite contenant l’inoculum. Le dénombrement est effectué en deux exemplaires. Les boites de Pétri sont alors incubées à 30°C pendant 48h.
Ainsi, les colonies formées lors de l’ensemencement sur boite de Pétri de la suspension mère et de sa dilution sont dénombrées. Seules les boites présentant moins de 300 colonies et plus de 15 colonies sont retenues.
Pour le milieu Hajna-Kligler
Les résultats montrent que la souche AMC1 est capable d’utiliser le lactose et de fermenter le glucose. L’utilisation du lactose et la fermentation du glucose se traduisent par une coloration jaune du culot (pour le glucose) et de la pente (pour le lactose). Cette fermentation du glucose s’accompagne d’une production de gaz qui se manifeste par la formation de poches de bulles sur les parois. L’absence de précipité noire dans le milieu montre qu’il n’y a aucune production de sulfure d’hydrogène.
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Table des matières
Première partie : Synthèse bibliographique
I. Généralités sur les levures
I.1. Caractéristiques microbiologiques des levures
I.1.1. Classification des levures
I.1.2. Habitats
I.1.3. Morphologie et structure
I.1.4. Reproduction des levures
I.2. Physiologie et croissance des levures
I.2.1. Les besoins nutritifs
I.2.2. Les conditions physicochimiques de croissance
I.2.3. Le métabolisme
I.3. Utilisations des levures en biotechnologie
II. La Carotte : Daucus carota
II.1. Historique
II.2. Description botanique
II.2.1. Systématique de la plante de carotte
II.2.2. Morphologie
II.2.3. Ecologie
II.3. Propriétés nutritives
III. Symbiose microorganisme-plante
III.1. Mutualisme
III.2. Protocoopération
III.3. Commensalisme
III.4. Parasitisme
Deuxième partie : Matériels et méthodes
I. MATERIELS
I.1. Matériel végétal
I.2. Matériels de laboratoire
I.3. Milieux d’étude
II. METHODES
II.1. Récolte de la carotte
II.2. Isolement et dénombrement des levures
II.2.1. Préparation de la suspension mère
II.2.2. Préparation des dilutions décimales
II.2.3. Dénombrement de la flore fongique
II.3. Purification
II.4. Conservation
II.5. Identification des levures
II.5.1. Etude des caractères morphologiques et culturaux
II.5.1.1 Observation macroscopique
II.5.1.2. Observation microscopique
A.) Examen à l’état frais
B.) Examen après coloration Gram
II.5.2. Etude des caractères physiologiques
A.) Type respiratoire
II.5.3. Etude des caractères physiques
A.) Comportement vis-à-vis de la température
II.5.4. Etude des caractères biochimiques
A.) Test sur milieu Hajna-Kligler
B.) Test sur milieu citrate de Simmons
C.) Test sur milieu lysine-fer
D.) Test sur milieu Mannitol-Mobilité
E.) Auxanogramme du carbone
Troisième partie : Résultats et discussions
I. Résultats
I.1. Dénombrement de la flore fongique
I.2. Purification
I.3. Identification
I.3.1. Etude des caractères culturaux
I.3.2. Etude des caractères morphologiques
I.3.3. Etude des caractères physiques et physiologiques
A.) Comportement vis-à-vis de la température
B.) Type respiratoire
I.3.4. Etude des caractères biochimiques
I.3.5. Identification proprement dite
II. Discussions
CONCLUSIONS ET PERSPECTIVES
REFERENCES BIBLIOGRAPHIQUES
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