Etude de phosphorylation de nucléosides pyrimidiques par spectrométrie de masse haute résolution

Etude d’interactions par infusion directe

L’étude d’interactions enzymes-substrats par injection directe en mode flux continu (mode FIA : Flow Injection Analysis) repose sur l’injection d’un mélange réactionnel réalisé en mode off-line, via un système HPLC. Cette méthodologie est utilisée pour des analyses aussi bien qualitatives (suivideconversion) ou quantitatives de caractérisation de l’activité enzymatique. Cette caractérisation par injection directe peut être réalisée selon deux méthodologies différentes : (a) injections postréactionnelles ou (b) injections de suivi réactionnel.

Injections post-réactionnelles, « expérience à temps fixe »

La détermination des paramètres cinétiques enzymatiques par injections post-réactionnelles nécessite une étude préalable d’une zone de linéarité d’apparition de produit, pour une concentration d’enzyme fixée. Cette zone de linéarité constitue l’état stationnaire du modèlede Michaelis-Menten.
Pour une série d’expériences réalisées en mode off-line à différentes concentrations de substrat, la réaction est stoppée à un temps donné ne dépassant pas la zone linéaire de formation du produit de réaction. Après injection de la solution en FIA, le produit de réaction peut être quantifié par mesure des intensités des pics correspondant au produit via l’utilisation d’une gamme d’étalonnage. Par conséquent, la détermination des vitesses initiales de réactions pour différentes concentrations en substrat permet l’obtention des paramètres cinétiques enzymatiques (KM, Vmax , k cat) [32-35]. Bien que cette méthodologie n’offre pas une possibilité d’analyse d’isomères et requière l’utilisation d’un étaloninter ne pour la réalisation d’une quantification plus fiable, elle comporte de nombreux avantages:

Etude des interactions par le suivi des intensités d’ions par MALDI-TOFMS

Depuis l’introduction de la technique MALDI pour l’analyse de biomolécules par désorption/ionisation par laser dans les années 1980 [42, 43], cette technique d’ionisation a été employée pour diverses applications, comme l’étude d’interactions enzymes-ligands [44-48]. Les méthodologies associées à la technique MALDI dans le cadre de ces études apparaissent comme étant très diversifiées. Plusieurs approches par MALDI-MS, pour le suivi de conversions enzymatiques, ont été décrites dans la littérature à savoir : étude d’interactions enzymes-substrats [49] et enzymesinhibiteurs [50], utilisation des enzymes libres [51] et immobilisées [52, 53] en réactions hors-ligne [54] ou in-situ sur la plaque MALDI [53, 55]. Des exemples de ces diverses applications sont relatés dans le Tableau I-4.

Etude en enzymes libres

Les enzymes libres sont usuellement employées pour le suivi de conversions enzymatiques en mode off-line. Le succès d’une réaction est défini par la détection d’une baisse d’intensité du pic correspondant au substrat, combinée à l’apparition du (des) pic(s) du produit de la réaction.
Par ailleurs, les études d’activités inhibitrices sont déterminées par mesure de l’efficacité de la conversion enzymatique en présence de différentes concentrations d’inhibiteur.
Bien que cette technique présente de nombreux avantages dans ce domaine, tels que la rapidité d’analyse, la possibilité d’automatisation et la forte tolérance aux sels (tampons de réaction), la quantification se révèle plus hasardeuse. Le processus de cristallisation de la matricecombinée avec l’analyte résulte généralement en une distribution hétérogène du dépôt. La faible reproductibilité d’analyses d’échantillons qui en résulte, relative à l’intensité des signaux obtenus en spectrométriede masse, peut apporter des imprécisions de quantification.
Une autre limite de l’analyse MALDI MS pour l’analyse quantitative réside en la possible interférence de la matrice avec les pics d’analytes situés dans la région des basses masses, de m/z0 à 500 [56]. De cette manière, les paramètres suivants sont cruciaux afin d’obtenir une analyse quantitative:
– une sélection appropriée de la matrice,
– un ratio matrice sur analyte optimisé,
– l’utilisation d’un étalon interne, chimiquement similaire à la molécule d’intérêt [57].
Malgré l’ensemble de ces limites, la technique MALDI MS a montré son efficacité pour la caractérisation d’activités enzymatiques ainsi que dans le cadre de criblage d’interactions enzymesligands.
Dans le but de pallier les interférences provoquées par les signaux de matricesdans la zone des basses masses moléculaires, Wei et al. ont développés une méthodologie basée sur la désorption/ionisation pulsée par laser, ne nécessitant pas de matrice d’analyse (Desorption/ionization on silicon, DIOS) [58].
Les analytes en solution sont directement placés sur une plaque de silicone.
En raison de la faible présence d’interférences dans la région des basses masses engendrées par ce type de surface d’analyse, les produits de faibles poids moléculaires formés peuvent être facilement détectés et, par conséquent, l’activité enzymatique mesurée [55]. De cette manière, cette étude s’est focalisée sur des analyses qualitatives et quantitatives d’activités enzymatiques catalysées par l’enzyme acétylcholine estérase pour la conversion de l’acétylcholine (m/z146) en choline (m/z104).
L’efficacité d’inhibition de l’huperzine et de la tacrine a également été évaluée pardétermination des constantes d’inhibition de ces deux inhibiteurs.

Enzymes immobilisées

L’utilisation de ce type de support (DIOS) a marqué les débuts des stratégies d’immobilisations d’enzymes sur plaque support MALDI. Les groupements Si-H et Si-OH, présents à la surface du support DIOS, sont facilement modifiables et fonctionnalisables par différents types de réactifs et d’agents dérivants, tels que le 2,4,6-trichloro-1,3,5-triazine et le 3-aminopropyltriethoxysilane. Ces agents ont permis, entre autres, l’immobilisation de l’enzyme trypsine sur ce type de support pour le suivi des produits de digestion enzymatique in-situ sur plaque [53].
L’emploi des enzymes immobilisées a également initié le développement de la méthodologie nommée «Ion Fading » par MALDI-TOFMS (IF-MS) pour le criblage d’inhibiteurs en solution. Cette méthodologie a été mise en pratique pour la première fois au sein du laboratoire du professeur Francesc X. Avilés [59]. Cette dernière est basée sur la formation de complexes spécifiques entre une cible biologique et un ligand dans un milieu complexe. La formation de ce complexe entraine le piégeage des ligands présents dans l’échantillon analysé qui amène à la disparition de l’ion correspondant du spectre de masse.
Les principaux travaux relatifs à cette méthodologie d’Ion Fading, bien que peu nombreux, sont essentiellement réalisés par une détection MALDI-TOF MS. Cette approche peut être réalisée selon deux modes :
– mode direct : ce protocole consiste à mélanger la solution d’étude avec l’enzyme cible, dans un tampon compatible au système biologique. Après ajout d’une matrice organique MALDI, les dépôts sont réalisés sur plaque et les analyses effectuées. Les inhibiteurs sont détectés par extinction de signal (Ion Fading),
– mode indirect : la cible biologique est immobilisée sur un support solide. Ainsi, après isolement de l’enzyme du reste du mélange, une extinction de signal de la molécule d’intérêt est visible (Ion Fading). Par ailleurs, après dénaturation de l’enzyme et libération de l’inhibiteur, une hausse du signal correspondant au pic de l’inhibiteur peut être détectée (Ion Hunting).

Chromatographie d’affinité frontale: interactions enzymes-inhibiteurs

L’intérêt de l’étude d’interactions enzymes-inhibiteurs, par la méthodologie FAC, a été démontré en 1975 par Kasai et al. lors du développement d’une approche de quantification d’interactions enzymes-ligands. Après immobilisation du ligand sur une phase stationnaire et par élution de différentes enzymes trypsine, ces études ont permis de déterminer la constante de dissociation (K d) de l’enzyme trypsine pour son ligand benzoyl-L-arginine p-nitroanilide [84]. De nos jours, la Chromatographie d’Affinité Frontale utilise une approche inversée à savoir l’immobilisation des protéines sur support solide.
Similairement à l’étude de conversion de substrat, cette méthodologie repose sur le principe d’une infusion continue de ligands au travers d’un bioréacteur contenant l’enzyme immobilisée. Dans l’exemple présenté en Figure I-14, un mélange de composés contenant un inhibiteur est infusé dans un
bioréacteur contenant l’enzyme immobilisée sur support. Dans cet exemple, nous statuons que l’ensemble des composés ne présente aucune interaction non spécifique avec l’enzyme ou le support.
Durant l’infusion de la solution, les composés ne présentant aucune interaction passent au travers du bioréacteur. L’inhibiteur sera retenu par interaction avec le site actif de l’enzyme. Cette interaction va générer un retard d’élution (Δt) qui sera visible lors du suivi des chromatogrammes d’extraction d’ions (EIC) d’intérêts. Ce délai, représentatif du niveau de saturation de la colonne, permettra d’obtenir les constantes de dissociation de l’enzyme pour son ligand (Kd). De nombreux travaux relatés dans la littérature ont été réalisés afin de déterminer les constantes de dissociation de cibles d’intérêts(inhibiteur compétitif et détermination des constantes de dissociation) [85-87]. Différents exemples sont cités dans le Tableau I-5.

Dérivation

La dérivation chimique est une étape optionnelle pour la détection d’analytes sur plaque TLC.
Cette étape n’est pas nécessaire pour la détection de composés colorés visibles sous lumière blanche ou pour la détection de composés possédant un chromophore détectable sous UV. Elle devient cependant indispensable pour la détection de composés n’absorbant ni dans le domaine visible ni dans le domaine UV. Cette révélation consiste en une dérivation chimique réalisée soit avant dépôt de l’échantillon sur la plaque (pré-chromatographique), ou après l’étape de migration (postchromatographique). Les dérivations pré-chromatographiques sont usuellement moins utilisées que les dérivations post-chromatographiques.

Détection par densitométrie

La détection par densitométrie permet de représenter le profil TLC sous forme d’un densitogramme par mesure d’absorbance ou de fluorescence des composés. Les densitomètres sont constitués de trois types de lampes (deutérium : 10-400 nm, tungstène : 400-800 nm, mercure : 400-600 nm) permettant de balayer une large gamme de longueurs d’onde. A travers un système de lentilles, le faisceau de lumière est dirigé verticalement à la plaque. Cette dernière est placée sur un support mobile, se dirigeant piste par piste selon les données rentrées préalablement dans le logiciel.
Une ligne de base est réalisée à l’emplacement indiqué par l’utilisateur.

Etude de la cascade de phosphorylation

L’étudeprécédente a défini le temps et l’efficacité de réaction optimum pour chaque étape de phosphorylation. La cascade de phosphorylation a été entreprise à travers l’étude des enzymes libres et immobilisées.
Comme mentionné précédemment, les produits triphosphorylés Nu-TP présentent un effet d’inhibition sur l’enzyme hTK1. Il est donc important de veiller à ne pas initier la réaction par ajout unique en solution des trois enzymes hTK1, hTMPK et hNDPK, sous risque de stopper la première étape de phosphorylation. La cascade doit être réalisée par réactions successives et non simultanées. D’après la littérature, les réactions enzymatiques catalysées par les enzymes kinases sont décrites comme nécessitant une concentration d’ATP en excès dans le milieu réactionnel (concentration de l’ordre du mM). Nous avons montré la possibilité de travailler avec une concentration de 350 µM pourle suivi d’une étape de phosphorylation. Cependant, d’après l’étude de l’influence de la concentration en ATP sur l’efficacité de réaction cette concentration d’ATP semble faible pour l’étude de cascade de phosphorylation. Le suivi des trois étapes de phosphorylations, catalysées par les enzymes hTK1,hTMPK et hNDPK libres et immobilisées pour la conversion du dT en dTTP a été évalué avec et sansajout d’une quantité constante d’ATP (350 µM) avant chaque étape de conversion.

Etude on-line de la cascade enzymatique par Chromatographie d’Affinité Frontale couplée à la Spectrométrie de Masse Haute Résolution (FAC-HRMS)

Cette étude a prouvé la faisabilité de la preuve de concept d’un suivi de phosphorylations successives en off-line par FIA-HRMS. Cette dernière a été réalisée à travers le suivi de la conversion de l’endogène dTMP en dTTP, réaction catalysée par deux enzymes hTMPK et hNDPK immobilisées.
Elle a permis de confirmer l’utilisation possible des lots immobilisés pour le suivi de simple ou de multi-phosphorylations.
Ainsi, cette première étape a permis d’envisager l’analyse on-line de suivi de phosphorylation par Chromatographie d’Affinité Frontale couplée à la Spectrométrie de Masse Haute Résolution. La méthodologie FAC-HRMS pourrait se révéler d’un grand intérêt pour l’étude de simple ou de multiphosphorylations du fait de l’ensemble de ses utilisations et de ses avantages. Celle-ci présente les avantages liés à l’utilisation d’enzymes immobilisées telles qu’une possible réutilisation des enzymes packées dans les bioréacteurs et l’élimination de la suppression ionique provenant de l’analyse de macro-molécules et des tampons de stockage des protéines. La méthodologie FAC HRMS permet une estimation rapide (inférieure à 15 min) du processus de phosphorylation dans le but de réaliser l’analyse de différents types d’analogues de nucléotides. Elle se voudra efficace et versatile concernant les substrats analysés.

Table des matières
INTRODUCTION GENERALE
CHAPITRE I. ÉTUDE BIBLIOGRAPHIQUE
1. Description des interactions enzymes-ligands
1.1. Interactions enzymes-inhibiteurs
1.2. Interactions enzymes-substrats
2. Etudes de caractérisations enzymatiques
2.1. Description des cinétiques enzymatiques
2.2. Différents modes de représentation pour la détermination des paramètres cinétiques (K M , V max , k cat)
2.3. Détermination des vitesses initiales : exemple de cas de courbes de Michaelis-Menten
4.1. Immobilisation par adsorption
4.2. Immobilisation par piégeage
4.3. Immobilisation par réticulation intra-moléculaire
4.4. Immobilisation par liaison covalente
5. Description des techniques utilisées
5.1. Chromatographie sur Couche Mince ou Thin-Layer Chromatography
5.2. Concepts généraux
5.3. Principe de la Thin-Layer Chromatography
5.4. Etude de séparation des sucres par Thin-Layer Chromatography
6. Références
7. Table des figures
8. Table des tableaux
CHAPITRE II. CRIBLAGE DE SUBSTRATS PRESENTS DANS DES EXTRAITS DE PLANTES 
PARTIE I. CARACTERISATION DE L’ACTIVITE ENZYMATIQUE
1.4. Analyses des sucres
1.6. Validation de méthode de séparation et de quantification du saccharose, du glucose et du fructose
1.7. Analyse de sucres par TLC-MALDI-TOFMS
2.4. Essais enzymatiques : linéarité
2.5. Essais enzymatiques : la détermination des paramètres cinétiques
2.6. Hydrolyse de substrats alternatifs
PARTIE II. DEVELOPPEMENT D’UNE PREUVE DE CONCEPT DE SUIVI DE CONVERSION ENZYMATIQUE:LE CRIBLAGE DE SUBSTRATS DE L’INVERTASE AU SEIN D’EXTRAITS DE PLANTES PAR TLC-MALDI TOFMS 
1. Préparation des extraits de plantes
2. Protocole des essais enzymatiques
3. Méthode de TLC-(UV)-MALDI TOFMS
4. Résultats et discussions
PARTIE III. OUVERTURE A L’APPLICATION DE LA PREUVE DE CONCEPT:ETUDE DE L’ENZYME CELLOBIOHYDROLASE II
1.1. Synthèse des nanoparticules magnétiques
1.2. Fonctionnalisation des nanoparticules
2. Etude simultanée des interactions enzyme-substrat et enzyme-inhibiteur du maltohexaose et du Dcellobiose par TLC-ENALDI
CONCLUSIONS
REFERENCES
TABLE DES FIGURES
TABLE DES TABLEAUX
CHAPITRE III. ÉTUDE DE PHOSPHORYLATION DE NUCLEOSIDES PYRIMIDIQUES PAR SPECTROMETRIE DE MASSE HAUTE RESOLUTION
PARTIE I. CARACTERISATION DE L’ACTIVITE ENZYMATIQUE 
1.2. Analogues de nucléosides comme agents antiviraux
1.6. Description des enzymes étudiées dans ce travail
2.1. Optimisation des conditions opératoires
3.1. Caractérisation par FIA-HRMS
3.4. Détermination des paramètres cinétiques : étude de Michaelis-Menten
3.5. Caractérisation par spectrophotométrie UV
3.6. Caractérisation par électrophorèse capillaire-UV (EC-UV)
3.7. Caractérisation des enzymes libres hTK1 et hNDPK.
4. Conclusion
PARTIE II. DEVELOPPEMENT DE PREUVES DE CONCEPTS DU SUIVI DE CASCADES DE CONVERSIONS ENZYMATIQUES
1. Etude off-line de la cascade de phosphorylation par Injection en Flux continu couplé à la Spectrométrie de Masse Haute résolution (FIA-HRMS)
1.1. Etude des réactions individuelles
1.2. Etude de la cascade de phosphorylation
1.3. Conclusion
2.1. Principe de la méthodologie FAC-HRMS pour le suivi de cascade de phosphorylation
2.2. Optimisations du système FAC
2.4. Etude de la cascade on-line de phosphorylation
PARTIE III. APPLICATION DES PREUVES DE CONCEPT DE FIA-HRMS ET FAC-HRMS POUR L’ETUDE DE SPECIFICITE DE CONVERSION DE NUCLEOTIDES PHOSPHONATES ACYCLIQUES AU REGARD DE L’ENZYME TMPKDE SOUCHES HUMAINE ET VIRALE
1.1. Virus de la vaccine
2. Etude de la spécificité par analyse en mode off-line par FIA-HRMS
3. Etude de la spécificité par analyse on-line par FAC-HRMS
CONCLUSIONS 
REFERENCES 
TABLE DES FIGURES 
TABLE DES TABLEAUX 
CONCLUSION GENERALE ET PERSPECTIVES 
ANNEXES 

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