Etude de l’effet de l’extrait NAS20 sur la peur de l’espace ouvert

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PARTIE CHIMIQUE

Préparation de l’extrait

Les feuilles de la plante ont été récoltées aux alentours d’Ambatofotsy le 12 décembre 2015. Elles ont été séchées dans un endroit aéré, à l’abri du soleil et à la température ambiante pendant trois mois et demi. Une fois séchées, les feuilles ont été broyées à l’aide d’un broyeur électrique au LPGPC, Faculté des Sciences d’Antananarivo. Deux cent cinquante grammes (250g) de la poudre obtenue ont été macérés dans un mélange éthanol-eau (60 : 40) à la température ambiante pendant 5 jours. Le macérât ainsi obtenu a ensuite été filtré sur un coton hydrophile ; puis ce filtrat a été évaporé à sec à l’aide d’un distillateur, à la température de 80°C. L’extrait sec obtenu a été codé NAS20, puis pesé pour calculer le rendement de l’extraction selon la formule :
????????? (%)=????? ?? ?′??????? ??? (?)????? ?? ?? ?????? ?? ?é???? (?)×100.

Criblage phytochimique

Pour identifier les familles chimiques présentes dans l’extrait NAS20, un criblage phytochimique a été effectué. Ce test est basé sur la formation de précipité ou le changement de coloration de l’extrait en présence d’un réactif spécifique en présence de la famille chimique correspondante dans l’extrait (FONG H.H.S. et coll., 1977) (tableau I).
Afin de quantifier la teneur relative des familles chimiques présentes dans l’extrait, les signes suivants ont été utilisés :
+ : Présence en faible quantité.
++ : Présence en quantité moyenne.
+++ : Présence en forte quantité.

PARTIE PHARMACOLOGIQUE

Dans le but d’étudier l’activité anxiolytique de l’extrait NAS20, des tests in vivo ont été effectués chez la souris. Le comportement des souris placées sur « le labyrinthe en croix surélevé » (LISTER R. G., 1987; WALF A. A. et coll., 2007) et sur « la planche à trous » (COTRIM M. D. et coll., 1998; TAKEDA H. et coll., 1998) a été observé.

Animaux d’expérimentation

Des souris mâles de race SWISS âgées de 8 à 10 semaines, pesant entre 15 et 25 g, ont été utilisées. Elles ont été élevées au sein de l’animalerie au LPGPC, Faculté des Sciences d’Antananarivo, avec un cycle 12h lumière / 12h obscurité, à la température de 22 ± 2°C. Elles ont été nourries avec de la provende LFL 14/20, et ont eu libre accès à l’eau (BROUSTAIL. 1967 ; LAROCHE M. J. et coll., 1990 ; KANYONGA P. M. et coll., 2010). Les souris ont été mises à jeun 12 heures avant l’expérience, mais elles ont eu un libre accès à l’eau (HELLION-IBARROLA M. et coll., 2006). Une heure avant le test, les animaux ont été acclimatés dans la pièce d’expérimentation, une pièce très calme et dans la pénombre (DOUKKALI Z. et coll., 2016).

Étude de l’effet de l’extrait NAS20 sur la peur du vide

Un labyrinthe surélevé (EPM) a été utilisé pour étudier l’effet anxiolytique de l’extrait NAS20. Les bras ouverts du labyrinthe représentent le vide qui est un facteur anxiogène chez la souris (RODGERS R. J. et coll., 1997). Le labyrinthe surélevé a été fabriqué avec une planche peinte en noire avec des pieds peints en blanc. Il se présente sous forme de croix, avec 4 bras : 2 bras opposés ont été fermés par des parois verticales (35 x 5 x 15 cm), tandis que les 2 autres ont été laissés ouverts (35 x 5 cm). Il comporte des pieds au nombre de quatre, de 40 cm de hauteur (HATAT et coll., 2001 ; TAMBOUR et coll., 2005). (Figure 1)
Les souris ont été réparties en 4 lots : 1 lot témoin et 2 lots traités avec l’extrait NAS20, et le 4ème lot a été traité avec du Valium, qui a servi de produit de référence. Les souris du lot témoin ont reçu 10 ml/kg d’eau distillée par voie orale, tandis que les souris des 2 autres lots ont reçu par voie orale l’extrait NAS20 aux doses de 250 et 500 mg/kg, dissout dans un volume de 10 ml/kg. Enfin, les souris du 4ème lot ont reçu 2 mg/kg de Valium dissout dans du NaCl 9 ‰ par voie intra péritonéale (i.p.) dans un volume de 10 ml/kg (CLOMBOK S. et coll., 1991).
Trente minutes après l’administration de ces produits, les souris ont été placées une à une sur la plateforme centrale. Le nombre d’entrées et le temps passé dans les bras ouverts ont été enregistrés pendant 5 min.
Lorsque les 4 pattes de la souris sont entrées dans un bras ouvert, cela a été compté comme une entrée dans le bras ouvert (ADEYEMI O. O. et coll., 2006).

Etude de l’effet de l’extrait NAS20 sur la peur de l’espace ouvert

Une « planche à trous » a été utilisée pour étudier l’activité anxiolytique de l’extrait NAS20. C’est un dispositif qui permet d’étudier la réaction de curiosité et le désir de fuite d’un rongeur placé dans un espace ouvert (KANYONGA P. M. et coll., 2010). La planche à trous a été fabriquée avec une planche en bois de 36 cm x 36 cm (0, 5 cm d’épaisseur).
Elle comporte 16 trous de 3 cm de diamètre, espacés de 2, 2 cm, et est encadrée par un enclos transparent et équidistants les uns des autres (BOISSIER J. R. et coll., 1964) (Figure 2).
Les souris ont été mises à jeun pendant 12 heures, puis réparties en 4 lots : 1 lot témoin, 2 lots traités avec l’extrait, et 1 lot de référence. Les animaux du lot témoin ont reçu de l’eau distillée, et les animaux des 2 lots ont reçu l’extrait aux doses respectives de 250 et 500 mg/kg par voie orale dans un volume de 10 ml/kg. Enfin, les animaux du lot de référence ont reçu 2 mg/kg de Valium dissout dans un sérum physiologique NaCl 9 ‰ par voie intra péritonéale dans un volume de 10 ml/kg (CLOMBOK S. et coll., 1991).
Trente minutes après, la souris a été placée au centre de la planche pendant 5 minutes ; et le nombre de fois où la souris a plongé sa tête dans un des trous a été compté (WOLFMAN C. et coll., 1994 ; YADAV A. V et coll., 2008).

EXPRESSION ET ANALYSES DES RESULTATS

Les résultats obtenus ont été exprimés en moyennes avec écarts types réduits (?̅ ± e.s.m), et les moyennes ont été comparées entre elles en utilisant le test paramétrique « t » de Student, avec un degré de signification p< 0,05.

RESULTATS DES TESTS PHARMACOLOGIQUES

Effet de NAS20 sur la peur du vide chez la souris

L’administration de l’extrait NAS20 par voie orale ainsi que l’injection de Valium par voie intra péritonéale augmentent le temps de passage des souris dans les bras ouverts du labyrinthe par rapport à celui des animaux du lot témoin.
Pendant les 5 minutes d’observation, les souris du lot témoin restent 3,33 ± 1,28 secondes dans les bras ouverts, tandis que les souris traitées avec l’extrait NAS20 aux doses de 250 et 500 mg/kg, restent respectivement pendant 15,67 ± 2,18 et 23,33 ± 1,67 secondes dans les bras ouverts du labyrinthe (p< 0,05).
Les souris traitées avec le Valium à la dose de 2 mg/kg, restent 56,33 ± 2,82 secondes dans les bras ouverts (p< 0,05) (figure 3).

Effet de NAS20 sur la peur de l’espace ouvert

L’administration de l’extrait NAS20 par voie orale ainsi que l’injection du Valium par voie intrapéritonéale diminuent le nombre de trous explorés par les souris par rapport à celui des animaux du lot témoin.
Pendant les 5 minutes d’observation, les animaux du lot témoin ont visité 24 ± 0,77 trous, contre 14,33 ± 0,90 et 11,33 ± 0,64 trous pour les souris traitées avec l’extrait aux doses respectives de 250 mg/kg et de 500 mg/kg, tandis que les animaux traités avec le Valium ont visité 7,00 ± 0,77 trous (p<0,05) (figure 4).

DISCUSSION

Notre objectif a été d’étudier l’activité anxiolytique de l’extrait NAS20. En effet, d’après les enquêtes ethno-pharmacologiques que nous avions effectuées à Ambatofotsy, le décocté des feuilles de la plante dans la famille des MYRTACEAE, à partir de laquelle l’extrait codée NAS20 est utilisé, calme le stress et la peur. Cette activité a été étudiée chez les souris, lesquelles servent de modèle idéal pour l’étude des produits anxiolytiques dans la mesure où elles sont de nature anxieuses (LISTER R. G., 1987). Deux dispositifs anxiogènes ont été mis en place pour étudier l’effet de l’extrait NAS20 sur le comportement d’évitement et d’exploration chez la souris. Le labyrinthe en croix surélevé a été utilisé pour étudier l’effet de l’extrait NAS20 sur la peur du vide chez les souris ; tandis que la planche à trous a servi à l’étude de son effet sur la peur de l’espace ouvert chez les souris.
Dans la présente étude, les souris ont reçu une dose de Valium, un anxiolytique de la classe des benzodiazépines (KANYONGA P. M. et coll., 2009), le Valium est utilisé comme produit de référence. Ce médicament potentialise l’effet de GABA qui est un inhibiteur au niveau du système nerveux central et en se liant sur le récepteur GABAA, il favorise l’ouverture du canal Chlore et exerce son effet inhibiteur.
Le labyrinthe en croix surélevé est l’un des modèles expérimentaux disponibles pour étudier l’effet anxiolytique d’un produit chez les souris. Dans le labyrinthe en croix surélevé, les bras ouverts situés à un niveau élevé provoquent la peur ; tandis que les bras fermés offrent aux souris la sécurité (RODGERS R. J. et coll., 1997). L’augmentation du nombre de passage ou la durée de temps passé dans les bras ouverts indique une activité anxiolytique d’un produit testé. Tout comme les animaux traités avec le Valium, les animaux traités avec l’extrait passent plus de temps dans les bras ouverts du labyrinthe par rapport aux animaux témoins. Cela signifie que leur peur du vide a diminué grâce à l’extrait NAS20.
En utilisant le même dispositif expérimental : d’un côté, COTRIM M. D. et ses collaborateurs (1999) ont étudié l’activité anxiolytique de l’extrait de Tilia europeae, et de l’autre côté, MOHAMMED S. P. et ses collaborateurs (2014), ont exploré l’effet de l’Ixora coccinea Linn. Ils ont obtenu les mêmes résultats et ont conclu que les extraits qu’ils ont étudiés possèdent une activité anxiolytique. Sur la base de ces résultats, l’extrait NAS20 possède une activité anxiolytique.
Sur la planche à trous, l’extrait diminue le nombre de trous explorés par les souris. Or cette planche a été conçue pour étudier le comportement des souris face au désir d’explorer et d’éviter les espaces ouverts (BOISSIER J. R. et coll., 1967). Les résultats des tests effectués sur la planche à trous montrent que l’extrait NAS20 et le Valium diminuent le nombre de trous explorés, et que les souris arrivent à rester plus longtemps dans l’espace ouvert. Autrement dit, ces produits ont réduit la peur des souris face à l’espace ouvert.
DOUKKALI Z. et coll., 2015, ont utilisé la planche à trous pour étudier l’activité anxiolytique de l’extrait méthanolique d’Urtica urens et les résultats qu’ils ont obtenus montrent une diminution du nombre de trous explorés, et ils ont conclu que cet extrait possède une activité anxiolytique.
Par analogie, nous pouvons dire que l’extrait NAS20 possède un effet anxiolytique. Pour diminuer l’anxiété des souris, l’extrait NAS20 devrait renforcer l’action du GABA, qui est un neuromédiateur modérateur au niveau du système nerveux central, ou inhiber l’action stimulatrice de la sérotonine ou de l’adrénaline (SANGER D. J., 1985 ; PURVES D. et coll., 2005).
Il est possible que l’extrait agisse de la même manière que les feuilles de Alchornea cordifolia (EUPHORBIACEAE) étudiées par KAMENAN A. et coll., 2013, ou chez la racine de Ixora coccinea Linn (RUBIACEAE) utilisée comme sédatif par MOHAMMED S. P. et coll., 2014. D’après les résultats de ces recherches, l’activité anxiolytique de ces extraits est due à la présence d’alcaloïdes, qui agissent comme agonistes des récepteurs GABAergiques.
Nous pouvons ainsi avancer une hypothèse que les alcaloïdes présents dans l’extrait NAS20 pourraient être responsables de l’activité anxiolytique.
Les triterpènes sont aussi dotés d’activité anxiolytique, comme chez Morus alba L. (MORACEAE) (mulberry) (YADAV A. V. et coll., 2008).
Comme le NAS20 contient des alcaloïdes et des triterpènes, ces familles chimiques pourraient être à l’origine de son activité anxiolytique chez la souris. Le mécanisme d’action anxiolytique de l’extrait NAS20 pourrait passer par le récepteur GABA, en se fixant sur le récepteur GABAA, pour rétablir le déséquilibre entre les neuromédiateurs activateurs (5HT/NOR) et modérateur (GABA) pour ramener l’inhibition GABAergique normale. Des études plus approfondies apporteraient plus de précisions sur son mécanisme d’action.

CONCLUSION

Les études effectuées sur l’extrait NAS20 montrent qu’il possède une activité anxiolytique.
Il diminue la peur du vide représenté par les bras ouverts du labyrinthe en croix surélevé, et la peur de l’espace ouvert sur la planche à trou. Cette activité pourrait résulter de la présence des alcaloïdes et des triterpènes dans l’extrait. En perspective, une étude plus approfondie de l’extrait NAS20 devrait être effectuée, en isolant les métabolites secondaires, afin d’étudier la ou les molécules responsables de l’effet ainsi que leurs mécanismes d’action.

Table des matières

LISTE DES SIGLES ET ABBREVIATIONS
A. INTRODUCTION
B. MATERIELS ET METHODES
I. PARTIE CHIMIQUE
1. Préparation de l’extrait
2. Criblage phytochimique
II. PARTIE PHARMACOLOGIQUE
1. Animaux d’expérimentation
2. Etude de l’effet de l’extrait NAS20 sur la peur du vide
3. Etude de l’effet de l’extrait NAS20 sur la peur de l’espace ouvert
III. EXPRESSION ET ANALYSES DES RESULTATS
C. RESULTATS
I. PARTIE CHIMIQUE
1. Rendement de l’extraction
2. Résultats du criblage phytochimique
II. RESULTATS DES TESTS PHARMACOLOGIQUES
1. Effet de NAS20 sur la peur du vide chez la souris
2. Effet de NAS20 sur la peur sur la peur de l’espace ouvert
D. DISCUSSION
CONCLUSION
BIBLIOGRAPHIES
WEBOGRAPHIES

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