Etude de l‟effet de l‟extrait sur la suffocation provoquée par l‟histamine

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PARTIE CHIMIQUE

Préparation de l’extrait

Les feuilles de la plante utilisée dans cette étude, ont été récoltées au mois de Mars 2016 à Ankatso dans la région Analamanga. Les feuilles ont été séchées à l‟ombre dans une salle bien aérée à la température ambiante pendant une semaine. Après séchage, elles ont été broyées à l‟aide d‟un broyeur à marteau au LPGPC, Faculté des Sciences, Université d‟Antananarivo.
Deux cent cinquante grammes de la poudre obtenue ont été macérés dans un mélange éthanol – eau (60 : 40), à la température ambiante pendant 72h en agitant le mélange 3 fois par jour. Le macérât a ensuite été filtré sur du coton hydrophile, puis le filtrat a été évaporé à sec à l‟aide d‟un distillateur à la température de 80°C. L‟extrait obtenu a été codé MF11 puis pesé pour calculer le rendement de l‟extraction selon la formule .

Criblage phytochimique

Le criblage phytochimique est un test qualitatif, il a pour objectif de détecter les différentes familles chimiques présentes dans un extrait et d‟estimer leur teneur relative. Les tests utilisés sont basés sur l‟utilisation de réactifs spécifiques et la présence de la famille correspondante est caractérisée par l‟apparition de complexes insolubles se présentant sous forme de précipité et/ou d‟un changement de coloration (FONG H. H. S. et coll., 1977) (Tableau I).
Les signes suivants ont été utilisés pour désigner la teneur de familles chimiques présentes dans l‟extrait :
± : présence en très faible teneur
+ : présence en faible teneur
++ : Présence en teneur moyenne
+++ : Présence en très forte teneur

PARTIE PHARMACOLOGIQUE

L‟activité de l‟extrait MF11 a été étudiée chez le cobaye. Des tests in vivo et in vitro ont été effectués. Son effet sur la gêne respiratoire provoquée par l‟histamine a été étudiée in vivo (COLOT M., 1972), tandis que son mécanisme d‟action a été étudié in vitro sur la trachée isolée de cobaye (SATAKE K. et coll., 1998).

Animaux d’expérimentation

Des cochons d‟inde des deux sexes, âgés de 3 mois, pesant entre 280 g et 296 g ont été utilisés. Ils ont été nourris avec des feuilles de graminées fraîches et acclimatés aux conditions de l‟animalerie du LPGPC à la température de 20°C et une alternance de lumière et d‟obscurité de 12h/12h.

Sélection des animaux

Les animaux utilisés dans les tests ont été sélectionnés suivant leur sensibilité à l‟histamine. Ils ont été placés dans un dispositif expérimental de 25 cm de diamètre et de 23 cm de hauteur muni d‟un couvercle, puis une solution d‟histamine à 5 % a été pulvérisée sous ce dispositif. Seuls les animaux qui ont présenté des signes de détresse respiratoire dans les 3 premières minutes ont été considérés comme sensibles et sélectionnés pour les tests biologiques (COLOT M., 1972).

Etude de l’effet de l’extrait sur la suffocation provoquée par l’histamine

Les animaux sélectionnés ont été mis à jeun pendant 12h avant la manipulation, puis répartis en 3 lots : 1 lot témoin et 2 lots traités avec l‟extrait. Les animaux du lot témoin ont reçu de l‟eau distillée ; ceux du deuxième lot ont reçu l‟extrait à la dose de 150 mg/kg et ceux du troisième lot ont reçu l‟extrait à la dose de 300 mg/kg. L‟extrait et l‟eau distillée ont été administrés par voie orale dans un volume de 10 ml/kg (HARRIS P. N. et coll., 1952).
Trente minutes après administration de l‟eau distillée et de l‟extrait, un animal par lot ont été placés dans le dispositif pendant 3minutes (Figure 1) (CHAUCHAN et coll., 2012). Ensuite, la solution de l‟histamine à 5% a été pulvérisée dans ce dispositif et cette expérience a été répétée 3 fois. Le temps d‟apparition des signes de suffocation chez les animaux a été noté (COLOT M., 1972).

Etude de l’effet de l’extrait in vitro

Des tests in vitro sur la trachée isolée de cobaye ont été effectués pour étudier l‟activité bronchodilatatrice de l‟extrait (SATAKE K. et coll., 1998).

Préparation de la solution de Tyrode

La solution de Tyrode a été choisie comme solution de survie utilisée lors des tests in vitro (tableau II) (BRUNELLESCHI S. et coll., 1987 ; HAZEKAMP A. et coll., 2001).

Préparation de la trachée isolée

Des cobayes de 3 mois, sans distinction de sexe, pesant entre 280 g et 296 g ont été utilisés. L‟animal a été sacrifié puis exsanguiné en coupant les carotides, ensuite une thoracotomie a été effectuée et la trachée été prélevée rapidement et placée dans une boite de pétri contenant une solution de Tyrode aérée avec de l‟air à l‟aide d‟un aérateur électrique. Un segment de 2cm de la trachée a été débarrassé des mésentères et des tissus adipeux, puis découpée en spirale (BRUNELLESCHI S. et coll., 1987 ; HAZEKAMP A. et coll., 2001).

Montage de la trachée dans la cuve à organe isolé

La trachée découpée en spirale été montée dans une cuve à organe isolé contenant 20 ml de solution de Tyrode aérée avec de l‟air à l‟aide d‟un aérateur, et maintenue à la température de 37°C (SHETH U. K. et coll., 1972).
Une des 2 extrémités de l‟organe a été fixée au fond de la cuve à l‟aide d‟un fil de coton inextensible, tandis que l‟autre extrémité a été reliée à un stylet enregistreur avec un contre poids de 1g (ANITA A. M. et ARCHANA N. P., 2008). L‟organe a été laissé s‟équilibrer pendant 90 minutes. Pendant cette période, le milieu de survie a été renouvelé toutes les 15minutes (SHETH U. K. et coll., 1972).
Après les 90 minutes d‟équilibration, la viabilité de l‟organe a été testée en injectant l‟Histamine dans le bain à la concentration de 10-7M. Puis, l‟organe a été laissé se stabiliser pendant 30 minutes en changeant le milieu toutes les 15 minutes.

Etude de l’activité bronchodilatatrice de l’extrait MF11

L‟histamine a été utilisée pour provoquer la bronchoconstriction (SATAKE K. et coll., 1998) afin d‟étudier l‟activité bronchodilatatrice de l‟extrait. Elle a été injectée dans le bain d‟une manière cumulative pour réaliser des concentrations croissantes à partir de la concentration de 10-10 M dans le bain, jusqu‟à la contraction maximale de la trachée. Au plateau de la contraction, l‟extrait a été injecté dans la cuve d‟une manière cumulative à partir de la concentration de 0,25 mg/ml jusqu‟au relâchement total de la trachée contractée par l‟histamine. Le volume total des solutions injectées dans le bain n‟a pas dépassé 10 % du volume total de la cuve (VAN ROSSUM J. M., 1963). L‟amplitude des contractions a été mesurée et la CE50 de l‟histamine a été déterminée par régression dans la partie linéaire de la courbe cadrant 50 % de l‟effet maximal.

Etude du mécanisme d’action de l’extrait

L‟histamine a été utilisée dans le but d‟étudier le mécanisme d‟action de l‟extrait, la trachée a été pré incubée dans un bain contenant l‟extrait avant de la contracter avec l‟histamine (TSUKIAMA H. et coll., 2007 ; KUMAR P. S. et coll., 2007). Après le test de viabilité de la trachée, l‟Histamine a été injectée dans le bain d‟une manière cumulative à partir de 10-10M dans le bain jusqu‟à l‟obtention de la contraction maximale de la trachée. La préparation a ensuite été rincée puis laissée se stabiliser. Après cette période, l‟extrait a été injecté dans le bain à la concentration de 0,25 mg/ml, puis la trachée a été laissée en contact avec l‟extrait pendant 10 minutes. Après ce temps d‟incubation, l‟histamine a été injectée dans le bain d‟une façon cumulative jusqu‟à la contraction maximale de l‟organe. Cette manipulation a été reprise en pré incubant l‟organe dans un bain contenant l‟extrait à la concentration de 0,5mg/ml (LEE H. M. et coll., 1952).
L‟amplitude des contractions a été mesurée puis exprimée en pourcentage de la contraction maximale et rapportée sur un papier semi logarithmique en fonction de la concentration de l‟histamine dans le bain, en absence et en présence de l‟extrait. La CE50 de l‟histamine en absence et en présence de MF11 a été déterminée graphiquement. Et pour étudier le mécanisme d‟action de l‟extrait, l‟amplitude des contactions maximales ainsi que les CE50 ont été comparées entre elles.

EXPRESSION ET ANALYSES DES RESULTATS

Les résultats ont été exprimés en moyenne ± e.s.m. les moyennes ont été comparées en utilisant le test „t‟ de Student avec le logiciel « Microsoft office Excel 2010 ». La différence a été considérée comme significative lorsque la valeur de p est inférieure à 0 ,05.

PARTIE CHIMIQUE

Rendement de l’extraction

La macération des 250 g de poudre dans un mélange éthanol : eau (60 – 40) pendant 3 jours donne 60 g d‟extrait, ce qui correspond à un rendement de 24 %.

Les familles chimiques présentes dans l’extrait

Le criblage phytochimique effectué sur l‟extrait révèle qu‟il contient une forte teneur en terpenoïdes, une teneur moyenne en anthocyanes, alcaloïdes et sucres réducteurs. Puis, les polysaccharides, les flavonoïdes et les composés phénoliques sont présents en faible teneur dans l‟extrait (Tableau III).

Mécanisme d’action de MF11

En injectant l‟histamine dans le bain, la trachée se contracte, et l‟amplitude de la contraction augmente en fonction de sa concentration dans le bain. A la concentration de 10-7 M, la contraction est égale à 100 %. La détermination graphique du CE50 en utilisant de papier semi-logarithme donne 3,5.10-9 M. En pré incubant la trachée dans un bain contenant l‟extrait MF11, l‟effet maximal de l‟histamine diminue et sa CE50 augmente. En présence de 0,25 et 0,50 mg/ml d‟extrait dans le bain, l‟effet maximal diminue respectivement à 64 % et 34 % avec des CE50 correspondant à 0,4.10-8 M et 2,2.10-8 M (p<0,05) (Figure 4).

DISCUSSION

Ce travail a pour objectif d‟étudier l‟activité de MF11 sur le bronchospasme en effectuant des tests in vivo chez le cobaye et des tests in vitro sur la trachée isolée.
Compte tenu du rôle joué par l‟histamine lors de la bronchoconstriction au cours d‟une crise d‟asthme, l‟histamine a été utilisée lors des tests de suffocation in vivo (SATAKE K. et coll., 1998). Les résultats que nous avions obtenus montrent que l‟extrait MF11 augmente le temps d‟apparition des signes de suffocation. Les animaux qui ne présentent aucun signe d‟étouffement pendant les 3 premières minutes qui ont suivi la pulvérisation de l‟histamine dans le dispositif expérimental ont été considérés comme protégés de son effet bronchoconstricteur (ZONGO R. F. E., 2014). Cette absence des signes de suffocation pourrait être due à l‟effet bronchodilatateur de l‟extrait. Comme c‟est le cas de l‟extrait CSK qui augmente également le temps d‟apparition de la gêne respiratoire, en utilisant les mêmes procédés (LAHADSON S. F., 2013).
Pour expliquer les résultats obtenus in vivo, des tests sur organe isolé ont été effectués en contractant la trachée isolée de cobaye avec l‟histamine. Lors de ces tests in vitro, l‟extrait relâche la trachée contractée par l‟histamine exogène. Cet effet bronchodilatateur de MF11 dépend de sa concentration dans le bain. Ceci explique pourquoi les animaux traités avec l‟extrait sont protégés contre la suffocation provoquée par l‟histamine. Cette activité bronchodilatatrice pourrait être due à l‟inhibition de l‟histamine. Deux cas peuvent se présenter : soit l‟extrait inhibe l‟histamine d‟une façon non compétitive, soit cette inhibition est compétitive. D‟après nos résultats, la contraction maximale provoquée par l‟histamine diminue, et sa CE50 augmente en présence de l‟extrait, ce qui veut dire que l‟extrait inhibe l‟histamine d‟une manière non compétitive. Deux cas encore peuvent se présenter : soit le principe actif occupe un récepteur autre que celui de l‟histamine, dont l‟occupation par l‟extrait MF11 déformerait le récepteur histaminergique, ce qui empêche la liaison de l‟histamine à son récepteur (BAROODY F. M. et coll., 2000). Soit il possèderait une activité bronchodilatatrice propre qui s‟oppose à l‟effet bronchoconstricteur de l‟histamine (MEHDI C., 2008). Par exemple, il se fixe au niveau des récepteurs β-adrénergiques, et relâche le muscle lisse bronchique et soulage ainsi la gêne respiratoire provoquée par l‟histamine (ZONGO R. F. E., 2014). Cette propriété se retrouve dans le cas de Ephedra sinica qui possède un effet bronchodilatateur propre avec l‟Ephédrine qui stimule le système nerveux sympathique (BHOOMIKA R. G. et coll., 2007 ; MULLER J. N., 2009).
L‟action des alcaloïdes sur le récepteur bêta a également été rapportée par BOUSTA D. et ses collaborateurs (2001) avec Atropa belladonna et par GUESSAN K. et ses collaborateurs (2009) sur Ficus exaspeata, dont l‟activité bronchodilatatrice est attribuée aux alcaloïdes. Certains alcaloïdes du type méthylxanthine, comme la théophylline, substances actives des feuilles du thé, du café et du guarana, agissent comme bronchodilatateurs en inhibant l‟enzyme phosphodiestérase (MULLER J. N., 2009 ; BELLIA V. et coll., 2006). Enfin, comme c‟est le cas de l‟extrait Waltheria indica L. (MALVACEAE) qui inhibe la bronchoconstriction (ZONGO R. F. E., 2014).
Une crise d‟asthme est aussi aggravée par une hypersécrétion de mucus par les cellules calciformes produisant une quantité accrue des mucines (BURGEL P. R., 2001). En plus, de la bronchoconstriction provoquée par l‟histamine (GILLES G., 2006), le mucus rétrécit le diamètre des bronches et les bronchioles en aggravant la dyspnée respiratoire (MULLER J. N., 2009). L‟obstruction des voies respiratoires par des bouchons muqueux provoque une asphyxie, une des causes majeures de mortalité au cours d‟une crise d‟asthme (BURGEL P. R., 2001). D‟après la littérature, les flavonoïdes pourraient réduire la sécrétion de mucus bronchiques (ZEGHAD N., 2009). Comme c‟est le cas de l‟extrait de plantes comme Eucalyptus globulus, Malva sylvestris et Zingiber officinalis qui inhibent la sécrétion de mucus (ROJAS U. R. E. et coll., 2010). Parmi les flavonoïdes, la Quercetine possède des activités anti-inflammatoires (TEIXERIE S., 2002) et réduit le risque de l‟asthme (KNEKT P. et coll., 2002).
La présence de ces familles chimiques pourrait être le responsable de la protection des animaux contre la détresse respiratoire provoquée par l‟histamine, ce qui justifie l‟utilisation empirique de la plante dans la prise en charge de la crise d‟asthme.
Des études plus approfondies seraient nécessaires pour élucider le mécanisme d‟action de l‟extrait ainsi que les familles chimiques responsables de son activité bronchodilatatrice en effectuant des tests in vitro avec d‟autres agonistes contracturant.

CONCLUSION

Les tests in vivo et in vitro effectués avec l‟extrait MF11 montrent que MF11 protège les animaux contre la gêne respiratoire provoquée par l‟histamine exogène, et relâche la trachée contractée par l‟histamine. Ces résultats montent que l‟extrait MF11 possède une activité bronchodilatatrice, et pourrait être utilisée en cas de crise d‟asthme d‟origine allergique. Ceci justifie l‟utilisation empirique de la plante à partir de laquelle, MF11 a été extrait. Les alcaloïdes et/ou flavonoïdes pourraient être responsables de cette activité.

Table des matières

I. INTRODUCTION
II. MATERIELS ET METHODES
A. PARTIE CHIMIQUE
1. Préparation de l‟extrait
2. Criblage phytochimique
B. PARTIE PHARMACOLOGIQUE
1. Animaux d‟expérimentation
2. Sélection des animaux
3. Etude de l‟effet de l‟extrait sur la suffocation provoquée par l‟histamine
4. Etude de l‟effet de l‟extrait in vitro
a .Préparation de la solution de Tyrode
b. Préparation de la trachée isolée
c .Montage de la trachée dans la cuve à organe isolé
d. Etude de l‟activité bronchodilatatrice de l‟extrait MF11
e. Etude du mécanisme d‟action de l‟extrait
EXPRESSION ET ANALYSES DES RESULTATS
III. RESULTATS
A. PARTIE CHIMIQUE
1. Rendement de l‟extraction
Les familles chimiques présentes dans l’extrait
B. PARTIE PHARMACOLOGIQUE
1. Effet de l‟extrait sur la suffocation provoquée par l‟histamine
2. Effet de MF11 sur la contraction de la trachée provoquée par l‟Histamine
3. Mécanisme d‟action de MF11
IV. DISCUSSION
CONCLUSION
BIBLIOGRAPHIE

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