Etude de l’effet radio-sensibilisant de nanotubes de carbone dans le modèle de glioblastome canin spontané

Les cellules de la glie

   Les gliomes correspondent aux tumeurs du Système Nerveux Central (SNC) issues des cellules gliales. Ce type cellulaire a longtemps été considéré comme un simple support du tissu nerveux en permettant le maintien de son architecture et de sa stabilité (Louis et al. 2007). La découverte des différents types de cellules gliales a montré que ce tissu joue un rôle bien plus important au sein du SNC. Ainsi, on distingue deux grands types cellulaires (Dimou, Gotz 2014) (figure 1):
– La microglie dont les cellules forment le système immunitaire inné du SNC et sont capables de phagocytose. Elle est au contact des neurones et peut supprimer les synapses défaillantes. On parle de synaptic stripping (Kettenmann 2013).
– La macroglie se compose de différents sous-types cellulaires :
– Les astrocytes permettent le maintien de l’homéostasie métabolique et ionique au sein du cerveau. Par ailleurs, ceux-ci interviennent dans la communication neuronale au niveau de la synapse, mais aussi dans la cicatrisation lors d’atteinte du SNC.
– Les oligodendrocytes sont les cellules gliales myélinisantes du SNC.
– Les épendymocytes sont à l’interface entre le SNC et le Liquide Cérébro-Spinal (LCS).
– Les cellules gliales NG2 ont été découvertes à l’aide d’anticorps NG2, spécifiques du protéoglycane chondroïtine sulfate de type 4.
Elles forment un réseau péri-neuronal, permettent de stabiliser la synapse et sont distribuées dans l’ensemble du cerveau adulte. Elles interviennent dans la cicatrisation du tissu nerveux et peuvent se différencier en d’autres types cellulaires, tels que des oligodendrocytes.

Classification des gliomes selon l’OMS

   La classification des tumeurs cérébrales, éditée par l’OMS, n’a cessé d’être enrichie avec de nouvelles données, consécutives à l’avancée des recherches scientifiques. La première classification, qui date de 1979, différenciait les tumeurs selon leur type histologique. Ainsi, la principale dichotomie se fait entre les cellules astrocytaires, épendymaires et oligodendrogliales. La seconde classification de 1993 apporte des informations supplémentaires via l’analyse immunohistochimique des différents types cellulaires (Kleihues, Burger, Scheithauer 1993). La troisième classification fournit les profils génétiques des cellules afin d’affiner la description des tumeurs cérébrales. Par ailleurs, cette nomenclature fait référence pour la première fois à l’épidémiologie, les symptômes ainsi que le pronostic pour chaque entité clinique (Kleihues et al. 2002). La classification de 2007 s’appuie sur les travaux précédents et fournit de nouvelles informations pronostiques sur les tumeurs. Les différents types histologiques de gliomes et le grade OMS associé sont présentés dans le tableau ciaprès.

Facteurs de risque

   À l’heure actuelle, un seul facteur a été identifié comme facteur de risque de développer un gliome diffus : l’exposition aux RI. Ceux-ci entraînent des lésions de l’ADN qui peuvent conduire à l’oncogenèse. Les conséquences de cette exposition sont dose-dépendantes et apparaissent des années après l’exposition. Ce facteur de risque a été largement étudié chez les survivants à la bombe atomique qui ont subi des expositions élevées aux RI. De même, les patients pédiatriques exposés aux RI pour des tumeurs primaires, ont un risque plus élevé de développer une tumeur du SNC secondaire au cours de leur vie (Braganza et al. 2012). L’utilisation des téléphones mobiles est un sujet sensible quant aux risques que leur usage au quotidien représente pour notre cerveau. En effet, l’émission d’ondes radiofréquences (RF) par un mobile pourrait sur le long-terme avoir des effets néfastes sur le tissu nerveux. En 2011, l’agence du CIRC (Centre International de Recherche sur le Cancer) a classé les ondes RF émises par les téléphones portables comme « peut-être cancérogènes pour l’Homme » (groupe 2B). De nombreuses études s’intéressent à ce sujet, bien qu’aucune n’apporte de réponses claires et précises. D’une part, certaines ne montrent pas d’augmentation de risque, sauf sur une période supérieure à 10 ans, lors d’utilisation du côté ipsilatéral (Hardell et al. 2007; Little et al. 2012). D’autre part, une étude française de 2015 fait référence à une augmentation du risque de développer des méningiomes ou des gliomes, lors d’une utilisation chronique de portable. Une étude récente, en se basant sur les connaissances actuelles de la science sur ce sujet recommande à l’agence du CIRC de réévaluer la nocivité des ondes RF (Miller et al. 2019). Des études complémentaires de plus grande ampleur et sur le long terme sont nécessaires afin de clarifier l’impact des ondes RF émises par les téléphones portables sur le risque de développer des gliomes. D’autant plus que l’utilisation des téléphones portables est en constante évolution et l’exposition aux ondes RF touche de plus en plus les jeunes. De nombreuses études épidémiologiques ont d’autre part montré que les patients qui ont un terrain allergique (allergie alimentaire, asthme, eczéma…) se verraient protéger face à de nombreux cancers dont les tumeurs du SNC : ainsi les patients allergiques auraient 30% en moins de risque de développer un gliome (Amirian et al. 2016). Les patients atteints de gliome ont des taux d’immunoglobuline E (IgE), marqueurs de l’allergie, inférieurs à la moyenne. L’expression du marqueur CD133, marqueur d’agressivité du GBM, est négativement corrélée à l’expression des gènes en lien avec l’allergie et l’inflammation (Schwartzbaum et al. 2010). L’une des hypothèses avancées de l’effet protecteur d’un état allergique pourrait s’expliquer par un système immunitaire inné plus réactif face à des antigènes. Les antigènes tumoraux seraient ainsi reconnus plus précocement et les cellules tumorales seraient ciblées par le système immunitaire. Bien que la majorité des gliomes apparaissent de manière sporadique, sans lien avec les autres membres de la famille, il existe de rares syndromes héréditaires fortement associés au développement de gliomes. Ces syndromes sont responsables de moins de 5% de l’ensemble des gliomes. Il s’agit :
– Du syndrome Li-Fraumeni associé à une mutation du gène p53, qui prédispose au développement de nombreux cancers dont le GBM,
– De la neurofibromatose 1, liée à une mutation du gène NF1, qui entraine le développement de tumeurs cutanées mais aussi cérébrales.
Concernant le régime alimentaire, la consommation d’alcool ou de tabac, ou l’exposition à des pesticides, aucun n’a été reconnu comme facteur de risque dans le développement de tumeur du SNC.

Chirurgie

   La chirurgie est la clé de voute du traitement des gliomes chez l’Homme. Cependant, la mise en place d’un traitement chirurgical repose sur certains facteurs. En effet, l’âge du patient, l’ indice de performance (quantifié par l’indice de Karnofsky (KPS) ou l’indice fonctionnel de l’OMS) et la localisation tumorale peuvent indiquer ou non la prise en charge chirurgicale. Une indice KPS supérieur à 70% est en faveur de la chirurgie. La décision finale est une décision collégiale entre neurochirurgien, neurologue, oncologue et anesthésiste : elle évalue le bénéfice de la chirurgie par rapport aux risques per- et post-opératoires. L’étendue de la résection tumorale (EOR) est une évaluation, en pourcentage, de l’efficacité de l’ablation tumorale (Stupp et al. 2014). L’EOR est un facteur prédictif pour la survie post-opératoire du patient : meilleure est l’EOR, meilleure est la médiane de survie du patient. En effet, il a été démontré que l’on retrouve des cellules tumorales 20 mm au-delà des anomalies anatomiques objectivées en IRM, et chez les patients atteints de GBM, on peut les retrouver du côté contro-latéral. Chez les patients atteints de GBM, une EOR > 80% permet d’améliorer le taux de survie (Oppenlander et al. 2014; Brown et al. 2016). L’imagerie préopératoire (DTI, IRMf) est essentielle puisqu’elle guide le chirurgien dans la résection de la tumeur et dans l’obtention de marge saine, on parle alors de résection supra-maximale. L’IRM intra-opératoire (IRMi) permet, quant à elle, une neuronavigation précise du chirurgien : par exemple elle permet d’objectiver un déplacement partiel du cerveau fréquemment observé lors de la craniotomie, ou de la résection tumorale. Par ailleurs, cette technique d’imagerie intra-opératoire permet d’augmenter l’EOR, contrairement à une chirurgie conventionnelle (Senft et al. 2011; D’Amico et al. 2017). Cependant, cette technique est peu répandue actuellement du fait de l’augmentation du temps chirurgical et du surcoût associé à l’équipement nécessaire et à l’adaptation des salles opératoires. (Young et al. 2015). L’échographie intra-opératoire peut être une option économiquement plus abordable que l’IRMi, tout en apportant des informations complémentaires aux neurochirurgiens. Les images échographiques permettent en effet d’identifier les tumeurs résiduelles en temps réel, ainsi que la vascularisation péri-tumorale. Des études complémentaires sont nécessaires pour appuyer le développement de l’échographie intra-opératoire. La craniotomie éveillée est une méthode fréquemment employée, principalement lorsque la localisation de la tumeur est proche du « cortex éloquent », c’est-à-dire, proche des aires du cerveau dédiées à la parole ou au mouvement (aire de Broca, aire de Wernicke, gyrus précentral). Une fois la boîte crânienne ouverte, le patient est réveillé et le neurochirurgien délivre des neurostimulations aux aires corticales, afin de déterminer les limites tumorales. Simultanément, un neurologue évalue en continu les fonctions motrices et vocales du patient. Un défaut de l’élocution ou de la motricité lors de la neurostimulation traduit une stimulation corticale par le neurochirurgien : il définit ainsi le contour de la tumeur. Une fois l’ensemble de la tumeur délimitée, le patient est de nouveau endormi et l’exérèse se poursuit. Il existe des contre-indications à ce type d’intervention : les patients claustrophobes, avec des troubles psychiatriques, une toux chronique, une dysphagie, une hémiplégie, ne sont pas éligibles à ce type d’opération (Hervey-Jumper, Berger 2016; Chacko et al. 2013; Meyer et al. 2001). Une autre méthode de délimitation de la tumeur consiste en l’administration orale préopératoire d’une prodrogue non-fluorescente; le 5-ALA (5-Aminolevulinic Acid). Celui-ci va être transformé et s’accumuler au sein des cellules cancéreuses sous forme de porphyrines fluorescentes (Protoporphyrine IX [PpIX] principalement). La concentration de ce marqueur fluorescent est maximale durant 12 heures. Le chirurgien, équipé de lentilles adaptées sur le microscope chirurgical, peut ainsi avoir une délimitation précise de la masse tumorale, sous lumière UV. Comme le montre la Figure 11, la fluorescence émise permet de retirer les résidus de cellules tumorales, qui auraient pu être laissées in situ sans cette approche. Le 5-ALA permet alors d’obtenir une meilleure EOR et les patients bénéficient  d’une augmentation de 50% du taux de survie à 6 mois (41% pour ceux traités avec le 5-ALA par rapport à 21.1% pour ceux traités en chirurgie conventionnelle) (Stummer et al. 2006). Cette technique à faible coût, facile d’utilisation et avec de faibles effets secondaires (photosensibilité du patient pendant 24-48 heures), est un outil de choix pour aider les neurochirurgiens dans la résection totale des tumeurs cérébrales. L’utilisation du 5-ALA combinée avec l’IRMi permet de meilleures résections tumorales par rapport à l’utilisation seule de l’IRMi (Bander, Magge, Ramakrishna 2018). Par ailleurs, certaines études ont démontré que la PpIX peut être utilisée pour la photothérapie dynamique. Sous l’action de la lumière, cette molécule va libérer des radicaux libres qui vont endommager des cibles cellulaires autres que l’ADN, comme les mitochondries.

Table des matières

Introduction
I. Étude bibliographique
A. Les gliomes diffus
Définition histopathologique
a) Les cellules de la glie
b) Classification des gliomes selon l’OMS
Épidémiologie
a) Incidence
b) Facteurs de risque
Diagnostic
a) Clinique
b) Radiologique
(1) Tomodensitométrie (TDM)
(2) Modalités anatomiques et fonctionnelles de l’IRM
(3) La tomographie à émission de positons (TEP)
c) Anatomopathologique
d) Biomarqueurs circulants
Traitement
a) Chirurgie
b) Radiothérapie
c) Chimiothérapie
d) Immunothérapie
e) Traitements adjuvants
f) Résistance aux traitements
Pronostic
B. Le chien comme modèle d’étude en oncologie comparative
Intérêts du modèle canin
a) Arguments en faveur d’une convergence nosologique entre gliomes canins et humains
(1) Arguments épidémiologiques
(2) Arguments génétiques
(3) Arguments étiopathogéniques
(4) Arguments morphologiques
b) Avantages du modèle canin par rapport au modèle murin
Les lignées cellulaires de gliomes canins comme modèle d’étude in vitro
C. Les nanotubes de carbone
Structure des nanotubes de carbone
a) Une nouvelle forme allotropique du carbone
b) Classification des nanotubes de carbone
Synthèse des nanotubes de carbone et purification
Fonctionnalisation des nanotubes de carbone
a) Purification des nanotubes de carbone
b) Fonctionnalisation covalente
c) Fonctionnalisation non-covalente
Caractérisation des nanotubes de carbone
a) La spectroscopie Raman
b) La microscopie électronique
c) La microscopie à sonde locale
d) Autres techniques de caractérisation des NTC
Toxicité des nanotubes de carbone
Propriétés et différentes applications des NTC
Intérêts des NTC dans le traitement du gliome
Synthèse de la revue bibliographique et objectifs de la thèse
II. Étude expérimentale
A. Caractérisation de lignées cellulaires de gliomes canins à but translationnel : article en cours de soumission auprès de Frontiers in Veterinary Sciences
B. Étude de l’effet radiosensibilisant des NTC sur les lignées de gliomes canins
Matériel et méthode
a) Préparation des NTC
(1) Synthèse des NTC
(2) Extraction et rinçage des NTC
(3) Fonctionnalisation endoédrique des NTC par du chlorure de gadolinium
(4) Dispersion des NTC
b) Évaluation de la pénétration des NTC dans les cellules de gliomes canins
(1) Microscopie biphotonique
(2) Spectroscopie Raman
c) Évaluation de la cytoxicité des NTC
(1) Évaluation au bleu de trypan
(2) Évaluation au WST-1
d) Étude du cycle cellulaire
e) Étude de l’effet radiosensibilisant des NTC
(1) Test de survie SF2
(2) Test de clonogénicité
Résultats
a) Évaluation de la pénétration des NTC dans les cellules de gliome canin
(1) Microscopie biphotonique
(2) Spectroscopie Raman
b) Évaluation de la cytotoxicité des NTC
(1) Évaluation de la cytotoxicité au bleu de trypan
(2) Évaluation au WST1
c) Évaluation de l’effet de NTC sur le cycle cellulaire
d) Étude de la radiosensibilisation de la lignée cellulaire de gliome canin J3T par les NTC
(1) Calcul des valeurs SF2
(2) MID
Discussion
Perspectives futures
Conclusion générale
Publications scientifiques
Bibliographie

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