Soutenance mémoire
Rappels bibliographiques
Les espèces de microorganismes utilisées sont les suivantes: une bactérie Gram positif (Staphylococcus aureus de la famille des Micrococaceae) et des bactéries Gram négatif (Escherichia coli, Salmonella anatum, et Salmonella cholerae suis de la famille des Enterobacteriaceae). Le Staphylocoque est un microbe du pus et répond aux caractéristiques suivantes :
-Cocci groupés en grappe de raisins
-Gram positif
-Sécrète une toxine
-Aérobie facultatif
Escherichia coli, Salmonella anatum, et Salmonella cholerae suis appartiennent à la famille des Enterobacteriaceae et sont définies par les caractéristiques suivantes : [WILFRID, 1963]
-Bacilles à Gram négatif, long de 2 à 3 µm et large de 0.6 µm
-Aéro-anaérobies
-Mobiles ou immobiles
-Facilement cultivables
-Fermentent le glucose
-Réduisant les nitrates en nitrites
-Dépourvus d’oxydase
Test d’antagonisme et de synergie utilisant des disques
Les activités d’un antibiotique de référence et d’une substance antibactérienne sont étudiées séparément puis ensemble sur la croissance d’un germe donné. Lorsque l’antibiotique et la substance sont testés ensemble, leurs activités peuvent s’amplifier (synergie) ou diminuer (antagonisme) comparées à celles observées lorsqu’elles sont testées séparément. Nous utilisons pour ce faire des disques « non imprégnés » de cellulose de 6 mm de diamètre (produits par Institut Pasteur Production) : 15 µl de la solution à tester sont déposées sur le disque que l’on met ensuite à sécher avant de le disposer sur le milieu d’essai. Lorsque les diamètres d’inhibition de chaque substance témoin (antibiotique de référence) et essai (substance à tester) sont obtenus, nous avons réalisé un nouveau test en plaçant les 2 disques témoin et essai à une distance égale à la moyenne de leurs diamètres d’inhibition, et comparé les résultats obtenus lorsque les 2 substances (témoin et essai) sont testées séparément avec ceux de leurs effets combinés. Deux effets peuvent en résulter :
-Il existe un antagonisme si l’association diminue l’activité de l’un ou de l’autre agent antimicrobien.
-Il y a synergie si l’effet de l’association est supérieur à la somme des effets pris séparément.
Test d’antagonisme par la méthode de diffusions croisées (méthode des bandelettes) [STEPHEN, 1978]
Une bandelette chargée d’antibiotique de référence et une bandelette chargée de substance supposée avoir une interférence avec l’action de l’antibiotique de référence (antagoniste) sont disposées en position croisée sur le milieu d’essai préalablement ensemencé de germe-test. S’il n’y a pas antagonisme, la zone d’inhibition de l’antibiotique de référence sera linéaire le long de la bandelette. Mais lorsque la substance essai est un antagoniste de l’antibiotique, une ligne diagonale se formera.
CONCLUSION GENERALE
Ce travail a eu pour objectif la contribution à une caractérisation des activités antibactériennes de Canarium madagascariense. D’abord, nous avons effectué l’étude de la toxicité aiguë car il est nécessaire que l’activité apparaisse à des doses pour lesquelles la toxicité est négligeable. Les doses qui tuent les animaux à 0%, 50% et 100% sont respectivement égales à 175 g/kg ; 335 g/kg et 400 g/kg de poids corporel de l’animal. Concernant l’évaluation de l’activité antibactérienne, la méthode dite de diffusion sur milieu solide et la méthode sur milieu liquide ont été employées. La première méthode a mis en évidence l’existence d’une activité antibactérienne chez la plante sur certaines souches bactériennes. En outre, deux paramètres ont été étudiés avec cette méthode telle que le pH et la concentration. Ainsi, on a pu constater que le changement de pH n’affecte pas d’une manière significative l’activité de Cm lyo (décocté de tiges et de feuilles) sur Escherichia coli, Salmonella anatum, Salmonella cholerae suis et Staphylococcus aureus. La sensibilité de Staphylococcus aureus est proportionnelle avec la variation de la concentration de Cm lyo. En comparant les activités de divers extraits de Ramy, on en déduit qu’il existerait dans la graine une substance extractible par l’hexane (un solvant très peu polaire) et ayant une activité antibactérienne très réduite comparée à celle extraite à partir de la tige feuillée et par décoction ou par une extraction hydroalcoolique à chaud. La substance responsable du ralentissement de la croissance sans l’inhiber entièrement contenue dans l’extrait de graine C3 (obtenu par hydrodistillation suivie d’une macération à l’hexane) et qui est soluble dans l’hexane serait aussi présente dans les décoctés et les extraits RMMF (extrait alcoolique à froid) et RMC (extrait hydroalcoolique à chaud). D’après la variation de la réponse en fonction de la concentration de Cm lyo nous pouvons conclure que l’optimum d’activité est obtenu à 50 mg/ml sur Staphylococcus aureus avec une charge de 1000 µg/puits. L’antagonisme ou la synergie de RT/d/lyo (décocté de tiges)et RF/d/lyo (décocté de feuilles) avec quelques antibiotiques de références (Néomycine, Nitrofurantoine, Furadantine gélule et Claforan) sont aussi étudiés en employant diverses méthodes telles que la méthode des disques et des bandelettes (par diffusions croisées, et associée à un gradient de concentration). Parmi ces antibiotiques, seule la Néomycine n’exerce pas de synergie (antagoniste) avec RT/d/lyo et RF/d/lyo. La méthode sur milieu liquide donne des valeurs de la CMI et de la CMB qui sont toutes égales à 0.6 mg/ml. D’après la valeur de la CMI, la CMB et le test de toxicité aiguë, la dose la plus élevée qui ne tue aucun animal (DL0) dépasse largement la valeur de la CMI et de la CMB. L’activité apparaît donc à des doses pour lesquelles la toxicité est négligeable. Puisqu’aucune étude n’a encore été faite sur Canarium madagascariense concernant ses activités antibactériennes, des études plus approfondies sont encore envisageables telles que :
-la détermination des familles chimiques de Canarium madagascariense
-la recherche des activités antibactériennes de ces familles chimiques
-les tests sur d’autres souches de bactéries
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Table des matières
Introduction générale
Première partie : Etude bibliographique
Le matériel végétal
1-Position systématique
2-Ecologie
3-Description botanique
3-1 Appareil végétatif
3-2 Appareil reproducteur
3-3 Origine et distribution géographique
3-4 Croissance et développement
4-Utilisations
4-1 La résine à odeur de térébenthine
4-2 Les racines
4-3 L’écorce
4-4 Les graines
5-Autres informations botaniques
Deuxième partie : Matériels et méthodes
A-Test de toxicité aiguë
1-But et principe
2-Etude de la toxicité aiguë par injection unique
2-1 Matériels et réactifs
2-2 Protocole expérimental
2-3 Interprétation des résultats et détermination de la DL50
B-Etude de l’activité antibactérienne
1-Rappels bibliographiques
2-Les souches bactériennes utilisées
2-1 Entretien
2-2 Isolement
2-3 Identification et contrôle d’identité et conservation des souches
2-3-1 Coloration de Gram
2-3-2 Conservation des souches au laboratoire
3-Numération des cellules bactériennes
3-1 Préparation de la pré-culture
3-2 Conduite de la numération
4-Test d’évaluation de l’activité antibactérienne
4-1 Introduction
4-2 Conduite du test
4-2-1 Test sur milieu solide
4-2-1-1 Technique des puits
4-2-1-2 Test de référence
a-Principe
b-Choix de l’antibiotique
c-Protocole expérimental
d-Lecture
4-2-1-3 Les essais : Test des activités antibactériennes des extraits de Ramy
a-Test à différents pH
b-Test à différentes concentrations
c- Comparaison des activités de divers extraits de Ramy
4-2-1-4 Relation entre l’activité antibactérienne et la concentration de la substance testée
a-But
b-Principe
4-2-1-5 Test d’antagonisme et de synergie
a-Test d’antagonisme et de synergie utilisant des disques
b-Test d’antagonisme et de synergie utilisant des bandelettes de papier filtre
b1-Test d’antagonisme par la méthode de diffusions croisées
b2-Test de synergie associant bandelette et gradient de concentration d’antibiotique
4-2-2 Test sur milieu liquide
4-2-2-1 Principe et méthode
4-2-2-2 Détermination de la CMI et CMB
Troisième partie : Résultats et interprétations
A-Etude de toxicité aiguë
1-Détermination des doses létales
2-Détermination de la DL50
2-1 Par la méthode algébrique
B-Etudes microbiologiques
1-Numération des cellules bactériennes
2-Caractérisation de l’activité antibactérienne
2-1 Test sur milieu solide
2-1-1 Résultats obtenus par la méthode des puits
2-1-2 Variation de la réponse en fonction de la concentration de la substance à tester
2-1-3 Résultats du test d’antagonisme et de synergie
a-Résultats obtenus par la méthode des disques
b-Résultats obtenus par la méthode de diffusions croisées (méthode de bandelettes)
c-Résultats obtenus par la méthode de bandelette associée à un gradient de concentration d’antibiotique
2-2 Test sur milieu liquide
2-2-1 La Concentration Minimale Inhibitrice (CMI) et la Concentration Minimale Bactéricide (CMB)
Conclusion générale
Références bibliographiques
Annexes
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