Soutenance mémoire
La diarrhée sévit dans toutes les régions du monde. Elle est à l’origine de 4% de décès. Selon l’UNICEF : 1,5 millions d’enfants meurent chaque année à cause de la diarrhée (OMS, 2004). Cette maladie est la deuxième cause de mortalité des enfants de moins de cinq ans dans le monde, et en 2012, la diarrhée a été la cause de 760 000 décès d’enfants dans le monde (WHO, 2013). Au Bénin, 7000 personnes dont 4300 enfants tous les ans meurent de la diarrhée (UNICEF, 2014).
A Madagascar, après les infections respiratoires aiguës (IRA) et le paludisme, la diarrhée tient la troisième place du classement sur les maladies les plus mortelles (INSTAT, 2012 – 2013). La diarrhée est la cause de 14% de la mortalité des enfants de moins de cinq ans dans la Grande Île (RAZAFIMAHATOMBO C., 2012). L’état de malnutrition ou d’immunodépression aggravent la diarrhée et augmente le risque de mortalité (WHO, 2013). La diarrhée est définie comme étant une émission de selles molles ou liquides au moins trois fois par jour, mais elle peut durer plusieurs jours, voire des semaines (LETURNEAU R. et HOULE C., 2011 ; FLUCKIGERB U. et coll., 2003 ; WHO, 2013). Elle est due à la perturbation du bilan hydroélectrolytique au niveau de l’intestin, la sécrétion prime sur l’absorption, ce qui entraîne une accumulation d’eau dans la lumière intestinale à l’origine des selles liquides. La paroi intestinale est le siège de mouvements d’eau et d’électrolytes bidirectionnels en permanence. Ces mouvements se font à travers la membrane cellulaire lipidique ou par les aquaporines. La perturbation du bilan hydroélectrolytique constitue le mécanisme physiopathologique déterminant de la diarrhée (FLÜCKIGERB U. et coll., 2003). La diarrhée peut être en rapport avec des dysfonctionnements du système parasympathique comme observé en cas de stress (FIORAMONTI J., 2014), ou être une réponse déclenchée par une irritation chimique ou physique de la paroi intestinale (DENIS R., 2016 ; BRITTO J. et coll., 1989).
PARTIE CHIMIQUE
Préparation de l’extrait NMBH16
Les feuilles de la plante choisie pour cette étude ont été récoltées dans la région d’Alaotra Mangoro le mois de décembre 2015. Les feuilles séchées à l’ombre dans une salle aérée à la température ambiante pendant un mois ont été réduites en poudre à l’aide d’un broyeur à marteau électrique au Laboratoire de Pharmacologie Générale, de Pharmacocinétique et de Cosmétologie (LPGPC). Après le broyage, 250 grammes de poudre ont été macérés dans un mélange éthanol-eau (60 : 40) pendant 72 heures à la température ambiante. La préparation a été agitée deux fois par jour. Le macérât a ensuite été filtré sur du coton hydrophile, et le filtrat a été évaporé à l’aide d’un évaporateur à la température de 85 °C. L’extrait sec obtenu a été codé NMBH16, puis pesé.
Criblage phytochimique de l’extrait NMBH16
Un criblage phytochimique a été effectué pour la détermination des principales familles chimiques présentes dans l’extrait NMBH16. Ce test est basé sur des réactions de coloration et de précipitation en utilisant des réactifs spécifiques qui réagissent avec les familles chimiques correspondantes (FONG H. H. S. et coll., 1977) .
Pour exprimer la teneur des familles chimiques présentes dans l’extrait, les signes suivants ont été utilisés :
– : absence de la famille recherchée
± : présence de la famille en très faible quantité
+ : présence en faible quantité
++ : présence en quantité moyenne
+++ : présence en forte quantité .
PARTIE PHARMACOLOGIQUE
Des tests in vivo et in vitro ont été effectués pour étudier l’activité de l’extrait NMBH16. Son activité antisécrétoire a été étudiée in vivo sur la diarrhée osmotique expérimentale provoquée par l’administration de MgSO4 par voie orale. Tandis que son effet sur la diarrhée motrice a été étudié sur la contraction de l’iléon isolé de cobaye provoquée par l’Acétylcholine (LAKSHMINARAYANA M. et coll., 2011).
Animaux d’expérimentation
Des cobayes tricolores des deux sexes, âgés de 3 mois, et pesant entre 250 et 300 grammes ont été utilisés. Ces animaux ont été acclimatés à l’animalerie du LPGPC pendant 1 semaine avant les tests. Ils ont été nourris avec des feuilles fraîches de graminées et soumis à une alternance de lumière et d’obscurité de 12h/12h, et à la température de 20°C environ. Ces animaux ont été mis à jeun pendant 18 heures avant les expériences.
Etude de l’activité antisécrétoire de NMBH16
L’activité antisécrétoire de NMBH16 a été étudiée chez le cobaye in vivo sur sa capacité à empêcher ou à limiter la sécrétion de fluide dans la lumière intestinale provoquée par l’administration par voie orale d’une solution de MgSO4 préparée dans de l’eau distillée. Les cobayes mis à jeun pendant 18h ont été utilisés. Ils ont été répartis en 4 lots : 1 lot témoin et 3 lots traités avec l’extrait NMBH16 à différentes doses. Au temps t0, les animaux du lot témoin ont reçu 10 ml/kg d’eau distillée par voie orale (AMPA R. et coll., 2014). Les 3 autres lots ont respectivement reçu l’extrait NMBH16 aux doses de 75, 150 et de 300 mg/kg dans un volume de 10 ml/kg (BENQUET P., 2014).
Quarante cinq minutes après l’administration de l’eau et de l’extrait, une solution de MgSO4 a été administrée par gavage à tous les animaux à la dose de 2 g/kg dans un volume de 50 ml/kg (LAKSHMINARAYANA M. et coll., 2011).
Trente minutes après, les animaux ont été euthanasiés et exsanguinés, puis une laparotomie a été effectuée. L’intestin grêle de chaque animal a été ligaturé au niveau du pylore et au niveau de la jonction iléo-caecale, puis prélevé dans sa totalité. Le contenu intestinal a été récupéré et son volume a été mesuré (MAHESH G. S. et coll., 2010 ; DINESH et coll., 2011 ; LAKSHMINARAYANA M. et coll., 2011).
Etude de l’activité de l’extrait NMBH16 sur la motilité intestinale
L’ effet de l’extrait sur la motilité intestinale a été étudié sur sa capacité à relâcher la contraction de l’iléon isolé de cobaye provoquée par l’Acétylcholine (SOME N. et coll., 1998).
Le cobaye préalablement mis à jeun pendant 18 heures a été euthanasié puis exsanguiné. Une laparotomie a été effectuée et une portion d’iléon a été prélevée et plongée dans une boîte de Pétri contenant une solution de Tyrode barbotée avec de l’air. Les mésentères ont été enlevés, puis l’organe isolé a été découpé en morceaux de 1,5 centimètres de longueur. Une portion de l’iléon a été montée dans une cuve à organe isolé. Une de ses extrémités a été fixée au fond de la cuve avec un fil de coton, et l’autre extrémité a été reliée à un stylet enregistreur avec un contrepoids de 1 g.
L’organe a été laissé se stabiliser pendant 45 minutes dans la cuve contenant de la solution de Tyrode aérée et maintenue à la température de 37°C. Pendant cette période de stabilisation, la préparation a été rincée toutes les 15 minutes avec de la solution de Tyrode.
Après cette phase de stabilisation, l’Acétylcholine a été injectée dans le bain afin de réaliser la concentration de 10⁻⁷ M pour sensibiliser l’organe (LAHADSON S. F., 2011-2012). Après la contraction provoquée par l’Acétylcholine, la préparation a été de nouveau rincée, puis laissée se stabiliser pendant 30 minutes. Pendant cette période, le bain a été renouvelé 2 fois.
A la fin de cette période, l’Acétylcholine a été injectée dans le bain d’une manière cumulative afin de réaliser des concentrations finales croissantes à partir de 10⁻¹¹ M jusqu’à l’obtention de la contraction maximale. Au plateau de contraction, l’extrait NMBH16 a été injecté dans le bain d’une manière cumulative à partir de la concentration de 2 µg/ml dans la solution de Tyrode, dans un volume de 20 µl, jusqu’au relâchement total de l’organe (NEVEU F. et CHATEIGNER A., 2007).
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Table des matières
I. INTRODUCTION
II. MATERIELS ET METHODES
A. PARTIE CHIMIQUE
1. Préparation de l’extrait NMBH16
2. Criblage phytochimique de l’extrait NMBH16
B. PARTIE PHARMACOLOGIQUE
1. Animaux d’expérimentation
2. Préparation de la solution de Tyrode
3. Etude de l’activité antisécrétoire
4. Etude de l’activité de l’extrait NMBH16 sur la motilité intestinale
5. Etude du mécanisme d’action de l’extrait NMBH16
C. EXPRESSION ET ANALYSES DES RESULTATS
III. RESULTATS
A. PARTIE CHIMIQUE
1. Rendement de l’extrait
2. Résultats du criblage phytochimique
B. PARTIE PHARMACOLOGIQUE
1.Activité antisécretoire
2. Activité de l’extrait sur la motilité intestinale
3. Mécanisme d’action de l’extrait NMBH16
IV. DISCUSSION
V. CONCLUSION
BIBLIOGRAPHIE
WEBOGRAPHIE
