Etude de la protéine MSP1: optimisation de l’assemblage des nanodisques

Fonctionnement des détergents

En solution, les détergents s’assemblent en micelles au-dessus d’une concentration critique, appelée cmc (concentration micellaire critique). Il existe un équilibre entre les détergents en monomère et en micelle, mais plus la concentration en détergent augmente et plus la quantité de micelle augmente, alors que la quantité de monomère reste stable. La taille des micelles dépend de la structure du détergent, mais aussi de l’environnement (force ionique, pH, température).
La cmc d’un détergent est un critère essentiel pour la manipulation de protéines membranaires. Lors de l’extraction des protéines membranaires, les détergents doivent être utilisés à une concentration au-dessus de la cmc pour pouvoir solubiliser les membranes et maintenir en solution les protéines membranaires. Les membranes sont fragmentées et solubilisées dans les micelles et les protéines membranaires forment alors des complexes incorporant les détergents qui protégent leurs surfaces hydrophobes du solvant.
Une méthode alternative d’extraction de protéines membranaires consiste à utiliser la température pour jouer sur les phases des détergents. En effet, à partir d’une certaine température (cloud point), une séparation de phase s’effectue entre la phase aqueuse et la phase contenant le détergent. Cette valeur dépend de la concentration en détergent et de la force ionique du tampon.
Cette méthode a été utilisée avec succès pour l’extraction d’une protéine chimérique appelé EGIcore-HFBI constituée du cœur catalytique de la cellulase endoglucanase 1 et de la petite protéine hydrophobine 1.
Il est difficile de prédire l’effet d’un détergent sur une protéine. Il est donc nécessaire de tester un ensemble de détergents afin de déterminer celui qui permettra d’extraire la protéine de la membrane sans endommager son repliement. Le détergent utilisé peut être diffèrent selon l’étape de purification (extraction, solubilisation). De plus, le choix du détergent est aussi important dans le processus de cristallisation. Ce facteur supplémentaire dans la cristallisation de protéines membranaires par rapport aux protéines solubles est en partie responsable de la difficulté à obtenir des cristaux et résoudre des structures de protéines membranaires.
Les protéines membranaires solubilisées par des détergents peuvent être étudiées par les techniques physico-chimiques utilisées pour les protéines solubles. Cependant, la présence de détergent lié et de détergent libre en solution génère des inhomogénéités et donc des difficultés dans la mise en œuvre et l’interprétation des expériences biophysiques. De plus, le manteau de détergent peut empêcher des interactions protéine-protéine ou protéine-lipides.
La majorité des structures de protéines membranaires a été déterminée avec des protéines membranaires maintenues en solution grâce à des détergents. Dans les années 80, un travail important (en particulier dans l’équipe de J. Rosenbusch à l’Université de Bâle) a permis de comprendre les propriétés des détergents et de concevoir de nouveaux détergents permettant la cristallisation des protéines membranaires.
Néanmoins, beaucoup de protéines ne cristallisaient pas ou avec un pouvoir diffractant très faible. Les tests d’activité sur des protéines en solution (tests de liaison ou réaction enzymatique) montrent que les valeurs d’activité varient selon l’environnement de la protéine (membrane ou détergents) . Plus récemment, la pertinence de certaines structures cristallographiques a été discutée mettant en lumière que les détergents induisent des conformations non présentes en solution, . En effet, des détergents trop puissants peuvent forcer les protéines à adopter des conformations non existantes en solution (ou non physiologiques).
Les problématiques liées à l’utilisation des détergents ont conduit au développement d’autres molécules tensio-actives capable de maintenir en solution les protéines membranaires dans des conditions plus proches des conditions natives. Ces molécules dérivent de détergents préexistants, comme les maltose-neopentyl glycol (MNG) ouont des structures moins conventionnelles, comme les amphipols ou les tensio-actifs fluorés.

Les amphipols

Les amphipols ont été développés dans les années 90 par Jean-Luc Popot et Christophe Tribet et leur équipe . L’objectif de ces molécules est d’augmenter l’affinité entre le surfactant et les surfaces hydrophobes des parties transmembranaires des protéines membranaires, de telle sorte qu’il n’y ait plus de molécules libres en solution et qu’une quantité très faible d’amphipol soit suffisante pour maintenir la protéine soluble.
Les amphipols ont permis de maintenir en solution de nombreuses protéines membranaires . Certains travaux font état d’une plus grande stabilité des protéines membranaires solubilisés par cette technique par rapport aux détergents.
L’utilisation des principales méthodes biophysiques d’études des protéines est compatible avec l’utilisation des amphipols. Cependant, ces molécules présentent certains inconvénients, comme la difficulté de transférer les protéines solubilisées avec des amphipols dans des membranes, ou de remplacer les amphipols par des détergents.
Aucune structure n’a encore été résolue avec des protéines en amphipols cristallisés.
Récemment de nouveaux amphipols non ioniques, plus propices à la cristallisation, ont été développés en utilisant la fonction hydroxyle de groupement Tris pour augmenter la solubilité de la molécule . Ces amphipols restent toutefois délicats à utiliser tant leur solubilité est faible. Plus récemment, d’autres amphipols ont été développés en ajoutant des groupements glycosyls.

Les lipopeptides détergents

Les lipopeptides détergent sont des petits peptides qui ont été pensés pour permettre de solubiliser et/ou de garder en solution des protéines membranaires. Il existe deux types de lipopeptides détergents.
Le premier type de lipopeptides détergents sont des peptides qui ont une taille de 25 acides aminés et sont structurés en hélices  amphiphiles, un côté de l’hélice est hydrophile et l’autre côté ainsi que les extrémités N- et C -terminales sont hydrophobes.
La face hydrophobe du lipopeptide détergent est composée d’alanine et aux positions 2 et 24 des chaines alkyls sont attachés covalemment. Le côté hydrophobe interagit avec les domaines transmembranaires des protéines membranaires alors que les part ies hydrophiles font face au solvant et par conséquent aident à la solubilisation de la protéine membranaire.

Méthodes de reconstitution de protéines membranaires dans des membranes

Les liposomes

Il existe différents systèmes qui permettent de faire une membrane lipidique.
Le système le plus commun est le liposome. Il consiste en une vésicule formée par une bicouche lipidique, avec en son sein un compartiment aqueux. Les liposomes peuvent avoir différentes tailles, qui varient en fonction des lipides utilisés ou des conditions physico-chimiques, comme le pH ou la température, ou mécaniques (par exemple sonication ou extrusion). Les liposomes forment un compartiment fermé, ce qui les rends utile pour les études fonctionnelles de protéines ayant une activité de transport.
L’inconvénient de cette méthode est que la coalescence des vésicules est importante surtout à température ambiante. Par conséquent, les liposomes augmentent en taille et en hétérogénéité, compliquant les études structurales. Des études structurales ont en revanche pu être menées par RMN du solide, où la taille des objets étudiés et leur homogénéité sont moins essentielles.

Les bicelles

Les bicelles sont de petits fragments de membranes qui sont maintenus en solution par un lipide (comme le 1,2-diheptanoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DHPC)). Elles ont l’avantage d’être beaucoup plus stables que les liposomes, les fusions entre bicelles étant moins nombreuses. Les bicelles étant petites et stables, elles ont beaucoup été utilisées en RMN du solide . Des structures de protéines en bicelles ont aussi été obtenues par cristallographie des rayons X.
La partie suivante présente la technique que j’ai étudiée et utilisée durant ma thèse : la reconstitution de protéines membranaires dans une membrane lipidique de type nanodisques.

Reconstitution de protéines membranaires dans des nanodisques

Les nanodisques consistent en une bicouche lipidique piégée par une protéine amphiphile. La protéine la plus couramment utilisée pour l’assemblage de nanodisques est la protéine MSP1 (Membrane Scaffold Protein), une protéine chimérique dérivée de l’apolipoprotéine A1. Cette procédure a été initialement développée par Steven Sligar de l’Université de l’Illinois.

La protéine Apolipoprotéine A1

Plusieurs apolipoprotéines permettent de former ces structures discoïdales (voir partie II4), nous allons nous concentrer ici sur l’apolipoprotéine A1

Conformation de la protéine apolipoprotéine dans les particules HDL

L’augmentation de la concentration en lipides induit un changement de la conformation de la protéine ApoA1, qui permet de former une sphère. Les mécanismes exacts de la formation de la sphère ne sont pas encore connus, ni les résidus importants pour ce changement de conformation.
Un modèle propose que la protéine ait la même conformation en double ceinture qu’en nanodisques, sauf que les domaines N- et C-terminaux sont structurés en hélices et ne font pas partie de la double ceinture. Ce modèle a été obtenu par dynamique moléculaire, où 160 lipides POPC sont entourés par deux apolipoprotéines A1. Après ajout de 60 molécules cholestérol ester, les protéines apolipoprotéine A1 garde la même conformation en double ceinture..
Lorsque plus d’apolipoprotéines A1 sont recrutées dans les particules HDL, les apolipoprotéines A1 gardent une conformation en double ceinture et forment une structure en trèfle (Figure I-15).

Protéines utilisées pour la formation des nanodisques

La protéine la plus utilisée pour faire des nanodisques est une construction dérivée de la protéine apolipoprotéine A1. Comme la partie N-terminale de l’apolipoprotéine A1 est impliquée dans la formation de fibre amyloïde et n’est pas nécessaire pour la formation de particules HDL discoïdales, les 43 premiers résidus ont été retirés. Cette construction a été renommée MSP1, pour Membrane Scaffold Protein. Pour avoir des nanodisques de taille plus importante, des constructions avec des répétitions des hélices 4,5 et 6 ont été développées et appelées MSP1E1 (répétition hélice 4), MSP1E2 (répétition hélice 4 et 5), et MSP1E3 (répétition hélice 4,5 et 6). Dans le cadre de ma thèse, j’ai utilisé les protéines MSP1 et MSP1E3.
Deux autres protéines peuvent être utilisées pour former des nanodisques, l’apolipophorine 3, une protéine d’insecte venant des organismes M. mori et B. sextat ;et l’apolipoprotéine E humaine . Ces protéines possèdent aussi des hélices amphipatiques qui leur permettent de s’associer aux lipides.
La protéine humaine apoE422K a servi avec succès pour étudier des protéines interagissant avec des nanodisques, ou pour incorporer des protéines membranaires.
L’hélice amphipatique appelé 18A (cf partie II3a), a aussi été utilisée pour former des nanodisques. Les disques formés par ces hélices amphipatiques ont une distribution de taille plus importante que les nanodisques formés à l’aide des apolipoprotéines.

Nanodisques natifs formés directement à partir de membranes

Récemment, l’assemblage de nanodisques directement à partir de membranes a été décrit. Le Styrene-maleic acid (SMA) possède la propriété de pouvoir s’insérer dans une membrane et de la solubiliser en formant des disques d’une taille de 10nm, comprenant lipides et protéine membranaire, de manière relativement homogène.

Méthodes de reconstitution

Il existe plusieurs méthodes de reconstitution des protéines membranaires dans des nanodisques.

Assemblage direct

La première méthode qui a été mise au point pour incorporer des protéines dans les nanodisques est appelée méthode d’assemblage directe. Cette méthode consiste à mélanger des protéines membranaires maintenues en solution avec des détergents avec des lipides préalablement solubilisés avec des détergents, et avec une protéine d’assemblage. Les détergents sont ensuite enlevés et conséquemment les lipides et les protéines d’assemblages vont former les nanodisques, incorporant au passage des protéines membranaires.
Le ratio entre les lipides, les protéines d’assemblage et les protéines membranaires doit être optimisé pour avoir la meilleure incorporation possible. Pour estimer le ratio optimal pour des nanodisques vides, la taille des différents nanodisques déterminée par SAXS et par DLS , et le volume pris par un lipides sont des paramètres nécessaires pour calculer le nombre de lipides par nanodisques.
Il y a plusieurs façons d’enlever les détergents :
– par dialyse, les détergents se dialysent généralement difficilement, quand la concentration en détergents est supérieur à la concentration micellaire critique, la taille des micelles est trop importante pour passer à travers les membranes et par conséquent seulement les monomères passent à travers les membranes.
Cependant certain détergents forment des micelles de petites tailles, ce qui les rends facilement dialysable. Par exemple, le cholate de sodium forme des micelles de 900 à 1200Da est peuvent donc être enlevés grâce à cette méthode.
– Avec l’aide de biobeads, qui sont des billes en polystyrène comportant des cavités hydrophobes qui interagissent avec la queue hydrophobe des détergents. En retirant les biobeads, les détergents sont enlevés de la solution. Les biobeads peuvent être utilisé avec le Triton-X 100, le cholate, le C12E8, l’octylglucoside et le DDM.
– Avec des cyclodextrines, qui sont des oligosaccharides cyclique en forme de cage qui piègent les détergents . Il y a trois différentes cyclodextrines, la cyclodextrine α, la cyclodextrine β et la cyclodextrine γ qui sont formés de 6, 7 ou 8 sous-unités de glucopyranose respectivement. Les cyclodextrines α, β et γ ont des affinités différentes pour les détergents.

Assemblage en synthèse in vitro

La surexpression de protéines membranaires, leur extraction des membranes et leur solubilisation ne sont parfois pas possibles dans les systèmes d’expression in vivo couramment utilisés. Dans ce cas, elles peuvent parfois être surexprimées dans des systèmes d’expression in vitro.
L’incorporation de protéines membranaires en nanodisques peut aussi se faire dans ce système d’expression, en ajoutant des nanodisques préformés dans le mélange réactionnel.

Etudes fonctionnelles

La capacité des nanodisques de maintenir en solution des protéines membranaires en fait un objet très pertinent pour étudier avec des méthodes biophysiques les protéine s membranaires. Depuis la première incorporation d’une protéine membranaire dans les nanodisques en 1998 , cette méthode a été utilisée pour répondre à de nombreuses questions biologiques (cf exemples répertoriés dans le Tableau 2).
Un des avantages majeurs des nanodisques est l’accès aux deux faces de la membrane, ce qui n’est pas toujours possible dans le cas d’une reconstitution en liposomes. A l’inverse, dans le cas de protéine membranaire transporteurs, l’absence d’une vésicule est problématique pour étudier l’activité de la protéine.
Un autre avantage est la possibilité de pouvoir contrôler le degré d’oligomérisation des protéines membranaires. En jouant sur les ratios protéine d’intérêt, lipides, et protéines d’assemblage, il est possible de former des nanodisques contenant différents états d’oligomérisation de la protéine d’intérêt. Cela a été fait par exemple avec un récepteur au glutamate, qui a besoin d’être dimèrique pour fonctionner . En augmentant la quantité de lipides et de protéines d’assemblage par rapport à la protéine d’intérêt, on favorise statistiquement l’incorporation d’une protéine par nanodisques. Il est ainsi possible de déterminer l’état d’oligomérisation de la conformation active de la protéine.
La majorité des études réalisées sur des protéines membranaires maintenues en solution par des nanodisques concerne des études fonctionnelles. Par exemple, l’activité ATPasique des ABC transporteurs est facilement mesurable avec la protéine incorporée dans des nanodisques. Les activités mesurables de protéines possédant un chromophore dont les caractéristiques spectrales varient en fonction du cycle catalytique sont aussi des modèles de choix pour l’étude de leur activité dans une membrane lipidiques. A l’inverse, l’étude de l’activité de protéine membranaire qui nécessite une cavité est impossible, à moins de pouvoir recréer une cavité en associant les nanodisques à un liposome, comme cela a été fait avec les protéines v-snare et t-snare.
Différentes méthodes sont compatibles avec les nanodisques afin de réaliser des études d’interactions. La plus simple est l’utilisation de la chromatographie d’exclusion de taille avec la protéine incorporé et son partenaire. Cela a été utilisé pour montrer l’interaction entre la protéine secY et Syd. La résonance plasmonique de surface est utilisable avec les nanodisques immobilisé sur une surface ou avec les nanodisques comme partenaires.

Etudes à l’aide de la résonance magnétique nucléaire

Dans une étude de l’équipe de Hiller, les spectres RMN de la protéine membranaire VDAC-2 en détergent LDAO et en nanodisques sont parfaitement superposables (Figure I-18). Cela démontre la faisabilité d’étude de protéines membranaires en nanodisques par cette approche.
Un des problèmes pour la résolution de structures par RMN est la taille des nanodisques qui vont entrainer un temps de relaxation important. Par conséquent, l’interprétation des spectres est difficile, à cause du chevauchement des tâches de corrélation.
Pour remédier à cela, différentes troncations de la protéine MSP1 ont été réalisées par deux équipes de manière simultanée, afin de réduire la taille des nanodisques.

Table des matières
Liste des tables 
Abbréviation 
I. Introduction 
I.1. L’étude des protéines membranaires
I.1.1. Importance des protéines membranaires
I.1.2. Etudes structurales des protéines membranaires
I.1.3. Méthodes d’étude des protéines membranaires
I.2. Reconstitution de protéines membranaires dans des nanodisques
I.2.1. La protéine Apolipoprotéine A1
I.2.2. La composante lipidique des nanodisques.
I.2.3. Méthodes alternatives utilisées pour former des nanodisques
I.3. Utilisation des nanodisques pour l’étude de protéines membranaires
I.3.1. Méthodes de reconstitution
I.3.2. Etudes fonctionnelles
I.3.3. Etudes structurales
I.4. Incorporation de protéine membranaires
II. Matériel et méthodes 
II.1. Formation des nanodisques
II.1.1. Expression des protéines d’assemblages MSP1 et MSP1E3D1 chez E.coli
II.1.2. Purification par chromatographie d’affinité
II.1.3. Assemblage de nanodisques vides
II.1.4. Caractérisation de la protéine MSP1
II.1.5. Assemblage de nanodisques à partir de membrane
II.2. Etude de BmrA
II.2.1. Production de BmrA
II.2.2. Assemblage des nanodisques avec BmrA
II.2.3. Test d’activité
II.2.4. Microscopie électronique
II.3. Etude de YedZ
II.3.1. Purification de YedZ
II.3.2. Assemblage des nanodisques contenant YedZ
III. Méthodologie des nanodisques 
III.1. Introduction
III.2. Etude de la protéine MSP1: optimisation de l’assemblage des nanodisques
III.2.1. Purification de la protéine MSP1 et caractérisation de son état oligomérique
III.2.2. Interaction des protéines d’assemblage avec les métaux
III.2.3. Effet de la présence de métaux sur la stabilité de MSP1
III.2.4. Rôle des ions avec les nanodisques
III.2.5. Essais de cristallisation des nanodisques
III.3. Assemblage de nanodisques à partir d’une membrane native
III.4. Discussion
IV. Etudes fonctionnelles des protéines hèmiques YedZ et SpNox 
IV.1. Introduction
IV.2. Etude de la protéine YedZ
IV.2.1. Incorporation dans des nanodisques
IV.2.2. La problématique liée à l’Hème
IV.2.3. Etude de l’interaction entre YedZ, Fre et YedY
IV.3. Etude de la protéine SpNox
IV.3.1. Incorporation dans des nanodisques
IV.3.2. Test d’activité
IV.3.3. Cristallogenèse par diffusion de vapeur
IV.4. Discussion
V. Etude structurale de transporteurs ABC: BmrA et BceB-RS 
V.1. Introduction
V.2. Etude de la protéine BmrA
V.2.1. Incorporation dans des nanodisques
V.2.2. Caractérisation fonctionnelle
V.2.3. Etude structurale à l’aide de la Cryo-microscopie électronique
V.2.4. Essais de cristallisation en phase cubique
V.3. Etude de la protéine BceAB dans les nanodisques
V.3.1. Insertion de la protéine BceAB en nanodisques
V.3.2. Activité du transporteur BceAB
V.4. Discussion
VI. Conclusion générale

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