ETUDE DE L’EXPOSOME FŒTAL AU TRAVERS DE L’ANALYSE DE LA COMPOSITION GLOBALE DU MECONIUM

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ETUDE DE L’EXPOSOME FŒTAL AU TRAVERS DE L’ANALYSE DE LA COMPOSITION GLOBALE DU MECONIUM

L’exposome » fœtal inclue différents facteurs d’expositions auxquels le fœtus est soumis durant la période gestationelle [44], [45]. Ces expositions impliquent le lieu de vie et l’alimentation de la mère, mais également ses expositions professionnelles, médicamenteuses, ou encore sa consommation de produits tels que du tabac ou de l’alcool (Figure 6) [46], [47]. L’ensemble de ces expositions peut engendrer la transmission de substances externes appelées « xénobiotiques » au fœtus, suite à leur passage au travers de la barrière placentaire [37]. D’autres substances internes sont transmises au fœtus, résultant du métabolisme endogène de la mère, ainsi que du métabolisme de ses microbiotes. L’ensemble de ces expositions forment une partie de « l’exposome » fœtal. Afin d’analyser les substances transmises de la mère au fœtus durant la période gestationnnelle, nous avons recherché l’ensemble des matrices fœtales préalablement étudiées dans la littérature. Les approches expérimentales utilisées pour approcher l’exposome prénatal seront ensuite présentées.

Choix de la matrice de l’étude

Description et comparaison des matrices fœtales étudiées dans la littérature

Afin de mener à bien notre étude, la matrice fœtale à considérer doit refléter la plus large fenêtre d’exposition possible. Elle doit préférentiellement être collectée de manière non invasive ainsi que démontrer une quantité suffisante permettant son analyse. Pour étudier les différents composés ayant traversé la barrière placentaire, des analyses des urines, des cheveux, des ongles ou encore des méconiums du nouveau-né ont été réalisées [48]–[50]. Différentes études se sont intéressées à l’analyse des expositions fœtales aux pesticides, aux xénobiotiques, aux drogues, au tabac ou à l’alcool, en se basant sur différentes matrices fœtales collectées après la naissance [47], [51]–[53]. Dans une revue, Bearer a notamment comparé l’ensemble de ces matrices, incluant l’urine, le sang, les cheveux, les ongles et le méconium du nouveau-né [54].

L’urine

L’urine fœtale peut être collectée à l’aide d’une lingette ou par une sonde. La première méthode est la plus utilisée car non invasive. Elle peut cependant poser des soucis de contamination notamment par les molécules provenant du support cellulosique. La technique de sonde est une méthode invasive, et est principalement utilisée en cas d’infections urinaires. D’un point de vue analytique, l’urine est une matrice présentant une forte richesse en métabolites grâce à l’effet de concentration des reins. La préparation des échantillons d’urines est relativement peu complexe : elle est soit réalisée par une microextraction des composés d’intérêt sur phase liquide ou solide [55], [56], ou par une simple dilution. L’urine du fœtus a déjà été étudiée pour quantifier l’exposition fœtale aux stupéfiants [57], [58]. Cette matrice ne rend cependant compte que d’une exposition récente de 2 à 3 jours, la rendant moins pertinente dans le cas de notre étude s’intéressant à la plus large fenêtre d’exposition fœtale.

Le sang

L’analyse du sang néonatal peut être réalisée sur : le sang du nouveau-né ou celui du cordon ombilical. Le prélèvement sanguin chez le nouveau-né est une technique invasive, avec des quantités très limitées de sang prélévées dû au faible volume sanguin du nouveau-né (250 mL). De plus les veines du nouveau-né sont très fines, rendant cette pratique très peu acceptée par les parents. Le prélèvement sanguin du cordon ombilical est quant à lui non-invasif mais nécessite d’être collecté lors de l’accouchement, ce qui complique son recueil. Comme l’urine, le sang ne reflète que les derniers jours d’exposition du fœtus, représentant une courte fenêtre.

Les cheveux

Les cheveux représentent une matrice accumulative, commençant à se produire dès le 6ème mois  de grossesse. Ainsi, cette matrice permettrait d’enregistrer une large fenêtre d’exposition fœtale contrairement à l’urine et au sang présentés précédemment. Cependant de nombreux nouveau-nés naissent sans cheveux, ce qui nécessite d’attendre que les cheveux poussent après la naissance avant de pouvoir les collecter, pouvant intégrer des éléments post-natals. D’un point de vue analytique, la préparation des échantillons de cheveux est relativement simple et rapide. Celle-ci est réalisée par une digestion de la kératine puis une extraction sur phase solide ou liquide des composés d’intérêts [59]. Le cheveu a beaucoup été étudié notamment dans l’étude d’expositions fœtales à des contaminants [60], ou des stupéfiants [61].

Les ongles

Comme pour les cheveux, les ongles commencent à se former durant le dernier trimestre de gestation, enregistrant ainsi les expositions durant les 3 derniers mois de grossesse. Ils sont collectés quelques temps après la naissance, leur collecte est non invasive et leur préparation est simple mais peut être relativement longue (longue digestion de la kératine) [59]. Les ongles infantiles ont déjà été étudiés, notamment pour détecter des expositions fœtales aux stupéfiants [62], [63].

La salive

La salive est une matrice non invasive, facile à collecter, composée principalement d’eau et présentant une étape de préparation de l’échantillon simple et rapide. La salive présente néanmoins des quantités limitées, et plusieurs facteurs tels que le stress ou la prise de médicaments peuvent influer sur son écoulement et ses caractéristiques physiologiques. La salive a souvent été étudiée dans la littérature en complément à d’autres matrices, telle que l’urine [64], [65].

Le méconium

Le méconium correspond aux premières matières fécales excrétées par le nouveau-né durant les 72 premières heures suivant la naissance [51], [66]. Il reflète la plus large fenêtre d’exposition fœtale en s’accumulant dans l’intestin du fœtus dès le 2ème [67] ou 3ème [68] mois de grossesse selon les références. L’échantillonnage du méconium est non invasif car collecté directement à partir de la couche. Celui-ci peut cependant présenter des contaminations par l’urine contenant de plus grandes teneurs en métabolites, pouvant fausser les résultats des analyses fœtales. Le méconium est une matrice accumulative et disponible en quantités suffisantes pour réaliser plusieurs analyses. Il présente néanmoins une propriété très dense et visqueuse qui est complexe à analyser, et nécessite de longues étapes de préparation de l’échantillon, incluant la normalisation par un séchage, l’homogénéisation par des techniques telles que de la sonde à ultrasons… etc [46], [69].

Conclusion sur la matrice de l’étude

Bearer a cité dans sa revue les différents avantages et inconvénients des matrices fœtales décrites ci-dessus, exposant notamment la fenêtre d’exposition qu’elles permettent d’étudier, ainsi que la facilité ou complexité de collecte de chacune d’entre-elles [54]. Dans leur étude, Ostrea et al ont comparé la teneur en pesticides environnementaux, enregistrée dans le cheveu, dans le sang du cordon ombilical et dans le méconium de 598 couples mères/enfants. Cette étuded indique de plus fortes teneurs détectées dans le méconium, du fait de son effet d’accumulation [48].

La matrice méconium

Formation du méconium

Le méconium est accumulé dans l’intestin du fœtus dès sa formation et jusqu’à la naissance [70]. Les différentes substances pouvant être retrouvées dans le méconium correspondent aux substances produites par le fœtus ainsi que toutes les substances transmises par la mère, traversant la barrière placentaire. Ce transfert s’effectue principalement par diffusion passive (transfert des molécules du milieu le plus concentré vers le milieu le moins concentré). Celui-ci dépend de plusieurs paramètres physico-chimiques des molécules considérées tels que la taille, le pKa, l’hydrophobicité, ou encore le pH sanguin [71], [72]. La formation du méconium inclue cinq paramètres représentés en Figure 7.A, et décrits ci-dessous :
Le transfert des molécules de la mère vers le fœtus à travers le placenta via le cordon ombilical.
Les molécules transmises de la mère sont alors directement métabolisées par le foie puis accumulées dans le méconium, ou filtrées au niveau des reins et se retrouvent dans la vessie du fœtus.
Les molécules transférées vers la vessie vont être excrétées dans le liquide amniotique par l’urine.
Ces molécules excrétées via l’urine sont présentes dans le liquide amniotique, qui va être ingéré par le fœtus.
Ces molécules sont ensuite métabolisées par le foie et stockées à leur tour dans le méconium.

Composition du méconium

Le méconium présente une texture visqueuse, de couleur verdâtre ou brunâtre et est inodore (Figure 7.B). Selon les études, celui-ci est totalement expulsé après 24 à 48h [46], [47], 72h [51], [66] ou encore jusqu’au jour 5 suivant la naissance [74]. Ahanya et al ont rapporté que l’excrétion du méconium chez des nouveau-nés sains se fait généralement au cours des 24 à 48 heures après la naissance [75]. Le méconium est parfois excrété in utero en cas de stress important ou d’infections fœtales. L’évènement de naissance est également considéré comme un processus stressant pour le fœtus pouvant également impacter l’excrétion du méconium [75]. La composition de cette matrice a été décrite par Unsworth et Vause [67], incluant :
70 à 80 % d’eau
Des protéines
Des métabolites
Des lipides
Des acides biliaires
Des minéraux
Des sécrétions intestinales
Des cheveux néonatals
Des résidus de liquide amniotique

Etude de la composition du méconium par des approches omiques

De plus en plus d’études sont réalisées sur le méconium, avec environ 1000 publications en 2019 versus moins de 800 publications en 2010 (mots clés recherchés « meconium » et « newborn faeces », ScienceDirect, Août 2020). Les analyses réalisées incluent aussi bien l’étude d’exposition à des métaux [76], des nanoparticules [77], des pesticides [69], [78], des composés organiques toxiques (par exemple les « BTEX » : Benzène, Toluène, Éthylbenzène et Xylènes) [47], des médicaments [68], du tabac [53], [79], [80], ou encore des drogues ou de l’alcool [74], [81].
Dans le cadre de ce travail de thèse, nous avons pour objectif d’étudier de façon non ciblée, et la plus exhaustive possible la composition globale du méconium. Ceci en intégrant l’analyse de toutes ses petites molécules organiques (métabolites) et de ses protéines respectivement par des approches dites de métabolomique et de protéomique. Des analyses des espèces bactériennes présentes dans le méconium seront également réalisées après extraction de l’ADN et séquençage du gène de l’ARN ribosomial 16S (ARNr16S), spécifique des bactéries. Nous présentons dans ce chapitre, les différentes approches « omiques », suivies par un état de l’art des études réalisées sur la composition du microbiote et des protéines présentes dans le méconium. Enfin, l’approche métabolomique sera présentée individuellement dans le dernier chapitre de l’introduction (partie III), correspondant à l’approche sur laquelle j’ai le plus travaillé durant ce travail de thèse.

Les approches « omiques » permettent de caractériser voire de quantifier l’ensemble des composés biologiques impliqués dans la structure et le fonctionnement d’un organisme donné. L’ensemble des gènes a été appelé « génome » pour la première fois par Hans Winkler en 1920 [82]. Le séquençage de l’ADN et l’identification des gènes a été appelée « génomique » par Mckusick et Ruddle en 1987 [83]. Ce concept a été étendu aux analyses des autres biomolécules donnant lieu à la « transcriptomique » s’intéressant à l’étude des ARNm, à la « protéomique » étudiant les protéines et à la « métabolomique » étudiant les petites molécules de masses moléculaires inférieures à 1500 Dalton. Ces petites molécules appelées métabolites peuvent être issus du métabolisme interne d’un individu, mais peuvent également intégrer les interactions de l’individu avec son environnement (métabolites issus des microbiotes vivant en symbiose avec l’individu, ou encore des métabolites exogènes liés à l’alimentation ou à des expositions à des xénobiotiques).
Les analyses omiques offrent de nouveaux moyens d’étude de l’évolution adaptative à l’échelle des populations [84]. Elles permettent de mieux comprendre le processus vis-à-vis d’une pathologie ou d’un contexte physiologique ou environnemental donné. Les sciences « omiques » se sont développées grâce l’essor des techniques de biologie et de chimie à haut débit [85], [86], incluant des techniques de séquençage ou encore d’analyse par spectrométrie de masse haute résolution [87], [88]. Ces approches peuvent être réalisées soit de façon globale, non ciblée et sans a priori, soit à moindre échelle, dans le but d’acquérir une vision ciblée sur une famille de gènes, de protéines ou de métabolites d’intérêts. Dans ce cas de figure, ces composés doivent être préalablement identifiés par des approches non ciblées ou par des hypothèses mécanistiques.

Les approches génomique et métagénomique – application à l’étude du microbiote intestinal

Analyse génomique : du procaryote à l’eucaryote

L’analyse génomique étudie l’ensemble des gènes d’un organisme ou d’un tissu [89]. La classification des organismes est caractérisée en 3 sections : les eucaryotes, les archées et les bactéries, et a été introduite pour la première fois en 1977 par Woese et Fox (Figure 8) [90]. Ces organismes appartiennent à deux familles : les eucaryotes, et les procaryotes (incluant les bactéries et archées).

La famille des eucaryotes possède des cellules avec un noyau, qui contient l’information génétique (ADN). Cette famille compte les animaux, les plantes, les micro-algues, les champignons ainsi que les levures. De l’autre côté, la famille des procaryotes est caractérisée par l’absence de noyau et donc la présence de l’ADN dans le cytoplasme de la cellule. Cette famille est majoritairement représentée par les bactéries.

Techniques d’analyses génomiques et métagénomiques

L’analyse génomique concerne l’analyse d’un génome (par exemple, analyse du génome humain). Lorsque les génomes de plusieurs individus d’espèces différentes (par exemple, un ensemble de communauté bactérienne) sont considérés, l’approche utilisée est appelée « métagénomique ». C’est cette approche qui est notamment utilisée pour caractériser les quelques 1014 bactéries et autres procaryotes qui peuplent notre intestin. Les analyses métagénomiques reposent sur une étape de purification puis d’amplification de l’ADN, suivie par une technique de séquençage exécutée pour la première fois par Sanger et al en 1977 [122]. Le premier séquençage complet réalisé est celui de la bactérie Haemophilus influenzae, par Fleischmann et al en 1995. Les bactéries représentent les organismes avec le plus grand nombre de génomes séquencés. A l’inverse, les organismes eucaryotes présentent des séquences non codantes, c’est-à-dire des séquences d’ADN non traduites et ont par conséquent été moins séquencés (séquences beaucoup plus longues) [111]. La technique « expressed sequence tag » (EST) a été initialement utilisée pour le décryptage du séquençage chez les eucaryotes, représentant uniquement la partie codante de l’ADN. A la suite des avancées en termes de techniques de séquençage, une nouvelle approche dite « Next Generation Sequencing » (NGS) a été utilisée, offrant une meilleure qualité et un plus haut débit de séquençage [105], [123], [124].

Il existe au sein du génome des régions variables à hypervariables et d’autres constantes, l’ensemble de cette information génétique est extraite et amplifiée pour être séquencée. Le séquençage est réalisé sur des fragments d’ADN de courtes longueurs, qui sont ensuite comparés à des génomes de référence [105]. Cette étape présente la plus grosse difficulté en génomique car peu d’espèces ont leur génome séquencé et donc connu à ce jour.
Deux régions sont d’intérêt pour l’analyse des gènes procaryotes et eucaryotes, les gènes codant pour l’ARNr16S et l’ARNr18S respectivement et spécifiques à chacun de ces 2 organismes [2]. Ainsi, la région 16S représente une région taxonomique, c’est-à-dire un référentiel permettant de remonter à la famille, au genre ou encore à la souche de la bactérie étudiée (Figure 9). Ceci est réalisé par comparaison des séquences à des bases de données disponibles, telles que Greengenes (GG) [127], SILVA [128], RDP (de l’anglais, Ribosomal Database Project) [129], [130]. Le séquençage de l’ensemble des gènes codants pour les ARNr16S, associé à des outils bioinformatiques, permet ainsi d’étudier la composition complexe du microbiote.

Analyse du microbiote du méconium

L’environnement du fœtus humain a durant des décennies été considéré comme étant stérile [104], [105]. L’absence de bactéries vivantes est appuyée par l’utilisation de méthodes traditionnelles de culture ou de microscopie, offrant quelques limites notamment vis-à-vis de l’incapacité de détecter des bactéries non cultivables [2]. Des études récentes utilisant de nouvelles techniques de pointe ont remis en question cette stérilité, discutant un début de développement du microbiote humain in utero [104], [106], même si les démonstrations fournies restent très controversées.
En effet, différents auteurs ont démontré la présence de bactéries telles que des Staphylococcus ou des Enterobacteriaceae dans de nombreuses matrices fœtales telles que le placenta, le cordon ombilical, le liquide amniotique ou encore le méconium [107]–[110]. La présence de microorganismes dans ces matrices fœtales est considérée comme une preuve soutenant l’hypothèse de la colonisation microbienne in utero [111], [112]. Dans leur étude, Hansen et al ont réalisé l’analyse par la méthode FISH (de l’anglais, Fluorescent In-Situ Hybridisation) de 31 échantillons de méconium excrétés dans les 24 heures suivant la naissance, démontrant une présence bactérienne dans 67 % des échantillons [113]. Les familles bactériennes les plus fréquentes étaient les Bifidobacteriaceae, les Enterobacteriaceae, et les Enterococcaceae [113]. Dans une autre étude réalisée par Hu et al sur 23 échantillons de méconium de nouveau-nés sains issus de naissances par voie basse ou par césarienne, les auteurs ont observé une présence bactérienne au sein de tous les échantillons de méconium, incluant des Bacteroidetes et des Protéobactéries [114].

Plusieurs études réalisées sur des échantillons de méconium issus de nouveau-nés sains ont également démontré la présence d’ADN issus de différentes bactéries [114]–[118], suggérant une transmission bactérienne de la mère vers le fœtus et un début de colonisation microbienne intestinale avant la naissance [2]. Dans une autre étude de méconiums collectés chez des naissances prématurées, les auteurs ont décrit une plus forte colonisation en Lactobacillus chez les nouveau-nés très prématurés (< 32 semaines de gestation), comparés aux naissances à terme [39]. Ardissone et al ont observé de plus fortes abondances des genres Enterobacter, Enterococcus et Lactobacillus dans le méconium de nouveau-nés prématurés, qui pourraient être responsables de réactions inflammatoires au niveau de l’intestin [110].
A l’inverse, d’autres études suggèrent une contamination des matières fécales au moment de la naissance. Makino et al ont considéré des échantillons de méconium et de fèces chez 17 couples mères-enfants en bonne santé et issus de naissances par voie basse versus des naissances par césarienne. Cette étude a démontré la présence de souches appartenant au genre Bifidobacterium chez 11 des 12 méconiums des naissances par voie basse, mais pas dans les accouchements par césarienne. Ces résultats suggèrent ainsi une contamination microbienne liée au mode d’accouchement, et démontrent la transmission de souches uniques et spécifiques du microbiote de la mère vers l’enfant, lors de la naissance par voie basse [117]. Quelques exemples d’études réalisées sur la stérilité ou non du méconium sont regroupés dans le Tableau 2 ci-dessous.

L’approche non ciblée en métabolomique

Déroulement d’une analyse métabolomique non ciblée

L’analyse métabolomique se compose de différentes étapes allant de la préparation de l’échantillon à l’identification des métabolites et leur interprétation biologique au sein du système étudié. Le déroulement de l’analyse non ciblée par LC/HRMS, telle que réalisée au laboratoire est décrite en Figure 13 [162]. Celle-ci inclut six étapes essentielles et capitales, tant pour la quantité que pour la qualité des données générées. En effet, chacune de ces étapes peut induire un biais pouvant directement impacter les résultats et fausser l’interprétation biologique finale. La première étape consiste en la préparation de l’échantillon, permettant l’extraction des métabolites aux propriétés physico-chimiques variées, suivie d’une étape d’acquisition des données spectrales par LC/HRMS.

Le prétraitement des données jusqu’à l’annotation des variables (étape C) est réalisé grâce à des outils automatisés. Des outils de visualisation (permettant par exemple d’identifier des individus ou des variables abberants) sont utilisés, puis des analyses statistiques sont conduites permettant d’identifier les variables différenciant les groupes étudiés. Des analyses MS/MS sont réalisées sur les composés d’intérêts permettant de valider les annotations putatives obtenues à l’étape C. Enfin une interprétation biologique des données est réalisée en dernier lieu, par exemple par la construction de réseaux métaboliques.

Table des matières

INTRODUCTION GENERALE
CHAPITRE I : LES ALLERGIES ALIMENTAIRES
I. Les allergies alimentaires : contexte général
II. Mécanismes immunologiques d’une réaction allergique médiée par des IgE
A. La sensibilisation
B. Déclenchement ou réaction allergique
III. Prévalence de l’allergie alimentaire
IV. Principaux allergènes alimentaires et doses réactogènes
V. Facteurs associés à l’augmentation de la prévalence des allergies
A. La fenêtre prénatale
1. Le lieu de vie et expositions aux polluants atmosphériques
2. L’alimentation de la mère durant la grossesse
B. La fenêtre périnatale ou néonatale
1. Le mode de naissance
2. Le mode d’alimentation du nourrisson en début de vie
VI. Vers l’analyse de l’exposome périnatal en lien avec le développement d’allergies dans l’enfance
CHAPITRE II : ETUDE DE L’EXPOSOME FŒTAL AU TRAVERS DE L’ANALYSE DE LA COMPOSITION GLOBALE DU MECONIUM
I. Contexte général
II. Choix de la matrice de l’étude
A. Description et comparaison des matrices fœtales étudiées dans la littérature
1. L’urine
2. Le sang
3. Les cheveux
4. Les ongles
5. La salive
6. Le méconium
7. Conclusion sur la matrice de l’étude
B. La matrice méconium
1. Formation du méconium
2. Composition du méconium
C. Etude de la composition du méconium par des approches omiques
1. Les approches génomique et métagénomique – application à l’étude du microbiote intestinal
2. L’approche protéomique
CHAPITRE III : L’ANALYSE METABOLOMIQUE
I. Contexte général
II. L’approche non ciblée en métabolomique
A. Déroulement d’une analyse métabolomique non ciblée
1. Préparation des échantillons
2. Acquisition des données
3. Traitement des données acquises par LC/HRMS
4. Analyses statistiques
5. Outils d’aide à l’interprétation biologique des données
B. Analyses métabolomiques réalisées sur le méconium
1. Les analyses métabolomiques non ciblées réalisées sur le méconium
2. Les analyses métabolomiques ciblées réalisées sur le méconium
3. Les analyses multi-omiques réalisées sur le méconium
Conclusion
Présentation du projet de recherche
RESULTATS ET DISCUSSION
CHAPITRE I : MISE EN PLACE D’UNE METHODOLOGIE D’ANALYSE POUR L’EXPLORATION DU METABOLOME DU MECONIUM
I. Introduction
A. Préparation des échantillons
1. Prétraitement des méconiums
2. Extraction des métabolites : pré-extraction et choix du solvant
3. Extraction des métabolites : homogénéisation de la matrice
4. Séchage et reprise des métabolites extraits
B. Séparation chromatographique en amont des acquisitions de données spectrales
C. Conclusion
II. Matériels et méthodes
A. Réactifs et produits chimiques
B. Echantillons de méconiums
C. Préparation des échantillons de méconium
1. Lyophilisation des méconiums
2. Homogénéisation des méconiums : test comparatif de la sonde à ultrasons et de la lyse mécanique
3. Reprise des échantillons de méconium pour l’analyse en LC/HRMS
D. Analyse des métabolites par LC/HRMS
1. Conditions chromatographiques
2. Analyse par spectrométrie de masse
3. Traitement des données LC/HRMS
E. Analyse des métabolites par FT-ICR
III. Résultats expérimentaux et discussion
A. Développement et optimisation de la procédure de préparation des échantillons
1. Lyophilisation du méconium
2. Méthode d’homogénéisation du méconium lyophilisé
3. Optimisation du volume de reprise pour l’analyse par LC/HRMS
4. Etude de la stabilité des analyses de méconium par LC/HRMS pour l’analyse de grandes séries d’échantillons
5. Bilan des optimisations et des développements réalisés sur le protocole de préparation de l’échantillon, vers une première description du méconium
6. Analyses métabolomiques réalisées par DIMS (Direct Introduction Mass Spectrometry) sur un FT-ICR
B. Cartographie métabolique du méconium, obtenue dans les conditions HILIC-ESI-
IV. Conclusions du chapitre I et perspectives
CHAPITRE II : Réalisation d’une cartographie de la composition du méconium et étude de sa variabilité interindividuelle et de son évolution durant les premiers jours de vie par des approches multi-omiques : métabolomique, métaprotéomique et métagénomique ciblée
I. Introduction
II. Matériels et méthodes
A. Echantillons de méconiums
B. Analyses métabolomiques
1. « Workflow » suivi pour l’analyse métabolomique des échantillons de la cohorte clinique
2. Préparation des échantillons de méconium
3. Acquisition des données LC/HRMS
4. Traitement des données
C. Analyses métaprotéomiques
1. « Workflow » suivi pour l’analyse métaprotéomique des échantillons de la cohorte clinique
2. Préparation des échantillons
3. Acquisition des données de métaprotéomique en LC-MS/MS
4. Traitement des données, annotation et quantification des protéines
5. Analyse des données
D. Analyses métagénomiques ciblées
1. Workflow suivi pour l’analyse métagénomique ciblée des échantillons de la cohorte clinique
2. Préparation des échantillons
3. Traitement des données de séquençage
III. Résultats expérimentaux et discussion
A. Analyses métabolomiques (article en préparation, Annexe 1).
1. Traitement XCMS des données générées par les analyses HILIC-ESI- et C18-ESI+
2. Suivi de la stabilité du système analytique dans les conditions HILIC-ESI- et C18-ESI+
3. Annotation des variables
4. Cartographie globale des métabolites identifiés dans le méconium
5. Etude de l’évolution de la composition métabolique du méconium au cours des trois premiers jours de vie
B. Analyses protéomiques
1. Analyse des protéines d’origine humaine
2. Analyses métaprotéomiques
C. Analyses métagénomiques ciblées par séquençage des gènes codant pour les ARNr-16S
1. Traitement des données et attribution des OTUs (de l’anglais, Operationnal Taxonomic Unit)
2. Etude de l’évolution de la composition bactérienne du méconium au cours des trois premiers jours de vie
IV. Discussion générale des analyses « mutli-omiques » réalisées sur le méconium
V. Conclusions du chapitre II et perspectives
CHAPITRE III : Analyse métabolomique des échantillons de méconium de la cohorte EDEN
I. Introduction
II. Matériels et méthodes
A. Description de la cohorte EDEN
B. Echantillons de méconiums de la cohorte EDEN
C. Acquisition des données
D. Traitement des données
III. Résultats expérimentaux et discussion
A. Traitement XCMS des données générées dans les conditions analytiques HILIC-ESI- et C18 ESI+ et suivi de la stabilité du système analytique
1. Nombre de variable extraites et suivi de la stabilité du système analytique
2. Nécessité de modifier les filtres analytiques classiquement utilisés pour répondre à notre question scientifique
B. Annotation des variables
1. Analyse comparative du nombre de variables annotées au sein de la cohorte clinique et de la cohorte EDEN
2. Analyse qualitative comparative des variables annotées au sein des échantillons de la cohorte clinique et de la cohorte EDEN
C. Analyses statistiques des données de la cohorte EDEN : effet du temps, du centre et du sexe
1. Analyses non supervisées réalisées sur l’ensemble des variables extraites au sein des conditions HILICESI- 224
2. Analyses non supervisées réalisées sur les métabolites annotés
3. Analyses supervisées de l’effet temps et de l’effet centre sur la composition métabolique des méconiums
D. Analyses préliminaires de la relation entre la composition du méconium et le devenir allergique des enfants
1. Première analyse d’association sur les échantillons collectés à 24 heures (J1) au centre de Nancy 230
2. Analyse d’association sur les échantillons collectés à 36 heures au centre de Nancy
IV. Conclusions du chapitre III et perspectives
CONCLUSIONS GENERALES ET PERSPECTIVES
REFERENCES

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