Soutenance mémoire
Caractères biochimiques
H.influenzae est catalase positive (lente) et cytochrome oxydase positive.
Habitat-Pouvoir pathogène
H. influenzae est commensale de l’oro-pharynx et du nasopharynx. Les souches peuvent posséder ou non une capsule. Six types capsulaires (a-f) ontété décrits (47). Dans la flore normale de ces sites anatomiques, on observe une colonisation par les souches non capsulées chez 50 à 80% des individus.
Les souches capsulées sont moins fréquentes. On ne les observe que chez 20 à 40% des sujets pour le type b et moins de 1 à 2% pour les autres types capsulaires.
Les souches capsulées de type b sont à l’origine de 95 % des pathologies invasives : méningites, septicémies, épiglottites, pneumonies, cellulites, arthrites aseptiques. Ces isolats sont souvent de biotype I.
Les pathologies invasives touchent essentiellement l’enfant, classiquement de 3 mois à 3 ans, en fait de moins de 5 ans avec un pic d’incidence des âges entre 6 mois et 2 ans, période pendant laquelle l’immunité, en particulier les anticorps anti-polysaccharides de capsule peuvent être inexistants.
Commensal des voies respiratoires supérieures: environ 50% des enfants sont porteurs de H. influenzae dans le nasopharynx; c’est un pathogène occasionnel.
Il faut distinguer:
Les souches invasives
Ce sont celles qui développent la plus grande pathogénicité grâce à la présence d’une capsule (sérotypes: b, le plus fréquent; a et c-f, moinsfréquents). Elles sont généralement responsables de:
• Méningites
• Epiglottites (enfants inférieure à 6 ans), septicémies
• Infections (souvent surinfections) des voies respiratoires basses (pneumonies, bronchites); ces infections sont aussi provoquées par des souches non encapsulées.
Les souches non invasives
Elles ne sont pas encapsulées, mais leur pathogénicité potentielle est associée à certains biotypes. Elles sont généralement responsables de sinusites, d’otites, de conjonctivites.
– Vaccination: depuis 1990 sont à disposition des vaccins constitués par des extraits poly-saccharidiques capsulaires conjugués à des protéines (protéine de la membrane externe de N. meningitidis, toxoïdes diphtérique ou tétanique). Ils sont recommandés aux nourrissons àpartir de l’âge de 2 mois.
MORAXELLA CATARRHALIS
Taxonomie
La position taxonomique la plus communément admise actuellement est celle qui a été décrite par Catlin(13) en 1991, position reprise dans le « Manual of Clinical Microbiology » de 1995(35). Ainsi la famille de Nesseriaceae a étéseparée en deux familles en 1991 par Catlin(13) qui a crée la famille des Branhamaceae tout en conservant l’ancienne famille des nesseriaceae. La famille des Branhamaceae comprend le genre Branhamella (coques) et le genre Moraxella (bacilles). Les études génomiques ont conduit à rapprocher ces genres malgré leurs différences morphologiques, et à exclure le genre Branhamella de la famille des Nesseriaceae bien qu’il s’agisse dans les deux cas de coques à Gram négatif.
Habitat
B. catarrhalis est retrouvé exclusivement chez l’homme. Cette bactérie est un germe commensal des voies respiratoires supérieures et occasionnellement des voies génitales de la femme. Plusieurs études ont permis d’établir la prévalence de la colonisation des voies respiratoires supérieures dans différentes populations(41).
Caractères bactériologiques
Caractères morphologiques
Ce sont des diplocoques Gram positif à faces adjacentes plates, parfois disposés en tétrades.
Caractères culturaux
Ils se developpent sur gélose chocolat, gélose au sang, Mueller Hinton et gélose ordinaire. Les colonies sont blanchâtres à bords nets, et glissent sur la gélose.
Caractères biochimiques
Aerobies stricts, ils possèdent une catalase et une cytochrome oxydase.
Pouvoir pathogène
Le rôle pathogène de B.catarrhalis dans différentes infections semble en augmentation. Cette augmentation pourrait être due à un meilleur diagnostic bactériologique. Néanmoins la quasi-totalité des auteurs considèrent qu’il y a un accroissement important de la prévalence de ces infections(21).
Pour expliquer ce phénomène plusieurs hypothèses ont été évoquées :
• une augmentation de la virulence de la bactérie ;
• la pression antibiotique, les β-lactamines étant principaux antibiotiques incriminés.
B.catarrhalis est un pathogène(14) reconnu responsable d’otites(8), de sinusites(8), de laryngites, d’infections broncho-pulmonaires(21), d’infections oculaires, mais aussi d’infections invasives telles que des méningites, des endocardites, des septicémies(32). Il a été reconnu comme un pathogène des voies respiratoires(41).
PHYSIOLOGIE ET CROISSANCE BACTERIENNES
PHYSIOLOGIE ET METABOLISME BACTERIENS
Selon Claude Bernard, la physiologie a pour projet d’étudier les phénomènes des êtres vivants et de déterminer les conditions matérielles de leur manifestation. Les caractères physiologiques des bactéries sont donc liés aux conditions (54)dans lesquelles nous pouvons les observer.
Pour se maintenir, croître et se reproduire, les bactéries doivent trouver dans le milieu extérieur des conditions physicochimiques favorables ainsi que les aliments qui leur sont nécessaires. (24)
Le métabolisme bactérien est l’ensemble des réactions cataboliques, consistant à dégrader les éléments nutritifs du milieu, à transférer et à stocker l’énergie résultant de ces dégradations, afin de réaliser les réactions anaboliques permettant aux bactéries de réaliser la synthèse de leurs propres constituants.
Nutrition
La nutrition consiste en l’assimilation par la bactérie des divers éléments chimiques offerts par le milieu.
Il y a un éventail de variations des conditions nutritionnelles des différentes bactéries. L’analyse chimique des bactéries indique qu’elles ont besoin des éléments suivants pour la synthèse de leurs protoplasmes : oxygène, hydrogène, azote, carbone, soufre, phosphore ainsi qu’en moindres quantités de nombreux autres éléments : ions phosphates, chlorures, sulfates, potassium, sodium, calcium, et magnésium.
Les aliments servent non seulement de matériaux de construction et de sources d’énergie nécessaires à la synthèse des constituants des bactéries en phase de croissance, mais aussi de source d’énergie nécessaire au maintien de la vie bactérienne en dehors de toute croissance.
Les aliments des bactéries peuvent être assimilés directement s’ils sont sous une forme simple (glucose, acides aminés…) ; par contre lorsqu’ils sont fournis sous forme complexe, ils doivent d’abord être dégradés par des exoenzymes avant d’être assimilés (polymères, polyoses, protéines…). Un petit nombre de molécules traversent la membrane cytoplasmique par diffusion libre : ce sont des gaz (O 2, CO 2 ), des acides gras, certains nutriments liposolubles. La majorité des substances pénètrent grâce à des perméases, systèmes membranaires augmentant la vitesse de passage à travers la membrane.
Deux principaux groupes de bactéries peuvent être distingués en fonction de leur mode d’alimentation :
– les bactéries autotrophes qui sont principalement les organismes qui n’ont aucun intérêt médical direct. Ces organismes peuvent vivre dans un environnement entièrement inorganique. Ils tirent leur carbone du CO2 et des ions carbonates. Certaines bactéries sont des autotrophes obligatoires ;
– les bactéries hétérotrophes comprennent toutes les bactéries pathogènes. Elles utilisent des composés organiques comme source de carbone et d’énergie. Les sources de carbone des hétérotrophes sont des sucres simples, des disaccharides, des alcools polyvalents, des acides organiques aliphatiques.
L’azote est assimilé par les bactéries sous forme ammoniacale. Les bactéries autotrophes, ainsi que nombre de bactéries hétérotrophes pour l’énergie et le carbone se contentent d’une source inorganique d’azote.
Beaucoup de bactéries hétérotrophes pathogènes ne peuvent pas synthétiser des substances principales telles que des vitamines, des purines et des pyrimidines. Elles peuvent seulement se développer quand ces facteurs sont formés dans le milieu, prêts à l’emploi. Ainsi quelques streptocoques exigent 17 acides aminés, 9 vitamines B, des purines : adénine et guanine, des pyrimidines : cytosine, thymine, uracile et de l’hydrate de carbone pour l’énergie.
Respiration
– l’anhydride carbonique : toutes les bactéries exigent le CO 2 pour leur développement et leur métabolisme. Et dans beaucoup de cas, ils peuvent être produits en quantités suffisantes dans la culture elle-même. Quelques unes exigent beaucoup plus de CO 2 qu’elles peuvent trouver dans leurenvironnement. Par exemple, la croissance des streptocoques est améliorée par l’addition de CO 2
– l’oxygène : les bactéries peuvent être groupées dans trois catégories selon leurs exigences en oxygène :
• les aérobies strictes ou obligatoires sont celles qui se développent en présence d’oxygène,
• les anaérobies strictes ou obligatoires se développent seulement en l’absence d’oxygène,
• les aéro-anaérobies facultatives sont des bactéries qui se développent aussi bien en conditions aérobiques qu’anaérobiques.
Dans ce groupe figurent la plupart des bactéries d’intérêt médical.
– l’azote : les bactéries d’importance médicale n’exigent pas d’azote sous sa forme gazeuse.
Métabolisme bactérien
Métabolisme général
Une fois à l’intérieur des bactéries, les substrats sont métabolisés grâce à des enzymes, selon les voies métaboliques propres à chaque espèce bactérienne.
Les bactéries sont sur le plan métabolique, beaucoup plus actives que l’homme et sont capables d’accomplir leurs processus de métabolisation beaucoup plus rapidement. Ceci est dû à leur grande superficie relative à leur petit volume ce qui facilite les échanges entre les aliments et les produits finaux. Ainsi, chez l’homme, le rapport entre la superficie et le volume est de 0,024. Pour les bactéries ce rapport est d’environ 5 000. Les bactéries utilisent les substrats d’une manière différente de celle des organismes supérieurs, pour la production de l’énergie et pour la synthèse du matériel cellulaire. Les différences entre les types de substrats qui peuvent être métabolisés sont utilisées en diagnostic bactériologique. Les types de métabolites produits par les bactéries diffèrent d’une espèce à une autre. Ce caractère est également utilisé pour l’identification des organismes.
La paroi de la cellule et la membrane cytoplasmique des bactéries sont complètement imperméables aux composés à hauts poids moléculaires tels que les protéines, les polysaccharides et les lipides. Leur assimilation nécessite d’abord leur clivage en plus petites unités au niveau extracellulaire. Pour ce faire, la bactérie secrète diverses enzymes : protéases, polysaccharidases et lipases. Ces enzymes décomposent les grandes molécules en acides aminés, en acide gras et en sucres simples qui peuvent être directement absorbés par les bactéries.
Suivi de la croissance bactérienne
Dénombrement des populations bactériennes
L’estimation régulière du nombre de bactéries rapporté au volume deculture c’est-à-dire de la densité de population bactérienne (exprimé en nombre de cellules par ml), permet de suivre le développement des populations bactériennes.
Dénombrement sur boites de pétri
Parmi les techniques directes, le dénombrement sur boites de pétri constitue sans aucun doute la méthode la plus classique. Cette technique permet la mesure de densités de population comprises entre 10 et 8 10 -9 10 cellules /ml ou cellules /g de produit. Le principe repose sur l’hypothèse qu’une cellule viable déposée sur le gel nutritif de la boite se divise jusqu’à l’obtention d’un amas de cellules issues de cette seule cellule mère : une colonie.
En conséquence, le dénombrement des colonies revient au dénombrement des cellules ou groupes de cellules déposés et viables (unités formant colonie ou UFC) à condition que la dilution de la solution ne conduise à aucun chevauchement des colonies (confluence). La méthode est très simple mais peut être coûteuse en temps et en matériel et peut conduire à l’obtention de cinétiques constituées d’un nombre limité de points expérimentaux.
Comptages au microscope
Les cellules présentes dans un échantillon liquide peuvent également être dénombrées en microscopie en utilisant du matériel adapté. Un quadrillage gravé à la surface d’une lame en verre (cellule de Neubauer) permet de compter les cellules dans un volume connu d’échantillon.
Les techniques d’épifluorescence fondées sur l’utilisation de fluorochromes permettent un comptage direct plus spécifique en microscopie.
Principe
• Après filtration sous vide d’une suspension bactérienne, toutes les bactéries sont retenues sur une membrane filtrante plane microporeuse en polycarbonate.
La taille des pores de cette membrane est très régulière et les pores se situent tous dans un même plan. Il est donc possible de dénombrer au microscope toutes les bactéries retenues, car celles-ci se trouvent toutes sur le même plan focal.
• La membrane est ensuite colorée par un fluorochrome, l’acridine orange, puis observée au microscope à épifluorescence. L’acridine orange colorée à 450nm émet une lumière dont la longueur d’ondedépend de la structure secondaire de l’acide nucléique sur lequel il est fixé.
Comptages en flux
Le comptage en flux peut être automatisé par la détection des cellules individuelles entraînées par un flux liquide.
Le compteur de Coulter (Coulter Count), système de comptage automatisé de particules au cours de l’aspiration d’un échantillon liquide, existe depuis 1956. La détection des cellules repose sur les changements brutaux de conductivité lors de leur passage dans un orifice.
La cytométrie de flux est un système similaire fondé sur l’émission ou la diffusion de photons par les cellules lors de leur passage devant un faisceau laser.
Apports de la biologie moléculaire
Le développement récent de la biologie moléculaire apporte des outils pour améliorer la spécificité de toutes ces méthodes de dénombrement.
stimation des densités de biomasse
Au lieu de dénombrer les bactéries, il est possible d’estimer la biomasse (masse bactérienne) par unité de volume, c’est-à-dire la densité bactérienne.
La pesée de la masse sèche est peu sensible, peu reproductible, et, par la suite, peu utilisée. Mais il existe des méthodes rapides d’estimation de la densité bactérienne.
La turbidimétrie permet de suivre l’évolution de la densité optique, reliée à la densité bactérienne par la loi de Beer-Lambert. Le suivi de l’évolution de la population bactérienne se fait en mesurant l’absorbance du milieu de culture grâce à un spectrophotomètre.
Principe
L’absorption de la lumière par une solution obéit à une loi exponentielle.
Cela signifie que chaque molécule contenue dans la solution capte non pas la même quantité absolue de lumière, mais la même proportion par rapport à la lumière incidente. Par exemple, si 1 cm de solution traversée absorbe 50% de la lumière incidente, le centimètre suivant en absorbera 50% des 50% restants et ainsi de suite. Il en découle une relation exponentielle entre la quantité de substance absorbant la lumière et la quantité de lumière absorbée. La quantité de substance absorbante dépend de l’épaisseur de la solution traversée et de la concentration. Si on choisit une épaisseur constante (cuve de 1 cm d’épaisseur pour la plupart des spectrophotomètres), la quantité de lumière ne dépend plus que de la concentration.
Schéma de la croissance
Une des premières observations biométriques de la croissance est due au bactériologiste anglais Ward qui fut le premier, en 1895, à représenter des données expérimentales de croissance sous forme graphique. Il introduisit le concept de temps de génération (temps mis par la population pour doubler) et identifia deux groupes de facteurs influant sur le temps de génération: les facteurs internes (l’âge du filament, la viabilité, pouvoir de germination des spores) et les facteurs externes (température, luminosité, quantité de nutriments). La même année en Allemagne, Muller établit l’existence de la phase de latence dans le développement des cultures bactériennes et distingua la phase de croissance exponentielle et la décélération. Buchanan (12) a décomposé la cinétique de croissance d’une population bactérienne en sept phases selon un schéma aujourd’hui classique. La figure (6) reproduit le dessin historique de Buchanan, où chaque point représente l’intersection entre une courbe et un segment, c’est-à-dire la transition entre deux phases. Bien que datant de 1919, cette reproduction est très proche des schémas actuels de courbes de croissance.
Champs d’application en microbiologie
Les micro-organismes sont très diversifiés et présents dans tous les biotopes où on les a cherchés. Ainsi, la microbiologie est une discipline très large, regroupant de nombreuses spécialités, et qui entretient des relations étroites avec d’autres disciplines biologiques fondamentales comme l’écologie, la biochimie, la génétique, la biologie moléculaire etc…, ou plus appliquée comme la médecine, l’agriculture, les sciences alimentaires, etc.
Les procédés de culture bactérienne occupent une place centrale dans toutes ces disciplines. L’importance de la modélisation de la croissance bactérienne et, plus généralement de la biométrie en bactériologie est ici présentée pour les différents champs d’application de la microbiologie.
Microbiologie alimentaire
De nombreux procédés de production d’aliments impliquent l’introduction de micro-organismes utiles (flore technologique). C’est le cas de tous les aliments traditionnels dont la fabrication repose sur une fermentation lactique (yaourt), alcoolique (boissons alcoolisées)… De plus, certains micro-organismes peuvent altérer le produit (flore de détérioration). Enfin, un aliment peut être contaminé par des microorganismes dangereux pour la santé du consommateur (flore pathogène).
En bactériologie alimentaire le batch c’est-à-dire l’étude des cinétiques en milieu liquide non renouvelé est le modèle de choix pour étudier la croissance d’une de ces flores dans un aliment, ce qui correspond au fait que des conditions limitantes en substrat ne sont que très tardivement atteintes dans un aliment.
Au début des années 1980, l’utilisation des outils biométriques en microbiologie alimentaire (plus particulièrement en hygiène et en sécuritéalimentaire) a connu un nouvel essor. Il s’agissait de construire un modèle de description de l’évolution d’une population bactérienne, pour ensuite réaliser des prédictions de ce développement dans de nouvelles conditions environnementales (38). En 1983 Roberts & Jarvis ont qualifié cette démarche de microbiologie prédictive ou prévisionnelle (predictive microbiology).Le principe à la base de la microbiologie prévisionnelle est la prédiction de l’évolution d’une population bactérienne dans des conditions environnementales données à partir d’observations passées (48). Il est alors envisageable de prédire l’évolution d’une flore pathogène dans un aliment.
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Table des matières
INTRODUCTION
PREMIERE PARTIE : RAPPELS BIBLIOGRAPHIQUES
I. STREPTOCOCCUS PNEUMONIAE
1.1. TAXONOMIE
1.2. HABITAT
1. 3. CARACTERES BACTERIOLOGIQUES
1.3.1. Caractères morphologiques
1.3.2. Caractères culturaux
1.3.3. Caractères biochimiques
1.4. PHYSIOPATHOLOGIE-POUVOIR PATHOGENE
II. HAEMOPHILUS INFLUENZAE
2.1. TAXONOMIE
2.2. CARACTERES BACTERIOLOGIQUES
2.2.1. Caractères morphologiques
2..2.2 Caractères culturaux
2.2.3. Caractères biochimiques
2.3. HABITAT-POUVOIR PATHOGENE
III. MORAXELLA CATARRHALIS
3.1. TAXONOMIE
3.2. HABITAT
3.3. CARACTERES BACTERIOLOGIQUES
3.3.1. Caractères morphologiques
3.3.2. Caractères culturaux
3.3.3. Caractères biochimiques
3.4. POUVOIR PATHOGENE
IV. PHYSIOLOGIE ET CROISSANCE BACTERIENNES
4.1. PHYSIOLOGIE ET METABOLISME BACTERIENS
4.2. CROISSANCE BACTERIENNE
4.2.1. Définition
4.2.2. Facteurs influençant la croissance
4.2.3. Suivi de la croissance bactérienne
4.2.4. Cinétique de la croissance
4.2.5. Classification des modèles de croissance
4.2. MICROBIOLOGIE PREDICTIVE
4.2. LIMITE DE LA MODELISATION
V. ETUDE DE LA REPONSE BACTERIENNE A UNE MODIFICATION DES FACTEURS ENVIRONNEMENTAUX
5.1. FACTEURS ENVIRONNEMENTAUX ET TYPE DE VARIATIONS
5.1.1. Facteurs environnementaux
5.1.2. Classifications des variations
VI. DESCRIPTION DE LA MORTALITE
6.1. COURBES DE SURVIE LINEAIRE
6.1.1. Théorie de la cible unique
6.1.2. Descripteurs de la mortalité
6.2. COURBES DE SURVIE NON LINEAIRE
DEUXIEME PARTIE : NOTRE EXPERIENCE
I. METHODOLOGIE
1.1. MATERIEL ET MILIEUX
1.1.1. Matériel
1.1.1.1. Cadre d’étude
1.1.1.2. Souches bactériennes
1.1.1.3. Matériel pour l’identification …
1.1.1.4. Matériel pour l’étude de la croissance
1.1.1.5. Matériel pour la conservation des souches
1.1.2. Milieux
1.1.3. Contrôle de stérilité et d’efficacité des milieux
1.2. METHODES
1.2.1. Streptococcus pneumoniae
1.2.1.1. Identification
1.2.1.2. Etude de la croissance
1.2.1.3. Etude de la survie
1.2.2. Haemophilus influenzae et Moraxella catarrhalis
1.3.2.1. Identification
1.3.2.2. Etude de la croissance
1.3.2.3. Etude de la survie
II. EXPLOITATION DES RESULTATS ET COMMENTAIRES
2.1. HAEMOPHILUS INFLUENZAE
2.1.1. Courbes de croissance
2.1.2.Courbes de survie
2.2. MORAXELLA CATARRHALIS
2.2.1. Courbes de croissance
2.2.2.Courbes de survie
2.3. STRETOCOCCUS PNEUMONIAE
2.3.1. Courbes de croissance
2.3.2.Courbes de survie
III. MISE EN PLACE DES OUTILS MATHEMATIQUES
3.1. PREDICTION DE LA DUREE DE CONSERVATION DE H.INFLUENZAE A -20°c
3.2. PREDICTION DE LA DUREE DE CONSERVATION DE M. CATARRHALIS A -20°c
3.3. PREDICTION DE LA DUREE DE CONSERVATION DES BACTERIES A – 80°c
IV. DISCUSSION
4.1. LES SOUCHES BACTERIENNES
4.2. CINETIQUE DE CROISSANCE
4.3. PREDICTION DE LA CONSERVATION
.44. APPORTS ET PERSPECTIVES
CONCLUSION
REFERENCES BIBLIOGRAPHIQUES
