Etude de l’activite antidiarrheique de l’extrait HAN008 chez le cobaye

Selon l’OMS, la diarrhée figure parmi les 10 premières causes de mortalité dans le monde avec 1,5 millions de décès en 2012, soit 8 % du taux de mortalité (OMS, 2014). Ce sont les enfants de moins de 5 ans qui sont les plus touchés surtout dans les pays sous-développés, comme en Afrique, due à la contamination de l’eau et au manque d’hygiène et à l’insalubrité. Dans les régions africaines et dans le Sud Est Asiatique, 78 % de cause de la mortalité infantile est due à la diarrhée (PRUSS USTUN A. et coll., 2006). A Madagascar, 22 % de la mortalité infantile sont dus à la diarrhée, et les enquêtes démographiques et de santé réalisées à Madagascar en 2010 ont permis d’estimer la prévalence de la diarrhée chez l’enfant dans chaque région. Dans la région Boeny, par exemple les cas de diarrhée enregistrés chez les enfants de moins de 5 ans ont été les plus élevés par rapport aux autres régions de Madagascar avec une prévalence de 18 % (EDSM IV, 2010). La manifestation de cette maladie est connue par l’émission de selles liquides et fréquentes. Elle est due à un déséquilibre entre la sécrétion intestinale et l’absorption de fluide dans la lumière intestinale, où la sécrétion hydroélectrolytique dépasse la capacité d’absorption. L’intestin grêle est le principal organe de digestion et d’absorption, à l’état normal, environ 10 litres de fluide y passent. Quatre-vingt-dix pourcent de ce fluide sont absorbés par l’intestin grêle et seule une faible quantité par le colon pour assurer un débit fécal de 100 ml par jour (BEHTASH G. et SHANTHI S., 2010 ; MOURI G. et GOUTAM P., 2013). Selon la durée du symptôme, la diarrhée est classée en deux : la diarrhée aiguë et la diarrhée chronique. La diarrhée aigüe dure 2 à 3 jours, alors que la diarrhée chronique dure plusieurs semaines. En général, la diarrhée aigüe est due à la malabsorption ou à une infection avec ou sans lésion de la muqueuse intestinale. Les microorganismes présents dans la lumière intestinale affectent le système de défense de l’épithélium intestinal. D’une part, ils provoquent des lésions au niveau de la muqueuse, ce qui entraine la perte de la capacité d’absorption de la cellule intestinale et la fuite excessive d’eau. D’autre part, ils produisent des toxines qui stimulent la sécrétion de fluide dans l’intestin, et inhibent l’absorption hydroélectrolytique (PIZZARO-CERDA J. et COSSART P., 2006 ; VISWANATHAN V. et coll., 2009). La diarrhée aiguë peut également être due à la faiblesse du système de défense suite à la malnutrition qui facilite l’infection de la muqueuse par les agents infectieux (FERRER S. et coll., 2008).

Quant à la diarrhée chronique, elle peut être motrice, sécrétoire ou osmotique. La diarrhée motrice est due à l’augmentation de la motilité intestinale qui entraîne l’évacuation rapide du contenu intestinal. En effet, l’augmentation du péristaltisme intestinal diminue le temps de contact du bol alimentaire avec la villosité intestinale qui est le site d’absorption d’eau et des électrolytes. Dans ce cas, la plupart de fluide intestinal n’est pas absorbée et la sécrétion de fluide intestinal excède l’absorption d’où l’émission de selles liquides en cas de diarrhée motrice (SHARKEY K. et WALLACE J., 2012). La diarrhée sécrétoire est due à l’augmentation anormale de la sécrétion au niveau de l’intestin suite à l’irritation de la paroi intestinale par des agents infectieux ou de toxines qu’ils produisent, ou par de produits irritants, ou de médicaments, parce que l’inflammation qui se produit provoque une exsudation au niveau des entérocytes. L’infection peut être causée par des microorganismes (bactéries, virus, parasites ou champignons). Le plus souvent ce sont les bactéries comme Escherichia coli, Salmonella, Shigella sp., Campylo bacter, Vibrio cholerae, Yersinia pseudotuberculosis et Yersinia entérocolitica , les virus comme rotavirus, les parvovirus et les réovirus, entérovirus et astrovirus, les champignons comme Candida albicans ou les parasites comme les protozoaires tels que le Giardia lamblia qui en sont les responsables (YIMER M. et coll., 2015). En outre, en cas d’irritation de la paroi intestinale, l’absorption hydroélectrolytique diminue et l’eau s’accumule dans la lumière intestinale (VELAZQUEZ et coll., 2006). Une atteinte de la paroi intestinale ou lors des troubles fonctionnels, entraîne aussi un déséquilibre entre l’absorption et la sécrétion (BROWN J. et TAYLOR P., 2000). Par ailleurs, la présence de substances osmotiquement actives et non absorbables dans la lumière intestinale y attire l’eau par osmose et augmente aussi le volume du fluide intestinal, à l’origine de la diarrhée osmotique, comme c’est le cas de Maltitol, le sulfate de magnésium, ou les nutriments mal absorbés lors d’une indigestion (NAKAMURA S. et coll., 2007). Ceci est dû à l’augmentation de l’osmolarité au niveau de la lumière intestinale (GEOFFREY L., 2001).

PARTIE CHIMIE

Préparation de l’extrait

Les feuilles de cette plante ont été récoltées dans la région de Boeny, au mois de février 2016. Elles ont été séchées à l’ombre, dans une salle aérée et à la température ambiante pendant 3 mois. Les feuilles séchées ont été broyées à l’aide d’un broyeur à marteau électrique au LPGPC, puis 250 g de la poudre obtenue ont été macérés dans un mélange éthanol-eau (60 :40) pendant 72 heures à la température ambiante. Le macérât a ensuite été filtré avec du coton hydrophile, et le filtrat a été évaporé à sec à l’aide d’un évaporateur à la température de 75°C.

Criblage phytochimique

Un criblage phytochimique a été effectué pour déterminer la teneur relative des familles chimiques présentes dans l’extrait HAN008. Le test effectué a été basé sur des réactions de coloration et de précipitation, en utilisant des réactifs spécifiques pour chaque famille chimique (FONG H.H.S. et coll., 1977). Pour exprimer la teneur des familles chimiques présentes dans l’extrait, les signes suivants ont été utilisés :
± : Présence en très faible teneur
+ : Présence à faible teneur
++ : Présence en teneur moyenne
+++ : Présence en forte teneur .

Etude de l’effet de HAN008 sur la sécrétion intestinale

Pour étudier l’activité de l’extrait sur la sécrétion hydroélectrolytique au niveau de l’intestin, l’huile de ricin a été administrée par voie orale pour provoquer l’accumulation du fluide dans la lumière intestinale ou enteropooling (ROBERT A. et coll., 1976). Les animaux ont été mis à jeun pendant 18h et ils ont été répartis en 4 lots: 1 lot témoin et 3 lots traités avec l’extrait. Au temps t0, 10ml d’eau distillée ont été administrés chez les animaux du lot témoin et l’extrait aux doses respectives de 75, 150 et 300 mg/kg a été administré par voie orale chez les cobayes des 3 lots. L’extrait a été administré par voie orale dans un volume de 10ml /kg (PRASHANT B. et coll., 2012). Quarante-cinq minutes après l’administration de l’eau distillée et de l’extrait, 1ml d’huile de ricin a été administré par voie orale chez tous les animaux (YASMEEN M. et coll., 2010). Trente minutes après l’administration de l’huile de ricin, les animaux ont été sacrifiés puis exsanguinés. Une laparotomie a ensuite été effectuée puis, l’intestin grêle a été repéré. Deux ligatures ont été placées au niveau de l’intestin: l’une au niveau du pylore et l’autre au niveau de la jonction iléocoecale.

Ensuite, la portion entre les 2 nœuds a été prélevée et son contenu a été versé dans un récipient gradué puis son volume a été mesuré (MAMILAINORO L., 1996). L’activité anti-sécrétoire de l’extrait a été exprimée en pourcentage d’inhibition de l’accumulation du fluide intestinal selon la formule :

Inhibition (%) = (V0 – Vt / V0) x 100

Avec :
VO : volume du liquide intestinal du lot témoin (ml)
Vt : volume du liquide intestinal du lot traité avec l’extrait (ml)
(MAMILAINORO L., 1996; OBEN J. et coll., 2006).

Etude de l’effet de HAN008 sur la motilité intestinale

L’effet de l’extrait HAN 008 sur la motilité intestinale a été étudié in vitro sur l’iléon isolé de cobaye contracté avec l’acétylcholine (SHIFFERIE F. et coll., 2013). L’animal a été mis à jeun pendant 18 h avant l’expérience, puis sacrifié et exsanguiné en coupant les 2 carotides. Ensuite, une laparotomie a été effectuée et l’iléon a été prélevé et plongé dans une boite a pétri contenant de la solution de Tyrode aérée à l’aide d’un aérateur pour le maintenir en vie. L’iléon a été nettoyé en enlevant les mésentères qui l’entourent. Après le nettoyage, un morceau de 3cm d’iléon isolé a été monté dans une cuve à organe isolé contenant 20 ml de solution de Tyrode, maintenue à la température de 37°C et aérée avec un aérateur. Pour monter l’organe dans la cuve, une des deux extrémités a été fixée au fond de la cuve à l’aide d’un fil de coton inextensible et l’autre a été fixée au stylet enregistreur avec un contre poids de 1g (MOHAMMED A. et coll., 2009). L’organe a ensuite été laissé se stabiliser pendant 45 minutes; pendant ce temps il a été rincé toutes les 15 minutes. Après ce délai, l’acétylcholine a été injectée dans le bain pour réaliser une concentration de 10⁻⁴ M dans le bain, pour tester la viabilité de l’organe et pour le sensibiliser. Puis, l’organe a été rincé et laissé se stabiliser pendant 30 minutes durant lesquels il a été rincé 3 fois. Après cette période, l’acétylcholine a été injectée dans le bain d’une manière cumulative afin d’obtenir des concentrations croissantes à partir de 10⁻¹¹ M jusqu’ à l’obtention de la contraction maximale.

Au plateau de la contraction, l’extrait a été injecté dans le bain d’une manière cumulative jusqu’ au relâchement total de l’organe. L’amplitude des contractions a été mesurée et portée sur un papier millimétré pour déterminer la concentration de l’extrait qui provoque 50% de relâchement de l’iléon contracté par l’acétylcholine (CE50).

Etude de l’activité spasmolytique de HAN008

L’activité de l’extrait sur la contraction de l’iléon par l’acétylcholine a été étudiée en pré incubant l’iléon dans un bain contenant différentes concentrations de l’extrait avant de le contracter avec l’acétylcholine (MEHEMOOD H. et coll., 2011). L’iléon isolé de cobaye a été monté dans une cuve à organe isolé contenant une solution de Tyrode maintenue à la température de 37°C et aérée à l’aide d’un aérateur. Il a été laissé se stabiliser pendant 45 minutes. Pendant ce temps de stabilisation, il a été rincé 3 fois. Après cela, il a été sensibilisé et sa viabilité a été testée en injectant dans le bain de l’acétylcholine à la concentration finale de 10⁻⁴ M dans le bain. Après ce test il a été rincé et laissé de nouveau se stabiliser pendant 30 minutes, durant lesquelles, il a été rincé deux fois. Après le dernier rinçage, l’acétylcholine a été injectée dans le bain d’une manière cumulative jusqu’à la contraction maximale de l’iléon. Puis, la préparation a été rincée et laissée se stabiliser pendant 30 minutes. Pendant cette période, la solution de Tyrode a été renouvelée 2 fois. Après la période de stabilisation, l’extrait a été injecté dans le bain afin de réaliser une concentration finale de 0,125 mg/ml dans le bain. L’iléon a été laissé en contact avec l’extrait pendant 10 minutes, puis sans rincer, l’acétylcholine a été injectée dans le bain d’une façon cumulative jusqu’à l’obtention de la contraction maximale de l’organe. Au plateau de contraction, la préparation a été rincée et laissée se stabiliser, et la même manipulation a été refaite en pré incubant l’iléon dans un bain contenant l’extrait à la concentration de 0,25 et 0,50 mg/ml. L’amplitude des contractions a été mesurée puis rapportée sur un papier semi logarithmique pour déterminer la CE50 de l’acétylcholine.

Table des matières

I-INTRODUCTION
II-MATERIELS ET METHODES
A. PARTIE CHIMIQUE
1. Préparation de l’extrait
2. Criblage phytochimique
B. PARTIE PHARMACOLOGIQUE
1. Animaux d’expérimentation
2. Préparation de la solution de Tyrode
3. Etude de l’effet de l’extrait HAN008 sur la sécrétion intestinale
4. Etude de l’effet de l’extrait HAN008 sur la motilité intestinale
5. Etude de l’effet de l’extrait HAN008 vis-à-vis de l’acétylcholine
C. EXPRESSION ET ANALYSES DES RESULTATS
III-RESULTATS
A. PARTIE CHIMIQUE
1. Rendement de l’extraction
2. Résultats du criblage phytochimique
B. PARTIE PHARMACOLOGIQUE
1. Effet de l’extrait HAN008 sur la sécrétion intestinale
2. Effet de l’extrait HAN008 sur la motilité intestinale
3. Effet de l’extrait HAN008 vis-à-vis de l’acétylcholine
IV-DISCUSSION
V-CONCLUSION
VI-BIBLIOGRAPHIE

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