Etude de l’activite anti inflammatoire de la plante codee zph (RHAMNACEES)

De l’antiquité à nos jours, l’homme s’est toujours donné les moyens de combattre l’inflammation. Ces moyens lui sont souvent fournis par son environnement naturel et sont essentiellement à base de plantes. Dès le début du XVIIème siècle, le problème de l’inflammation intéressait les scientifiques (POLLICARD A., 1965). De nombreux travaux ont été consacrés à l’étio-pathologie de la réaction inflammatoire (PERRIN L. et LAURENT P., 1987). L’inflammation est un mécanisme de défense utilisé par l’organisme en réponse à différentes agressions qui peuvent être physiques (traumatisme, froid,…), trophiques (défaut de vascularisation des tissus ayant pour conséquence l’ischémie puis la nécrose des tissus aboutissant à l’inflammation), des stimuli chimiques (acides), biologiques (bactéries, virus) ou immunitaires (infections, allergies). Ce mécanisme de défense a pour but d’éliminer l’agent pathogène et de maintenir l’intégrité des tissus agressés (RUSSO-MARIE F. et coll., 1998). La réaction mise en œuvre par l’organisme pour parer aux effets des agressions est généralement adaptée pour restaurer de manière la plus efficace et la plus complète les troubles consécutifs à l’agression. Elle se déroule dans les tissus conjonctifs vascularisés aboutissant à la migration des leucocytes vers le site inflammatoire (FERGUSSON L.R., 2010). C’est un processus habituellement bénéfique. Mais, elle peut être néfaste du fait de l’agressivité de l’agent pathogène, de sa persistance, du siège de l’inflammation, par anomalie de régulation du processus inflammatoire, ou par anomalie quantitative ou qualitative des cellules intervenant dans l’inflammation (RUSLAN M., 2008). La réponse inflammatoire est caractérisée par ses signes cardinaux classiques à savoir une rougeur, une tuméfaction accompagnée de chaleur et de douleur.

ETUDE PHYTOCHIMIQUE 

Matériel végétal 

La plante codée ZPH est un arbuste épineux répandu dans les régions méditerranéennes et tropicales. Pour la présente étude, ZPH a été récoltée dans la côte ouest de Madagascar. C’est la partie aérienne de la plante constituée par les petites tiges feuillées qui a fait l’objet de cette étude.

Préparation de l’extrait brut 

Les petites tiges feuillées ont été séchées à l’abri de la lumière solaire et de l’humidité dans une salle aérée. Elles ont été ensuite broyées en poudre fine ou broyat à l’aide d’un broyeur de laboratoire. Trois cent trente grammes du broyat ont été macérés dans1Ld’éthanol à 90° pendant une période de 24 h dans un erlenmeyer recouvert d’un papier aluminium pour éviter l’évaporation du solvant. Cette opération a été répétée deux fois pour avoir un maximum de rendement d’extraction. L’éthanol a été choisi comme solvant pour sa grande polarité permettant l’extraction de toutes les molécules présentes dans la plante. Les deux macérâts ainsi obtenus ont été réunis puis filtrés sur un papier Joseph à l’aide d’un Buchner et une pompe à membrane pour obtenir un filtrat débarrassé de débris du broyat. Il a été ensuite passé sur une couche de charbon actif pour déchlorophyller le broyat. Le filtrat ainsi obtenu a été concentré par évaporation sous pression réduite du solvant à l’aide d’un évaporateur rotatif (BüchiR114) et d’une pompe. L’évaporation a été réalisée à 40°C.

Criblage phytochimique 

Un criblage phytochimique a été effectué dans le but de déterminer les grandes familles chimiques présentes dans l’extrait brut. Il s’agit d’une analyse qualitative et semiquantitative basée sur des réactions de coloration et/ou de précipitation entre le réactif spécifique utilisé et la famille chimique détectée .

Pour l’estimation de la proportion relative des différentes familles chimiques, les signes suivants ont été utilisés :
– : absence
+ : présence en faible concentration
++ : Présence en moyenne concentration
+++ : Présence en forte concentration .

ETUDE PHARMACOLOGIQUE

Animaux d’expérimentation

Les expériences ont été réalisées sur :
– des souris de race OF1, mâles ou femelles, âgées de 12 à 15 semaines, pesant en moyenne 25±5 g pour les tests anti-inflammatoire, analgésique et toxicologique.
– des rats de race Wistar, femelles, âgées de 15 à 20 semaines, pesant 150 à 200 g pour le test antipyrétique.

Ces animaux ont été élevés dans l’animalerie de l’IMRA. Ils ont été nourris avec de la provende LFL et ont eu accès libre à l’eau. Ils ont été mis à jeun pendant 12 havant chaque expérience.

Produits utilisés 

La carragénine, l’acide acétylsalicylique (AAS) utilisés lors des tests antiinflammatoires sont de marque SIGMA. La poudre de paracétamol pur est de marque MERCK. L’acide acétique est un produit de PROLABO. La levure de bière « BIERGIST® » de Arkopharma a été utilisée pour provoquer l’hyperthermie. Elle a été achetée dans une officine privée sise à Antananarivo. L’AAS et le paracétamol ont été mis en suspension dans de l’eau distillée et l’extrait brut déchlorophyllé de ZPH a été dissout dans de l’eau distillée.

Tests pharmacologiques 

Afin de vérifier les hypothèses avancées dans la première partie, des tests biologiques ont été réalisés en provoquant expérimentalement la physiopathologie étudiée.

Etude de l’activité anti-inflammatoire de EBD 

Trois lots de 5 souris ont été utilisés pour l’étude de l’effet de EBD sur l’œdème inflammatoire provoqué par injection de carragénine :
– Un lot témoin a reçu le véhicule utilisé pour l’administration du produit c’est-à-dire l’eau distillée,
– Les souris du second lot ont été traitées avec EBD à la dose de 200 mg/Kg
– Les souris du dernier lot ont été traitées avec le produit de référence qui est l’aspirine à la dose de 200 mg/Kg.

Les produits ainsi que le véhicule ont été administrés par gavage à l’aide d’une seringue à gavage pour souris (G25) dans un volume de 10 ml/kg de poids corporel. Une heure après l’administration du produit testé, l’inflammation a été provoquée par injection de 0,1 ml de carragénine 1% préparée fraichement dans la solution physiologique (NaCl 0,9%) au niveau de la voûte plantaire de la patte postérieure droite (WINTER C.A., 1962 ; SINGH S. et coll., 1989 ; FLEURENTIN J. et coll., 1997). Le volume de la patte droite enflammée et celui de la patte gauche non enflammée de chaque souris ont été mesurés avec un pléthysmomètre de marque UGOBASILE 7140 . Les mesures ont été faites 1 h avant l’injection de carragénine puis à 30, 60, 120 et 180 mn après son injection.

L’activité anti-inflammatoire du produit testé et son évolution ont été estimées par la détermination des pourcentages moyens d’inhibition de l’œdème, calculés suivant la formule ci-après (GARDENER D.L., 1960).Une diminution du volume de l’œdème a été considérée comme un effet anti-inflammatoire de l’extrait.

Etude de l’effet de EBD sur deux modèles de douleur expérimentale chez la souris 

Douleur provoquée par injection d’acide acétique 

La méthode décrite par Koster (KOSTER R., 1959) a été utilisée pour provoquer la douleur aiguë. Trois lots de 5 souris ont été utilisés pour étudier l’effet de EBD sur ce modèle de douleur :
– les souris du lot témoin n’ont reçu que du véhicule qui est l’eau distillée,
– les souris du 2e lot ont été traitées avec 200 mg/Kg de EBD de ZPH,
– les souris du 3e lot ont été traitées avec 200 mg/Kg d’aspirine.

Les administrations ont été effectuées par gavage dans un volume de 10 ml/Kg de poids corporel. Trente minutes après administration du produit, une solution d’acide acétique à 1% a été injectée par voie intra-péritonéale chez les souris. Le comptage du nombre de contractions ou crampes abdominales a commencé juste après l’injection d’acide acétique et a été effectué pendant 30 mn.

Douleur provoquée par la chaleur 

La méthode de la plaque chauffante décrite initialement par WOOLFE G. et Mac DONALD A.D. (1994) a été utilisée pour étudier l’effet analgésique de EBD chez la souris. Elle consiste à appliquer un stimulus thermique en la déposant sur une plaque métallique chauffée (hot plate) à la température égale à 55°C. Le temps nécessaire à l’animal pour réagir au stimulus thermique constitue le seuil de tolérance. Pour notre étude, 3 lots de 5 souris ont été utilisés :

– un lot témoin qui a reçu de l’eau distillée,
– un lot traité avec EBD à la dose de 200 mg/Kg,
– les souris du dernier lot ont été traitées avec 100 mg/Kg de paracétamol.

Les chronométrages des temps seuils ont commencé 1havant le traitement, puis 30, 60, 90 et 120 mn après l’administration orale du produit testé. Une augmentation significative de ces temps de réaction chez les animaux traités par rapport à celui des animaux témoins indique un effet analgésique du produit.

Etude de l’effet de EBD sur l’hyperthermie provoquée chez le rat 

L’hyperthermie expérimentale a été provoquée chez le rat par injection de levure de bière (LOUX J.J. et coll., 1972 ; HAJARE S.W. et coll., 2000). Plusieurs rats ont été présélectionnés. Ils ont reçu par injection sous cutanée au niveau de la zone dorsolombaire une solution de levure de bière de 20% préparée dans du sérum physiologique NaCl 0,9%, dans un volume de 1 ml/100 g de poids corporel. Seuls les animaux présentant une élévation de température de 1°C 17 h après l’injection de levure de bière ont été utilisés pour la suite du test. Ils ont été répartis en 3 lots contenant chacun 4 rats.
– Les rats du lot témoin ont été traités uniquement avec de l’eau distillée.
– Les animaux du 2e lot ont été traités avec 200 mg/Kg de EBD.
– Les animaux du 3e lot ont été traités avec du paracétamol à la dose de 100 mg/kg qui est le produit de référence utilisé.

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Table des matières

Partie I : INTRODUCTION
Partie II : MATERIELS ET METHODES
A. ETUDE PHYTOCHIMIQUE
1. Matériel végétal
2. Préparation de l’extrait brut
3. Criblage phytochimique
B. ETUDE PHARMACOLOGIQUE
1. Animaux d’expérimentation
2. Produits utilisés
3. Tests pharmacologiques
3.1- Etude de l’activité anti-inflammatoire de EBD
3.2- Etude de l’effet de EBD sur deux modèles de douleur expérimentale chez la souris
3.2-1. Douleur provoquée par injection d’acide acétique
3.2-2. Douleur provoquée par la chaleur
3.3- Etude de l’effet de EBD sur l’hyperthermie provoquée chez le rat
4. Etude de la toxicité aiguë
5. Analyse statistique des résultats
Partie III : RESULTATS
A. RESULTATS PHYTOCHIMIQUES
1. Rendement de l’extraction
2. Résultats du criblage phytochimique
B. RESULTATS PHARMACOLOGIQUES
1. Effet de l’extrait brut de ZPH sur l’œdème inflammatoire provoqué par injection de carragénine chez la souris
2. Effet de l’extrait brut de ZPH sur la douleur provoquée par injection d’acide acétique chez la souris
3. Effet de l’extrait brut de ZPH sur la douleur provoquée par la chaleur chez la souris
4. Effet de l’extrait brut de ZPH sur l’hyperthermie induite par la levure de bière
5. Résultats du test de toxicité aiguë
Partie IV : DISCUSSION
Partie V : CONCLUSION
REFERENCES BIBLIOGRAPHIQUES

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