Etude de la réponse immune à la vaccination contre l’Hépatite B chez des sujets porteurs chroniques de l’antigène HBs

Télécharger le fichier pdf d’un mémoire de fin d’études

VACCINS ISSUS DU GENIE GENETIQUE :

La partie du génome qui code pour les protéines de surface du virus est sélectionnée puis transplantée dans une cellule hôte (levure ou cellule animale). Cette dernière, en se répliquant va alors produire des protéines d’enveloppes S et pré-S suivant les gènes utilisés. Cet antigène est ensuite purifié à partir de cultures cellulaires. Il existe actuellement quatre vaccins produits par génie génétiques : trois sont produits sur levure et ne contiennent que la protéine S (Merk Sharp & Dhome, USA : Recombivax® et Smith Kline Beecham, Belgique : Engerix B® ; la Korea Green Cross, Corporation : Hepavax B®), le quatrième (Pasteur vaccin, France : Genhevac B®) est produit sur cellules animales et contient les protéines S et pré- S. Ces vaccins permettent de produire des quantités illimitées d’Ag-HBs nécessaires aux besoins et de s’affranchir des difficultés d’approvisionnement des vaccins plasmatiques.

Le protocole de vaccination

Un schéma conventionnel constitué d’une primo vaccination de trois injections à un mois d’intervalle suivie d’un rappel un an après la première injection et tous les cinq ans, a été admis. Cependant, certains experts européens considèrent que l’opportunité d’un rappel de la vaccination doit être appréciée sur les titres d’anticorps mesurés après la vaccination (29, 53). Aux Etats-Unis, l’Immunization Practices Advisory Committee ne préconise aucun rappel pendant au moins les dix ans qui suivent la vaccination car le système immunitaire garde intacte la mémoire de l’immunisation contre l’hépatite B pendant au moins une décennie (20). Dans les zones de forte endémicité comme le Sénégal le rappel est inutile (PLHB).

Voie d’administration (84, 85)

La voie d’administration des différents vaccins doit être intramusculaire (IM) dans la région deltoïdienne chez l’adulte et dans la partie antérolatérale de la cuisse ou quadricipitale haute chez le nouveau-né et les jeunes enfants.
La voie IM fessière est formellement déconseillée car elle peut être à l’origine d’une réponse immunitaire plus faible.

Innocuité du vaccin (24, 35, 82)

L’utilisation des produits dérivés du sang avait soulevé une polémique sur les risques d’infection par un rétrovirus alors que les méthodes de purification utilisées pour la fabrication des vaccins plasmatiques mettaient à l’abri de toute contamination. Le Centers for Diseases Control a bien démontré l’absence de preuves expérimentales et épidémiologiques de transmission du sida par le vaccin plasmatique contre l’hépatite B (22). Certaines rumeurs ont également été véhiculées par la presse populaire et la télévision européenne et faisant état d’un lien possible entre la vaccination contre l’hépatite B et de nouveaux cas ou de poussées de sclérose en plaque (S. E. P.). Actuellement, tous les experts confirment qu’aucun élément ne justifie la mise en cause de la vaccination contre l’hépatite B dans la survenue de la S. E. P. et demande la poursuite de la vaccination (49). Les spécialistes de l’OMS affirment « qu’il n’existe pas de bases solides établissant un lien entre la vaccination contre l’hépatite B et la sclérose en plaque » (OMS, 27 mars 1997).
La vaccination contre l’hépatite B est parfaitement bien tolérée et les effets indésirables locaux et généraux qui en découlent sont bénins et rares. Elle ne présente pas de contre-indication particulière et le vaccin peut être administré à la femme enceinte, le nourrisson voir les sujets immunodéprimés (dialysés, séropositif pour VIH). De plus, l’association du vaccin contre l’hépatite B à d’autres vaccins (Tetracoq, BCG, les vaccins contre la fièvre jaune, la rougeole à condition de faire les injections en des sites différents), a été prouvée efficace et bien tolérée (25, 26).

Réponse immune

La réponse au vaccin contre l’hépatite B est fondée sur le dosage de l’anticorps anti-HBs, un à deux mois après la troisième injection vaccinale (30). Un taux d’anticorps anti-HBs égal ou supérieur à 10 m UI/mL est considéré comme protecteur suivant les normes françaises (6) et américaines (21). Cependant il faut insister sur l’injection de rappel qui est essentielle pour obtenir des taux d’anticorps très élevés, ceci n’est valable qu’en zone de faible endémicité (5). Avec les premiers vaccins plasmatiques de même qu’avec les actuels recombinants, on constate toujours une élévation considérable de 10 fois le taux d’anticorps anti-HBs après l’injection de rappel, passant de quelques centaines d’unités à plusieurs milliers d’unités.
Ces taux très élevés sont garant d’immunité durable prolongée, pour tous les vaccins (45). D’une manière générale, qu’ils soient plasmatiques ou recombinants, les vaccins disponibles actuellement induisent une immunisation chez plus de 95% des sujets immunocompétents et leur efficacité a été démontrée par de nombreuses études, à la fois chez les populations à risques et les nouveau-nés (1, 30, 43, 51, 60, 69, 79, 80, 83).

PREVENTION SECONDAIRE

A coté de la vaccination, une prise en charge thérapeutique des porteurs chroniques peut être menée à l’aide de différentes molécules.

LE TRAITEMENT MEDICAL

L’interféron alpha

Il appartient à la famille des cytokines et possède une triple activité antivirale, antiproliférative et immuno-modulatrice. C’est la molécule la plus anciennement utilisée (dès le début des années 80) dans le traitement de l’hépatite chronique B.

L’interféron pégylé

C’est est un interféron conjugué à du polyéthylène glycol (PEG), ce qui augmente sa biodisponibilité et permet de retarder son élimination rénale, augmentant ainsi sa demi-vie. Cette forme ‘retard’ d’interféron permet un traitement hebdomadaire en une injection unique sous-cutanée.
Deux interférons pégylés, Alpha-2a et Alpha-2b, sont actuellement produits.
Ils diffèrent essentiellement par la qualité et la quantité du PEG conjugué à l’interféron.

La lamivudine

C’est un analogue structural nucléosidique de type cytidine qui inhibe la transcriptase. La lamivudine a été développée initialement dans le traitement de l’infection par le VIH puis s’est révélée dans la dernière décennie avoir une activité antivirale contre le VHB à des concentrations moindres. La lamivudine présente l’avantage d’une administration par voie orale et d’un excellent profil de tolérance.

L’adéfovir dipivoxil

C’est la prodrogue de l’adéfovir. Il est le premier analogue nucléotidique à avoir été développé dans le traitement de l’hépatite chronique B. Il agit en inhibant les polymérases virales par compétition directe avec les substrats naturels (désoxyadénosine triphosphate) et, après incorporation dans l’ADN viral, provoque la terminaison de la chaîne d’ADN.

LA VACCINOTHERAPIE

Vaccin seul :

L’intérêt du concept de la vaccination thérapeutique a d’abord été démontré chez la souris transgénique exprimant l’antigène HBs. Les premières études cliniques ont montré que l’utilisation du vaccin standard diminuait la réplication du virus de l’hépatite B chez 50% des porteurs chroniques. Lors d’une étude multicentrique contrôlée et randomisée, après trois injections de vaccin, une différence significative sur la perte de l’ADN du virus de l’hépatite B a été observée par rapport au bras contrôle. Après un an et cinq injections, il n y a plus de différence sur le portage de l’ADN mais le bras « vacciné » présente des taux d’ADN plus faibles.
La réponse anti-HBS est lymphocytes T-CD4+dépendante. Les lymphocytes T HBV-spécifiques produisent un taux élevé de cytokines. L’induction d’une réponse CD4+ peut être importante pour contrôler la virémie chez les porteurs chroniques.( HEPADAK 2, 2003)

Association vaccin+lamivudine

La Lamivudine permet un contrôle rapide de la réplication d’où un arrêt de la stimulation chronique du système immunitaire. C’est dans cette période de restauration immunitaire qu’une vaccination répétée pourrait permettre au système immunitaire de produire des défenses humorales et cytotoxiques capables de contenir la reprise de réplication à l’arrêt de l’inhibiteur nucléosidique. Chez les patients Ag HBe positif, l’association Lamivudine avec un vaccin thérapeutique serait une alternative à un long traitement. Dans une étude récente réalisée au Japon, la charge virale à un an est négative chez 100% des patients du bras « Lamivudine + vaccin » versus 68% dans le bras Lamivudine en monothérapie. (89)
Par ailleurs, l’association entre atteintes neurologiques et vaccin du virus de l’hépatite B a été écartée.
L’expérience Japonaise de négativation de la réplication après l’association de la Lamivudine et la vaccination thérapeutique doit être validée dans le contexte africain.
Ainsi, l’objet de notre travail est d’étudier l’impact de la vaccination sur le portage chronique de l’Ag HBs dans une population africaine.

Méthodes d’étude

Protocoles et critères d’évaluation de la réponse vaccinale

Le protocole de vaccination :

Les patients susceptibles d’être inclus dans l’essai, ont subi le protocole de vaccination après consentement éclairé. Le protocole a consisté à administrer une dose de 20 µg du vaccin Hépavax-Gène tous les 15 jours pendant 6 mois. Ce vaccin est produit par la Korea Green Cross Corporation (KGCC). L’injection se fait par voie intramusculaire (IM) dans la région deltoïdienne.

Réponse à la vaccination :

Elle a été appréciée par :
– le dosage quantitatif des anticorps anti-HBs ;
– la durée de la protection pour laquelle un contrôle a été effectué à la fin du protocole et 12 mois après pour confirmer la présence des anticorps anti-HBs.
L’impact de la vaccination a été étudié sur :
– La séroconversion anti-HBe à la fin du protocole
– La négativation de l’Ag-HBs 12 mois après l’arrêt du protocole.

Protocoles de prélèvement et traitement des échantillons

Prélèvement

Pour chaque patient, un prélèvement de 10 mL de sang total a été effectué. Les prélèvements sont ensuite centrifugés et aliquotés. Pour chaque échantillon, le sérum recueilli après centrifugation est divisé en deux aliquots :
-Un aliquot conservé à -20°C pour la recherche des antigènes et anticorps du VHB.
-Un aliquot conservé à -80°C pour la détection de l’ADN du VHB.

Recherche des marqueurs du VHB.

Chez l’ensemble des patients nous avons recherché : l’Ag HBs, l’Ag HBe, l’Ac anti-HBs, l’Ac anti-HBe et éventuellement l’Ac anti-HBc. Ces différents marqueurs ont été recherchés à l’aide de kits commerciaux par la méthode ELISA (Génédia 3éme Génération de la KGCC).

Principe de la réaction ELISA (Enzyme Linked Immunisorbant Assay).

Cette réaction utilise une couche d’Ac (ou d’Ag) de capture qui est fixée sur un support inerte.
Le sérum du sujet est ajouté à la phase solide et s’il contient des Ag (ou Ac), la fixation de l’Ac (ou Ag) est révélée par un conjugué (immunoglobuline anti-immunoglobulines) couplé à une enzyme capable de modifier un substrat en présence d’un chromogène. Il se produit une réaction colorée détectée à l’œil nu ou au moyen d’un spectrophotomètre à une longueur d’onde comprise entre 450 et 620 nm.

Recherche de l’anticorps anti-HBs :

Matériel et réactifs :

-Plaque commerciale précoatée par une solution d’Ag-HBs
– Conjugué : Ag-HBs couplé à la peroxydase, PBS, sérumalbumine bovine
-Diluant du conjugué : PBS, sérum humain normal
-Standard 0 : sérum humain normal
-Standard 10 : Ac anti-HBs 10 m UI/mL, PB sérumalbumine bovine

Interprétation des résultats

Les échantillons dont l’absorbance est supérieure ou égale à la valeur du Cutt-off seront considérés comme Ac anti-HBe négatifs.
Les échantillons dont l’absorbance est inférieure à la valeur du Cutt-off sont considérés comme Ac anti-HBe positifs.

Recherche de l’anticorps anti-HBc

Matériel et réactifs

-Plaque précoatée par un Ag HBc
-Conjugué : Ac anti-HBc humain
-Enzyme : peroxydase
-Contrôle positif : sérum humain contenant un Ac anti-HBc
-Contrôle négatif : sérum humain normal
-Solution de lavage : PBS, polysorbate 20
-Substrat : tétraméthyl benzidine, diméthyl sulfoxyde
-Solution d’arrêt : acide sulfurique 1,6N

Technique

– Diluer le conjugué
-Mettre : 50µL de contrôle négatif dans les puits 1A, 1B et 1C 50µL de contrôle positif dans les puits 1D et 1E 50µL de sérum dans les autres puits restant
-Ajouter 100µL de conjugué dilué dans chaque puits. Mélanger puis incuber à 37°C pendant 60 mn après avoir recouvert la plaque d’un plastique adhésif
-Aspirer le contenu de chaque puits et laver 5 fois chaque puits avec 300µL de solution de lavage
-Sécher la plaque en la tapotant sur du papier absorbant. Mettre 100µL de substrat dilué dans chaque puits. Mélanger et incuber pendant 30 mn à l’obscurité
-Mettre 100µL de solution d’arrêt dans chaque puits et mélanger pour homogénéiser
-Lire l’absorbance à 450 nm

Expression des résultats

-Calcul de l’absorbance du contrôle négatif NCx NCx = (NC1 + NC2 + NC3) : 3
-Calcul de l’absorbance du contrôle positif PCx PCx = (PC1 + PC2) : 2
-Calcul de la valeur du Cutt-off Cutt-off = (NCx + PCx) : 2

Interprétation des résultats

Les échantillons dont l’absorbance est supérieure ou égale à la valeur du Cutt-off seront considérés comme anticorps anti-HBc négatifs.
Les échantillons dont l’absorbance est inférieure à la valeur du Cutt-off seront considérés comme anticorps anti-HBc positifs.

Profils attendus et interprétation des résultats

Les différents profils du portage chronique du virus de l’hépatite B :

Sur la base du dosage des transaminases, de la Gamma-glutamyl Transférase (GGT), de l’ADN du virus de l’hépatite B et de l’échographie abdominale, les profils suivants ont été obtenus :

Les porteurs inactifs :

Sont considérés comme porteurs inactifs les sujets dont :
– les transaminases et GGT sont normales ;
– l’échographie abdominale est normale ;
– l’ADN du virus de l’hépatite B est inférieure à 10 000 copies / mL.

Les mutants pré-C/C

Sont également considérés comme mutants pré-C/C les sujets dont :
-les transaminases sont élevées et/ou GGT élevées ;
-l’ADN du virus de l’hépatite B est inférieure à 10 000 copies/ mL ;
-l’Ag-HBe négatif, l’Ac anti-HBe positif et/ou présence d’une lésion hépatique active.

Les porteurs d’hépatite chronique

L’hépatite chronique B se définit par les sujets dont :
-les transaminases élevées et/ou GGT élevées ;
-l’ADN du virus de l’hépatite B est supérieure à 10 000 copies/m L ;
-on a des lésions de nécrose hépatocytaire mais également une inflammation portale.

Les immunotolérants

L’immunotolérance se définit par :
-les sujets dont les transaminases et GGT sont normales ;
-les sujets dont l’ADN du virus de l’hépatite B est supérieur à 10 000 copies/m L ; Chez ces sujets, on peut avoir la survenue d’un carcinome hépatocellulaire (CHC).

La réponse à la vaccination et les différents types de séroconversion :

Elle a été évaluée par le dosage quantitatif des anticorps anti-HBs. Les profils suivants ont été obtenus :

Les non répondeurs

Sont considérés comme non répondeurs, les sujets dont le titre en anticorps anti-HBs est négatif.

Les mauvais répondeurs

Sont considérés comme mauvais répondeurs, les sujets dont le titre en anticorps anti-HBs est compris entre 0-10 UI/ mL

Les bons répondeurs

Sont également considérés comme bons répondeurs, les sujets dont le titre en anticorps anti-HBs est supérieur à 10 UI/ mL

Table des matières

INTRODUCTION
Première partie : Données générales sur l’hépatite B
I. GENERALITES SUR L’HEPATITE B
II.LES STATUTS DES PORTEURS CHRONIQUES
II.1 Les porteurs d’une hépatite chronique
II.2 Les porteurs inactifs
II.3 Les immunotolérants
II.4 Autres porteurs chroniques
Deuxième partie : Lutte contre l’hépatite B
A. PREVENTION PRIMAIRE
I. VACCINS PLASMATIQUES
II. VACCINS ISSUS DU GENIE GENETIQUE
II.1. Le protocole de vaccination
II.2.Voie d’administration
II.3.Innocuité du vaccin
II.4.Réponse immune
B. PREVENTION SECONDAIRE
I. LE TRAITEMENT MEDICAL
I.1. L’interféron alpha
I.2. L’interféron pégylé
I.3. La Lamivudine
I.4. L’adéfovir dipivoxil
II. LA VACCINOTHERAPIE
II.1. Vaccin seul
II.2. Association vaccin+lamivudine
Troisième partie et travail personnel : Etude de la réponse immune à la vaccination contre l’Hépatite B chez des sujets porteurs chroniques de l’antigène HBs
I. OBJECTIFS
II. METHODOLOGIE
II.1 Cadre de l’étude
II.2 Population d’étude
II.2.1-Recrutement
II.2.2-Inclusion
II.2.3-Exclusion
II.3 Déroulement de l’étude
II.3.1 Bilan de pré inclusion
II.3.2 Bilan d’inclusion
II.4. Méthodes d’étude
II.4.1. Protocole et critères d’évaluation vaccinale
II.4.1.1-Protocole de vaccination
II.4.1.2-Critères d’évaluation vaccinale
II.4.2-Prèlevement et traitement des échantillons
II.4.2.1-Prèlevement
II.4.2.2-Recherche des marqueurs du virus de l’hépatite B
a- Principe de la réaction ELISA (Enzyme Linked Immunosorbant Assay)
b- Recherche de l’anticorps anti-HBs
c- Recherche de l’antigène HBe
d- Recherche de l’anticorps anti-HBe
e- Recherche de l’anticorps anti-HBc
II.5. Profils attendus et interprétation des résultats
II.5.1-Les différents profils du portage chronique du virus de l’hépatite B
II.5.1.1-Les porteurs inactifs
II.5.1.2-Les mutants pré-C/C
II.5.1.3-Les porteurs d’une hépatite chronique B
II.5.1.4-Les immunotolérants
II.5.2-La réponse à la vaccination et les différents types de séroconversion
II.5.2.1- Les non répondeurs
II.5.2.2- Les mauvais répondeurs
II.5.2.3- Les bons répondeurs
III. RESULTATS
IV.DISCUSSION
Quatrième partie : Conclusion générale et Recommandations

Télécharger le rapport complet