Soutenance mémoire
Mémoire de recherche pour l’obtention du diplome de master
Parcours : biochimie, biodiversité et santé
DISTRIBUTION GEOGRAPHIQUE DES HANTAVIRUS
Les hantavirus sont distribués dans plusieurs régions du monde : Afrique, Amérique, Asie et Europe (Figure 2, p. 3) (Krüger et al. 2015). La répartition géographique des hantavirus est en lien avec celle des hôtes qu’ils infectent. Les pathologies liées à l’infection des hantavirus sont principalement la fièvre hémorragique à syndrome rénale (FHSR), la néphropathie épidémique (NE) et l’hantavirose à syndrome cardiopulmonaire (HSCP). Auparavant, seuls les hantavirus associés aux rongeurs ont été décrits comme pathogènes pour l’homme (Tordo et al. 2013). Très récemment, en Afrique, une étude chez l’homme a mis en évidence la présence d’anticorps (Ac) dirigés contre des hantavirus (Bowé virus, Uluguru virus) associés aux insectivores ; ainsi l’infection avec Bowé virus semble associée à une pathologie au niveau du système rénal (Heinemann et al. 2016).
TRANSMISSION A L’HOMME
Contrairement aux autres genres de la famille des Bunyaviridae (Phlebovirus, Tospovirus, Orthobunyavirus, Nairovirus), les hantavirus ne sont pas transmis à l’homme par des vecteurs arthropodes. La transmission à l’homme se produit par inhalation d’un aérosol provenant d’urines et des excréments de rongeurs infectés (Watson et al. 2014).
ANDV constitue une exception puisque de rares cas de transmission interhumaine ont été rapportés (Figure 2, p. 3). Lors d’une épidémie en Argentine en 1996, 20 cas de HSCP ont été étudiés et les enquêtes épidémiologiques ont révélé que certaines infections seraient dues à des contacts rapprochés entre les malades (Wells et al. 1997, Martinez et al. 2005). D’autres cas de transmission interhumaine ont été décrits pour ANDV, et l’exposition à des fluides contaminés (salive, urine) pourrait être une cause d’infection (Watson et al. 2014).
EXTRACTION DU GÉNOME VIRAL PRINCIPE
L’extraction du génome viral (dans le cas des hantavirus, virus à ARN) à partir des sérums humains repose sur une première étape de lyse, suivie de la purification des acides nucléiques par l’intermédiaire d’un système de chromatographie sur colonne-filtre disponible sous forme de Kit commercial « NucleoSpin® Dx Virus » (Macherey-Nagel, Germany).
MODE OPÉRATOIRE
L’extraction du génome viral a été réalisée en 5 étapes :
Première étape : phase de lyse Le tampon de lyse (600 µl) RAV1 contenant du « carrier RNA » (pour améliorer la fixation des ARN sur la colonne-filtre du kit et pour augmenter le rendement en ARN) a été ajouté à raison de 150 µl de sérum par tube de 1,5 ml. La solution a été mélangée avec la pipette, puis le mélange a été brièvement agité au vortex. Ensuite, le mélange a été porté au bain-marie à une température de 70 °C pendant 5 minutes pour détruire les capsides et l’enveloppe virale. Après l’incubation, le mélange a été brièvement centrifugé (200 rpm , 3 sec : short spin,).
Deuxième étape : phase de précipitation De l’éthanol absolu (600 µl) a été ajouté dans le lysat afin de précipiter les ARN viraux, puis le tout a été agité au vortex pendant 10 à 15 secondes.
Troisième étape : phase de fixation Le lysat (700 µl) a été versé dans une colonne constituée d’un tube collecteur et d’une colonne à filtre. Après une centrifugation à 8000 xg pendant 1 min, l’ARN était fixé sur la colonne, tandis que le liquide ayant traversé la colonne a été récupéré dans le tube collecteur et jeté. Ce processus a été effectué 2 fois de suite.
Quatrième étape : phase de lavage Cette phase a consisté à éliminer les contaminants (organites et débris cellulaires). La colonne a été lavée trois fois de suite avec 2 tampons de lavage différents (RAW et RAV3).
Le premier lavage a été effectué avec 500 µl du tampon de lavage RAW, puis l’ensemble a été soumis à une centrifugation à 8000 xg pendant une minute pour éliminer les contaminants et les potentiels inhibiteurs, tels que les alcools et le « carrier RNA », des réactions en aval de l’extraction, comme la PCR.
Le second et le troisième lavage ont été entrepris avec le tampon de lavage RAV3 : 600 µl à 8000 xg pendant 1 min et 200 µl à 11 000 xg pendant 3 min, respectivement. La vitesse de centrifugation plus importante pour le dernier lavage a permis d’éliminer le tampon de lavage RAV3 qui est un potentiel inhibiteur de la PCR.
Cinquième étape : phase d’élution Du H2O dépourvu de RNase (50 µl), préalablement chauffé à 70 °C, a été ajouté dans la colonne à filtre, sans toucher la paroi ni le filtre. La colonne a été ensuite incubée pendant 1 à 2 min, puis une centrifugation à 11 000 xg pendant 1 min est réalisée. L’extrait d’ARN a été collecté dans un tube de 1,5 ml. L’extrait d’ARN a été conservé à une température de -80 °C en attendant son utilisation.
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Guide du mémoire de fin d’études avec la catégorie biodiversité et santé |
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Table des matières
I- INTRODUCTION
II- GENERALITES
II-1- SYNTHESE BIBLIOGRAPHIQUE ET HISTORIQUE SUR LES HANTAVIRUS
II-2- TRANSMISSION A L’HOMME
III- MATERIELS ET METHODES
III-1- POPULATION D’ETUDE
III-2- MATERIEL UTILISE POUR LE TEST ELISA
III-3- ANALYSE SEROLOGIQUE ENZYME-LINKED IMMUNOSORBENT ASSAY (ELISA) INDIRECT PRINCIPE MODE OPÉRATOIRE
III-4- ANALYSE MOLECULAIRE
III-4-1- EXTRACTION DU GÉNOME VIRAL PRINCIPE MODE OPÉRATOIRE
III-4-2- REVERSE TRANSCRIPTASE – POLYMERASE CHAIN REACTION NICHEE PRINCIPE MODE OPÉRATOIRE
III-4-3- ELECTROPHORESE SUR GEL D’AGAROSE PRINCIPE MODE OPÉRATOIRE
IV- RÉSULTATS
IV-1- ANALYSE DESCRIPTIVE DE LA POPULATION D’ETUDE
IV-2- ANALYSE SEROLOGIQUE
IV-3- ANALYSE MOLECULAIRE
V- DISCUSSION
VI- CONCLUSION ET PERPECTIVES
VII- REFERENCES BIBLIOGRAPHIQUES
ANNEXE 1 : CARACTERISTIQUES DES AMORCES UTILISEES EN RT-PCR ET EN PCR-NICHEE (Klempa et al. 2006)
ANNEXE 2 : APPAREIL UTILISE POUR LA PCR
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