Soutenance mémoire
Les quinones sont des composés organiques très réactifs donc facilement réductibles à un ou deux électrons. La métabolisation intracellulaire de ces quinones par des réductases à un électron telles que le cytochrome P450 ou d’autres flavoprotéines réductases génèrent des semiquinones instables à l’origine de la production de radicaux libres conduisant à un stress oxydant. Les quinones-réductases sont des enzymes qui catalysent la réduction des quinones à deux électrons pour former des hydroquinones évitant ainsi la formation de semiquinones toxiques. La forme hydroquinone est chimiquement moins réactive donc plus stable que la forme semiquinone. Pour cette raison les quinone-réductases sont considérées comme des enzymes de détoxification. Cependant des analyses antérieures ont montré que ce caractère détoxifiant était remis en cause pour certains types de quinone et dépendait aussi du type de cellules considéré (Cassagnes et al., 2015).
Ainsi, afin de mieux comprendre le rôle de QR2, des analyses ont été réalisées en présence de différents types de cellules surexprimant QR2. En particulier, compte tenu du lien déjà établi entre QR2 et perte et acquisition de mémoire (Benoit et al., 2010), d’une part, et de l’implication du stress oxydant dans les processus de neurodégénérescence (Alam et al., 1997 ; Sayre et al., 2001), d’autre part, nos études se sont orientées vers des cellules neuronales de type neurones primaires et lignées de neuroblastomes. Ainsi l’objectif de cette thèse est de mieux comprendre le rôle de QR2 en étudiant la métabolisation intracellulaire de quinones d’intérêt, le stress oxydant induit et les procès de détoxification associés. Ce mémoire s’organise en quatre chapitres. Après une étude bibliographique dans le Chapitre 1 portant sur les quinones, les quinone-réductases et leurs rôles respectifs dans la neurodégénérescence, le Chapitre 2 présente une étude sur la spécificité de la quinoneréductase 2 vis-à-vis de différents substrats quinones ou pseudo-quinones par comparaison avec son homologue la quinone-réductase 1. Le Chapitre 3 est consacré à l’étude de la toxicité de 2 quinones (la ménadione et l’adrénochrome) sur des cellules neuronales en présence de quinone-réductases 2 via une étude du stress oxydant généré. Enfin dans le Chapitre 4, nous avons étudié sur ces mêmes cellules et par différentes méthodes originales d’analyse du stress oxydant, l’effet de la coopération de la quinone-réductase 2 avec une enzyme de conjugaison vis-à-vis de la toxicité de ces deux quinones.
Quinones
es quinones sont des composés ubiquitaires dans la nature et l’un des éléments indispensables dans les organismes vivants. Elles sont notamment mises en jeu dans la chaine respiratoire cellulaire pour le transport d’électrons (Monks et al., 1992). Les quinones sont des composés organiques possédant un noyau benzénique disubstitué par des groupements carbonyles qui peuvent être en position ortho, pour former une ortho-quinone 1 ou en positon para, pour former une para quinone 2 (Brown et al., 2017). Il existe d’autres variétés de molécules que l’on appelle des pseudoquinones pour lesquelles le second groupement carbonyle est remplacé par d’autres substituants. Parmi ces pseudoquinones on peut citer le di éthylstilbestrone 3, ou des structures très condensées telles que le benzo[a]pyrène 1,6- dione 4 et la tétracycline 5 (Monks et al., 1992).
En raison de cette diversité structurelle, certaines quinones sont plus réactives que d’autres. Par exemple, les ortho-quinones 1 sont plus facilement réductibles que les para-quinones 2. Pour réduire une quinone en hydroquinone, la quinone a besoin de deux électrons et deux protons (Figure 1). La quinone n’est pas basique et se protone avec difficulté (pKa ~ 1 pour la benzoquinone). La quinone protonée est plus oxydante que la quinone non-protonée (le potentiel redox est plus élevé). La forme réduite à un électron d’une quinone est appelée une semiquinone. La semiquinone est plus basique que la quinone, mais elle n’est pas assez basique pour se protoner à pH 7,4 (cf. pKa = 4 pour QH● par rapport à 1 pour QH+, Figure 1). Ainsi, la plupart des semiquinones existent sous la forme d’anion radicalaire à pH physiologique. En raison de la charge répulsive, la semiquinone anion radicalaire est plus faiblement oxydante comparé à la quinone d’origine ( − 1,17 V < − 0,58 V Figure 1). D’autre part, la semiquinone radicalaire neutre est plus oxydante que sa forme anion radicalaire.
(− 0,6 V > − 1,17 V). L’oxydation à un électron de l’hydroquinone est plus facile après déprotonation en mono-anion. La forme hydroquinone est moins facile à ré-oxyder donc plus stable que la semiquinone .
Le potentiel redox d’une quinone peut être influencé par la substitution sur le cycle. Typiquement, une substitution par un groupement électro-attractif (halogène, nitro ou groupement carbonyle) rend la quinone plus oxydante et sa forme hydroquinone moins facile à oxyder. Au contraire, une substitution électron-donneur (amino, hydroxy, méthoxy) rend la quinone moins oxydante et sa forme hydroquinone plus facile à ré-oxyder (Kalyanaraman et al., 1987). Les formes réduites partielles et totales (semiquinone et hydroquinone) sont des réducteurs majeurs, mais ces deux espèces ont une réactivité différente. Dans certains cas, le potentiel redox de la semiquinone est suffisamment faible pour qu’elle puisse transférer son électron non apparié vers un oxydant tel que l’oxygène. S’il existe un mécanisme pour réduire la quinone en semiquinone (généralement catalysé par des enzymes), un cycle redox quinone/semiquinone se met en place. Ceci a pour conséquence de créer en présence d’oxygène un flux d’anions superoxydes, entrainant la formation d’autres espèces réactives de l’oxygène (ROS) responsables de la peroxydation lipidique, de dommages à l’ADN, aux protéines et à d’autres molécules indispensables à la vie de la cellule. La réduction totale à deux électrons d’une quinone en hydroquinone peut être une étape essentielle pour détoxifier la quinone.
Au niveau cellulaire, la quinone peutsubir une réduction enzymatique à un ou deux électrons. La réduction à un électron est réalisée par des enzymes NADPH cytochrome P450 réductase microsomales, NADH-cytochrome-B5 réductase microsomales ou NADH-ubiquinone oxydoréductase aboutissant à la formation d’une semiquinone instable, alors que la réduction à deux électrons réalisée par des enzymes de type quinone-réductase conduit à la formation d’hydroquinones plus stable (Brunmark et Cadenas, 1989 ; Kappus et Sies, 1981 ; Monks et al., 1992 ; Powis et al., 1981 ; Wilson et al., 1986).
Quinone-réductases
Les quinone-réductasessont des oxydoréductasesflavine dépendantes. Ellessont ubiquitaires dans le cytoplasme, mais elles n’existent pas dans les mitochondries ni le nucléoplasme (The Human Protein Atlas, 2019a). Elles catalysent la métabolisation de phase 1 d’une quinone en utilisant comme cofacteur la flavine adénine dinucléotide (FAD) pour les mammifères et certaines bactéries, ou la flavine mononucléotide (FMN) pour les plantes, les champignons et certaines bactéries. Ces enzymes réduisent la quinone avec 2 électrons pour produire une hydroquinone plus stable est donc potentiellement moins toxique que la semiquinone formée par réduction à 1 électron.
En fait, il existe deux enzymes de type quinone-réductase, la quinone-réductase 1 (QR1) et la quinone-réductase 2 (QR2). Les deux enzymes sont quasiment identiques au niveau structural et au niveau de leur mécanisme de réduction des quinones.
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Table des matières
INTRODUCTION GENERALE
CHAPITRE 1 ─ REVUE BIBLIOGRAPHIQUE
1. QUINONES
2. QUINONE-REDUCTASES
2.1. NAD(P)H : QUINONE-REDUCTASE 1 (QR1) (EC 1.6.5.2)
2.1.1. Structure
2.1.2. Mécanisme d’action
2.2. NRH : QUINONE-REDUCTASE 2 (QR2) (E.C.1.10.99.2)
2.2.1. Structure
2.2.2. Mécanisme d’action
3. QUINONE-REDUCTASES ET MALADIES NEURODEGENERATIVES
3.1. NEURODEGENERESCENCE ET STRESS OXYDANT
3.1.1. Maladie d’Alzheimer
3.1.2. Maladie de Parkinson
3.2. CATECHOLAMINES
3.2.1. Toxicité de la dopamine
3.2.2. Toxicité de la noradrénaline
3.3. QR2 ET NEURODEGENERESCENCE
4. DETECTION ET QUANTIFICATION DES ESPECES REACTIVES DE L’OXYGENE (ROS)
4.1. RESONANCE PARAMAGNETIQUE ELECTRONIQUE
4.2. FLUORESCENCE
4.3. CHROMATOGRAPHIE LIQUIDE COUPLEE A LA SPECTROMETRIE DE MASSE
4.4. COMPARAISON DES METHODES
CONCLUSION
CHAPITRE 2 ─ NOTIONS DE SPECIFICITE DE LA QUINONE-REDUCTASE 2
INTRODUCTION
1. CAS DES PARA-QUINONES
1.1. ACTIVITES ENZYMATIQUES DE QR2 VIS-A-VIS DES PARA-QUINONES
1.2. PRODUCTION DE RADICAUX ASSOCIES A LA REDUCTION DE LA QUINONE
2. CAS DES ORTHO-QUINONES
3. AUTRES SUBSTRATS
CONCLUSION
CHAPITRE 3 ─ DEREGULATION REDOX INDUITE PAR LA METABOLISATION DES QUINONES EN PRESENCE DE QR2
INTRODUCTION
1. ETUDE DE LA PRODUCTION DE ROS INDUITE PAR LA METABOLISATION DE PARA ET ORTHO-QUINONES PAR DES CELLULES K562
1.1. CONDITIONS EXPERIMENTALES
1.2. METABOLISATION DE PARA-QUINONES
1.3. METABOLISATION D’ORTHO-QUINONES
2. ETUDE DE LA PRODUCTION DE ROS INDUITE PAR LA METABOLISATION DE PARA ET ORTHO-QUINONES PAR DES CELLULES SH-SY5Y
2.1. METABOLISATION DE LA MENADIONE
2.1.1. Analyse des spectres
2.1.2. Analyse quantitative
2.2. METABOLISATION DE L’ADRENOCHROME
2.2.1. Analyse des spectres
3. NEURONES PRIMAIRES
3.1. Analyse des spectres
3.2. Analyse quantitative
CONCLUSION GENERALE
