Soutenance mémoire
La diarrhée présente une situation alarmante qui a conduit l’OMS à mettre en place en 1980, le Programme National de Lutte contre les Maladies Diarrhéiques (PNLMD), dont le but est de réduire la morbidité et la mortalité infantile. En effet, chaque année, on compte 1,7 milliards de cas de diarrhée dans le monde (OMS, 2017). C’est la troisième cause de décès provoqué par des maladies infectieuses, tout âge confondu, à l’échelle mondiale (OMS, 2011 ; ASSOGBA A.L et coll., 2012), et la 5ème cause de décès prématuré, tuant des jeunes enfants à un âge très précoce (OMS, 2014). Par ailleurs, c’est la deuxième cause de mortalité chez l’enfant de moins de cinq ans, avec 525 000 de décès par an (OMS, 2017). Madagascar n’est pas épargné par ce fléau, avec une prévalence particulièrement importante chez les bébés de 6 à 11 mois, qui représente 15 % en moyenne (ANDRIANJAKA J.C. et RAKOTONDRABE F.P., 2010). Cette prévalence très élevée est liée à l’insalubrité, à l’absence de système d’assainissement de l’eau et au manque d’hygiène qui sont à l’origine de 88 % des maladies diarrhéiques (PRÜSSUSTÜN A. et coll., 2008). Selon le Ministère de l’eau et de l’Assainissement, seuls 42,63 % de la population ont accès à de l’eau potable à Madagascar, jusqu’en 2010 (MINISTERE de l’EAU, 2011).
La diarrhée est caractérisée par des selles molles, voire liquides, dont la quantité et/ou la fréquence est anormalement élevée (BRYCE J. et coll., 2005). C’est le résultat d’une perturbation des mouvements d’eau et d’électrolytes au niveau de l’intestin (GUANDALINI S. et VAZIRI H., 2010). En effet, l’intestin joue un rôle majeur dans le maintien de l’équilibre hydro-électrolytique de l’organisme, en gardant l’équilibre entre la réabsorption et la sécrétion hydro électrolytique (MIN/SA, 1994). Il existe un flux bidirectionnel constant d’eau et d’ions à travers la muqueuse intestinale : l’absorption et la sécrétion, et la diarrhée est due à la baisse de la réabsorption par rapport à la sécrétion, ou à l’augmentation de la sécrétion. L’absorption a lieu au niveau des cellules des villosités, et la sécrétion, au niveau des cellules de crypte en grande partie (BINDER H.J. et REUBEN A., 2009). L’absorption de sodium est assurée par les entérocytes par une pompe Na+ -K+ /ATPase située au niveau des membranes basolatérales des cellules de cryptes et des villosités intestinales. L’absorption de Na+ entraine celle de l’eau ; par ailleurs, la sécrétion active de Clcontribue à la sécrétion d’eau (BINDER H.J., 2009).
PARTIE CHIMIE
Préparation de l’extrait
Les feuilles de la plante utilisées dans ce mémoire ont été récoltées dans la région Analamanga au mois de décembre 2016. Elles ont été séchées à l’ombre dans un endroit aéré et sec et à la température ambiante, pendant 50 jours. Elles ont ensuite été broyées à l’aide d’un broyeur à marteau électrique BROOK CROMPTON© série 2000 au Laboratoire de Pharmacologie Générale, de Pharmacocinétique et de Cosmétologie (LPGPC) à la Faculté des Sciences d’Antananarivo. Deux cent grammes de la poudre obtenue ont été macérés dans un mélange éthanol : eau (60 : 40), à la température ambiante, pendant 72 heures. Le macérât obtenu a été filtré sur du coton hydrophile, puis l’alcool a été évaporé à la température de 80 °C avec un distillateur, puis l’eau a été évaporée dans un bain marie à la température de 100 °C .
Criblage phytochimique
Un criblage phytochimique a été effectué pour détecter les familles chimiques présentes dans l’extrait MOHA-04. Cette méthode est basée sur la formation de complexes insolubles ou de complexes colorés, en utilisant des réactifs spécifiques pour chaque famille chimique (FONG H.H.S. et coll., 1977).
Avec :
++ présence en teneur moyenne
+ présence en faible teneur
± présence en très faible teneur .
PARTIE PHARMACOLOGIE
L’activité de l’extrait MOHA-04 a été étudiée chez les cochons d’Inde. Des tests in vivo ont été effectués pour étudier son effet sur la sécrétion intestinale et des tests in vitro, pour étudier son effet sur la motilité intestinale.
Animaux d’expérimentation
Des cochons d’Inde mâles et femelles, âgés de 3 à 5 mois et pesant entre 200 et 250 grammes ont été utilisés. Ces animaux ont été élevés à l’animalerie du Laboratoire de Pharmacologie Générale, de Pharmacologie Cinétique et de Cosmétologie (LPGPC). Ils ont été nourris avec des feuilles de graminées et ont eu accès libre à de l’eau.
Etude de l’effet de MOHA-04 sur la sécrétion intestinale
L’effet de MOHA-04 sur la sécrétion intestinale a été étudié in vivo sur une diarrhée expérimentale provoquée par le sulfate de magnésium (FINE K.D. et coll., 1991). L’extrait MOHA-04 et le sulfate de magnésium ont été dissouts dans de l’eau distillée. Puis les cochons d’Inde ont été mis à jeun 18 heures avant les manipulations. Ils ont ensuite été repartis en 3 lots: un lot témoin et deux lots traités avec l’extrait MOHA-04. Le lot témoin a reçu 10 ml/kg d’eau distillée, tandis que les deux autres lots ont reçu l’extrait MOHA-04 par voie orale aux doses respectives de 300 et 600 mg/kg dans 10 ml/kg d’eau distillée (MITHUM S. et coll., 2011). Quarante-cinq minutes après, tous les animaux ont reçu 2 g/kg de sulfate de magnésium, par voie orale, dans un volume de 10 ml/kg. Trente minutes après l’administration du sulfate de magnésium, les cochons d’Inde ont été euthanasiés avec 100 mg/kg de phénobarbital, administré par voie intramusculaire (LAKSHMINARAYANA M. et coll., 2011). Ensuite, ils ont étés mis en position décubitus dorsale et une laparotomie a été effectuée. Les animaux avec une longueur d’intestin grêle semblable ont été sélectionnés et une ligature a été faite au niveau du pylore et une autre au niveau du caecum. Le segment de l’intestinentre les deux ligatures a été prélevé dans sa totalité et son contenu a été versé dans un récipient gradué afin de mesurer le volume du fluide intestinal (GALVEZ J. et coll., 1993).
Etude de l’effet de MOHA-04 sur la motilité intestinale
L’activité de l’extrait MOHA-04 sur la motilité intestinale a été étudiée in vitro sur le duodénum isolé de cochon d’Inde, en utilisant de l’acétylcholine comme agent contracturant (RAJAMANICKAM V. et coll., 2010). Les cochons d’Inde ont été mis à jeun 18 heures avant les manipulations avec un accès libre à de l’eau. Ensuite, ils ont été euthanasiés avec 100 mg/kg de phénobarbital, injecté par voie intramusculaire (LAKSHMINARAYANA M. et coll., 2011), puis ils ont été mis en position décubitus dorsale, et une laparotomie a été effectuée afin de prélever le duodénum. L’organe ainsi prélevé a été tout de suite plongé dans une boîte de Pétri contenant une solution de Tyrode (TYRODE M., 1910), maintenue à la température de 37 °C, et aérée avec de l’air à l’aide d’un aérateur électrique.
L’organe a ensuite été nettoyé en débarrassant les mésentères puis découpé en morceaux de 2 cm de long. Puis l’organe a été monté dans une cuve à organe isolé à l’aide de 2 nœuds en fil de coton inextensible placés à ses 2 extrémités. Le premier nœud a été fixé à un crochet se trouvant au fond de la cuve, et le deuxième a été relié à un capteur isométrique Gould – Statham© sous une tension de 1,5 g (KAMGANG R. et coll., 2015). La cuve contenait 20 ml de solution de Tyrode maintenue à la température de 37 °C et aérée à l’aide d’un aérateur électrique. Les contractions du duodénum ont été enregistrées avec le logiciel SignalMonitor© (IOGA).
L’organe a été laissé se stabiliser dans la cuve pendant 45 minutes. Pendant cette période, il a été rincé toutes les 15 minutes. Après cette période de stabilisation, le duodénum a été sensibilisé avec de l’acétylcholine, à la concentration de 10⁻⁵ M dans le bain. La préparation a ensuite été rincée puis laissée de nouveau se stabiliser pendant 30 minutes en changeant trois fois le bain, et en réajustant la tension (BORGES E.L. et coll., 2003). Après la deuxième période de stabilisation, l’acétylcholine a été injectée dans le bain, de manière cumulative, afin de réaliser des concentrations finales croissantes à partir de 10⁻⁹ M jusqu’à l’obtention de la contraction maximale. Après l’obtention de cette contraction maximale, l’extrait MOHA-04 a été injecté dans le bain, de manière cumulative afin d’apprécier le relâchement de l’organe. L’amplitude des contractions a été mesurée, puis rapportée sur un papier semi logarithmique, et la CE50 de l’extrait a été déterminée graphiquement.
Effet de l’extrait MOHA-04 vis-à-vis de l’acétylcholine
Afin d’étudier le mécanisme mis en jeu lors du relâchement de l’organe provoqué par l’extrait, le duodénum isolé de cochon d’Inde a été pré-incubé dans un bain contenant l’extrait à différentes concentrations avant de le contracter avec de l’acétylcholine (HAMMAD H.M. et ABDALLAH S.S., 1997).
Après la période de stabilisation et de sensibilisation, l’extrait a été injecté dans le bain contenant l’organe pour réaliser une concentration finale de 0,125 mg/ml. L’organe a été laissé en contact avec l’extrait pendant 10 minutes. Après ce temps d’incubation, l’acétylcholine a été injectée de manière cumulative dans le bain, afin de réaliser une concentration à partir de 10-9 M jusqu’à la contraction maximale. Ensuite la préparation a été rincée, puis laissée se stabiliser pendant 45 minutes en la rinçant toutes les 15 minutes, et la même manipulation a été refaite mais en pré-incubant l’organe dans le bain contenant 0,25 mg/ml de l’extrait. L’amplitude des contractions provoquées par l’acétylcholine, en absence et en présence de l’extrait a été mesurée, puis exprimée en fonction de la contraction maximale provoquée par l’acétylcholine seule, considérée comme 100 %. Ensuite, rapportée sur un papier semilogarythmique en fonction de la concentration de l’acétylcholine et celle de l’extrait. La valeur de CE50 de l’acétylcholine a été déterminée graphiquement.
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Table des matières
I. INTRODUCTION
II. MATÉRIELS ET MÉTHODES
A. PARTIE CHIMIE
1. Préparation de l’extrait
2. Criblage phytochimique
B. PARTIE PHARMACOLOGIE
1. Animaux d’expérimentation
2. Etude de l’effet de MOHA-04 sur la sécrétion intestinale
3. Etude de l’effet de MOHA-04 sur la motilité intestinale
4. Effet de l’extrait MOHA-04 vis-à-vis de l’acétylcholine
C. EXPRESSION ET ANALYSES DES RÉSULTATS
III. RÉSULTATS
A. PARTIE CHIMIE
B. PARTIE PHARMACOLOGIE
1. Effet de l’extrait MOHA-04 sur la sécrétion intestinale
2. Effet de MOHA-04 sur la motilité intestinale
3. Effet de MOHA-04 vis-à-vis de l’acétylcholine
IV. DISCUSSION
V. CONCLUSION
RÉFÉRENCES
