Etude de la fixation de la thuringiolysine sur les erythrocytes adifferentes temperatures 

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Cdonne de thiopropyl sepharose 6B

Le concentrat de culture de volume ega! a 550 ml et titrant 22.230 UH/ml (fraction Fl ) est adsorbe sur gel de thiopropyl sepharose 6B e quilibre dans du tampon PBS pH 6,8. La c d onne est lavee avec Ie meme tampon contenant de l’EDTA 5 mM, jusqu’a ce que la densite optique des fractions a 280 nm soit negligeable.
L’elu tion de la thuringiol ysine se fait ensuite avec du PBS pH 7,5 contenant de l’EDIA 5 mM et du dithiothreitol (DDT) 5 mM. Des fractions de 3,2 rnl sont recueillies a un debit de 10 mI/h. Le dosage herndytique des fractions, ainsi que leur teneur relative en proteines par lecture au spectrophotometre a 280 nrn, on t ere realises (Fig. 2).
Les fractions hemdytiques (a partir du tube nO 18) regroupees, de volume ega! a 134 rnl, titrent 33.000UH/mI.

Ceionne de DEAE–eellulose

Afin de reduire la duree de cet te etape de purification, les fractions hemdytiques eluees de la colonne de thiopropyl sont cone entrees par ultrafiltration dans une cellule Arne on avant d’etre adsorbees sur la colonne de DE–52. La cellule Amicon est equipee d’une membrane Amicon PM-1O qui elimine du concentrat tout composant de poids moleculaire inferieur a 10.000. Apres concentration, le volume est reduit a30 ml, de titre egal a 150.000 UH/mI.
Ce concentrat est dialyse exhaustivement c ontre du tampon phosphate de sodium 10tnM pH 7,5. Le dia!ysat (fraction F2), de volume ega! a 36rnl a 1l0.000UH/mI, est depose sur gel de DEAE–eeUulose prealablement equilibre dans Ie meme tampon. Des fractions de 2,1 rnl sont recueillies a un deli. t de 20 rnI/h. Apres lavage de la colonne par le tampon d’equilibraticn afin d’eliminer les proteines non retenues, la thuringidysine est eluee par du tampon phosphate de sodium IOmM pH 7,5 contenant du NaCl 20mM. La densite optique a 280nm des fractions, ainsi que leur titre hemdytique, son t determines (Fig. 3).
Les fractions herridytiques (tube nO 58 a tube nO 74) sont crncentrees comrne precedemment dans une cellule Amicon munie d’une membrane PM-IO.
Le concentrat obtenu, de volume ega! a 5 ml titrant 320.000 UH/rnl, constitue la freetion purifiee de thuringiolysine (fraction F 3 ).
Les carac teristiques des differentes etapes de la purification sont resumees dans Ie Tableau VI.

Electrophorese sur geldepciyacrylamide-SDS

Une seule bande proteique correspondant a la thuringiolysine a ete mise en evidence par electrophorese sur gel de pdyacrylamide (7,5 % l 20 %) – SDS (1 %) de la fraction F3, apres coloration du gel au nitrate d’argent (Photo 1). Cette methode de coloration etant 20 l 50 fois plus sensible que celle au lieu de Coomassie, nous pouvons conclure CJJle la thuringiolysine est obtenue l un etat de purete extremement eleve.

Immunodiffusion doulie sur gel d’agarose

La fraction F3 testee par immunodiffusion montre une seule ligne de precipitation toxine – antitoxine avecle serum de lapin dirige centre la fraction F2. (voir Proprietes innnunologiques). .
La presence d’un arc de precipitation unique est une forte presomption de la purete de la solution antigeniqueconstituee par la toxine.

Activites enzymatiques

Aucune des activites enzymatiques detectees par le systeme Api-Zym dans le sumageant de culture de B. thuringiensis n’a etA! retrouvee dans la fraction puriflee de thunngiolysine. Par ailleurs, le test ~ I’azocdl s’est revele negatif, et aucune acttvtte phospholipasique n’a etA! decel6e, confirmant l’homogeneite de la toxine purifiee,

Formes oxydee et reduite dela thuriogidysine

Dans le materiel brut de depart, l’llCtivite hemdytique est la meme avant ou apres addition de reducteursc;;cInmelacystA!ine 50 mM.Mais au cours de la premiere etape de la purifcation, it y a oxydation partielle de la thuringiolysine. Ainsi la fraction Fl peut renfermer 20 % de molecules de toxine sous forme oxydee, et il est parfois necessaire de reacttver la preparation concentree de toxine avec du DIT 5 mM avant de la deposer sur cdonne de thiopropyl. La fraction F2, eluee avec du tampon contenant du DTT 5 mM, est entierement sous forme reduite, et il en est de rnemepour la fraction F3 de toxine puriflee..

PROPRIETES PHYSICO-CfDMIQUES DE LA THURINGIOLYSINE

Le paids mdeculaire (PM) a etA! determine par electrophorese sur gel de pdyacrylamide en presence de SDS. Les proteines etalons utilisees sont la phosphorylase b (PM = 94 Kd), la serumslbumme bovine (PM: 67 Kd), l’ovalbumine (PM = 43 Kd), l’anhydrase carbonique (PM = 30 Kd), l’inhibiteur trypsique de Soja (PM = 20,1 Kd) et l’ c:Y-lactalbumine (PM = 14,4 Kd). Sur une echelle semi-logarithmique, les PM des proteines de reference sont portes en fonction de leurs distances de migration sur gel (Fig. 4). La droite obtenue nous a permis d’estimer le PM apparent de la thuringiolysine a58 Kd.
Le PM de la toxine a ete egalement determine par filtration sur cdonne de Biogel P-lOO prealablement etalonne par la serumalbumine bovine, l’ovalbumine, la chymotrypsinogene A(PM = 25 Kd) et la ribonuclease A (PM = 13,7 Kd).
La comparaison des vdumes d’elution de ces proteines avec celui deIa thuringiolysine a permis d’evaluer son PM a60 Kd ± E (Fig. 5).

Activite ~cifique

L’activite specffique est de 700.000 UH/mg de proteine. n s’ensuit qu’une UH correspond a 1,42 ng de proteine, soit 2,37 x’IO-5 nmde, sur la base d’un poids rrideculaire de 60 Kd. En d’autres tennes, une mole de thuringiolysine contient 4,2.10 13 UH (a::tivite mdeculaire specifique).

Point isoelectrique (pI)

Le point isoelectriqae a ete determine par isofocalisation en veine liquide de 60.000 UH de la fraction F2 non rea::tivee par la cysteine. Dans ces conditions, la thuringidysine presente deux points isoelectriques a pH 6,0 et 6,3 (Fig. 7), avec la ml!iorite de l’activite hemdytique au pic de pI 6,3.
Cette Mterogeneite en charge de la thurlngiolysine a dejl ete rapportee par PENDLETON et al. (1973) qui avaient trouve deux valeurs de pI: 6,0 et 6,5, cette demiere valeur representant la forme electrophoretique ml!ieure. Dans leur revue sur les cytolysines thid-activees, SMYTH et- DUNCAN (1978) ont mis l’accent sur l’existence de formes multiples electrophoretiques pour ces hemolysines, des composants avec des valeurs de pI egeles a6,5 – 6,6 et 6,0-6,3 ayant e·te trouves, les premiers constituant la forme ml!ieure.
D’une maniere generale, cette Mterogeneite des cytolysines SH-dependantes n’a pas requ d’explication precise.
Une des causes eventuelles est une difference dans la structure covalente des molecules, due a l’oxydation ou a la reduction des groupes sulfhydryls de ces toxines. Al’etat oxyde.la presence de ponts disulfurespeut entrainer une restriction supplernentaire sur la configuration de la molecule, provoquant une difference de charge par rapport ala toxine al’etat reduit. Arm de confinner cette hypothese, la meme quantite de thuringidysine a l’etat pur (60.000 UH) prealablement reactivee par la cysteine 50 mM, a ete deposee sur cdonne d’isofocalisation, dans les memes conditions que precedemment. Dans ce cas, les memes valeurs de pI ont ete retrouvees, avec toutefois une predominance accrue de la forme isoelectriqae de pl egele a6,3 (Fig. 8).

Stabilite de la thuringiolysine

Effet de la temperature

De la toxine purifee titrant 2.300 UH/ml ae16 incubee ~ 26° C, 37° C et 56° C pendant des temps variables et l’activite hemdytique residuelle est ensuite <Jetenninee en tampon PBS pH 6,8 contenant 0,1 % de SAB (Fig. 9). Les resultats montrent quela thuringiclysine est une proteine thenndabile. Elle pert 70 % de son activi16 apres 30 mn d’incubatim ~ 26° C, et 77.% apres 30 ron ~ 37° C. La toxine est totalement Inactivee apres 5 ron d’incubation ~ 56° C. Une instabilite thennique similaire a e16montree par BERNHEIMER et GRUSHOFF (1967) pour la ceredysine. La necessite de groupes SH libres pour lemaintien de I’activite est probablement une des raisons de cette instabilite.

Effet du pH

La marne preparation de thuringidysine (2300 UH/ml) a e16 incubee pendant differents temps (IS ron ~ 1 h) dans les tampons suivants ~ 0° C : acetate de sodium 150 roM pH 4,8 i tampon PBS pH 6 i tampon PBS pH 6,8 i borate 10 roM~hlorure de sodium 9 o/~ pH 8 et Tris 150 roM pH 9.
Les titres residuels determines en tampon PBS pH 6,8 contenant 0,1 % de SAB montrent que la toxine est stable entre pH 6 et pH 8. Ble est totalement inactivee apres 15 ron d’incubation ~ pH 4,8 et pH 9.
En <Jepit de cette instalIli16 thennique et aux pH extremes, les solutions purifiees de thuringidysine gardent la totalite de leur activi16 en presence de 5 % (v/v) ~ycerd, a 20° C, pendant plusieurs semaines, et sont conservees de cette maniere.

ACTIVITES BIOLOGIQUES DE LA lHURlNGIOLYSINE

L’activite biologique la plus caracteristique de la thuringidysine est sot activite hemolytique. Les etudes quantitatives portant sur cette activite s’effectuent en incubant la toxine diluee de fscon appropriee dans I ml de tampon PBS pH 6,8 avec 0,5 ml d’erythrocytes (SEN) pendant 45 mn a 37° c. Le pourcentage des cellules lysees est ensuite determine par dosage a 541 nm de I’hernoglobine libere (voir chapitre MATERIEL et METHODES).

Cinetique de la lyse erythroeytaire

La lyse erythrocytaire induite par la thuringiolysine comprend plusieurs phases (Fig. 10), utilisant Ie protocole experimental decrit dans Ie chapitre MATERIEL et METHODES :
– une phase de latence qui correspond au temps necessaire ala toxine avant que Ie processus de lyse proprement dite se fasse. Cette phase inclut la periode de fixation de la toxine sur les erythrocytes.
– une phase d’hemdyse ou il y a liberation maximum d’hemoglobine aune vitesse constante et lineaire, et qui se termine quand 70 a 80 %des cellules sont lysees.
– une phase de ralentissement de la lyse du reste des cellules, avec une vitesse tendant progressivement vers zero.
La duree totale de l’hemolyse est de 30 mn, avec une phase de latence de 3 a5 mn.
La lyse erythrocytaire depend d’un certain nombre de facteurs dont la concentration en toxine, et la temperature.

Effet de la concentration en toxine sur la cinetique de lyse

L’etude cinetique de la lyse erythrocytaire a ete effectuee a trois concentrations differentes de toxine : 2 UH, I UH et 0,8 UH. Les resultats (Fig. 10) montrent que Ie pourcentage d’hemdyse est fonction de la concentration en toxine. Dans tous les cas, les differentes phases precedemment decrites sont retrouvees. Toutefois, la duree de la phase de latence est plus courte avec une concentration plus forte en toxine, et represente au maximum 5 mn.
Par ailleurs, la vitesse maxiniale de lyse est directement proportionnelle a la quantite de toxine (Fig. II). Hie augmente rapidement, de maniere Iineaire, en fonction de la dose de toxine presente dans Ie milieu reactionnel, partcularite deja ooservee pour la pneumolysine, tetanolysine, perfringciysine et qui n’est pas Ie cas pour la SOO (ALOUF et RAYNAUD, 1968).

Effet de la temperature sur la cmetique de lyse

L’etTet de la temperature sur la reactioo Iytique par la thuringiolysine a ete etudie. La cinetique de lyse a ete effectuee respectivement a (‘f’ C, 26° C et 37° C, la concentration en toxine choisie etant de I UH/ml (Fig. 12).
Les resul tats montrent une variation importante de la vitesse maximale de lyse, ainsi que du pourcentage fmal d’erythrocytes lyses, en fonction de Ia temperature. La vitesse de la reaction de lyse est maximale a 37° C et dirninue a 26° C, pour etre nulle a (‘f’ C marne apres 45 mn d’incubatioo. Soit la toxine ne peut pas se fixer a (‘f’ C sur les erythrocytes, soit le processus de lyse proprement dit est inhibe ~ cette temperature. Un changement de structure de la membrane il basse temperature serait une cause evenruelle de l’un ou l’autre de ces phenomenes.

Etude du mecanisme de la lyse el)’dlrocytaire : fuite du 86Rb+ intracellulaire

Les ions Na+ et K+ peuvent traverser la membrane erythrocytaire, grace a un systeme de transport actif, la «pompe» Na+ – r, qui utilise de I’energie metabolique pour le transport de Na+ a l’exteneur et celui de K+ aI’interieur de la cellule. Les ions K+ extracellulaires peuvent etre remplaces par des cationsmonovalents comme le rubidium (Rb+). Les ions Rb+ et K+ sont maintenus et transportes dans les cellules erythrocytaires d’une faqon similaire (SOLOMON, 1952). Aussi, le 86Rb+ est utilise comme traceur radioactif pour mesurer l’efflux d’electrdytes dans leserythrocytes traites par la thuringiolysine.
Arm d’etudier le mecanisme de la lyse erythrocytaire par la thuringiolysine, et les lesions membranaires provoquees par cette toxine, des erythrocytes de mouton (SEN) renfermant du 86Rb+ sont traites parla toxine. La fuite du 86Rb+ intracellulaire a ete mesuree en parallele avec celle de I’hemoglobine (Hb) selon le protocole decrit dans le chapi tre MATERIEL et METIIODES. Les cinetiques de fuite du 86Rb+ et de Hb intracellulaires sont identiques (Fig. 13). Au bout d’un meme temps de latence egal a 3 mn, le 86Rb+ et I’Hb soot liberes simultanement a une vitesse comparable. nsemblerait que les lesions provoquees par la thuringiolysine au niveau erythrocytaire perrnettent la fuite simultanee du 86Rb+ et de grosses molecules comme l’Hb, comme c’etait deja decrit pour la SLO (DUNCAN, 1974), et qu’un mecanisme osmotique collordal ne soit pas irnplique.
En effet, l’herndyse par certains agents lytiques comme la toxine a staphylococcique (MAOOFF et aI., 1964), le complement (HINGSON et aI., 1969),la streptolysine S (DUNCAN et MASON, 1976), se fait selon un mecanisme osmotique colloidal: la formation de petits trous dans la membrane abolit le systeme de transport actit, et la penetration d’ions et d’eau dans les cejlules sous I’effet DONNAN provoque leur gonflement pouvant aboutir Ii la lyse, et perte des constituants intracellulaires comme I’Hb. Les mdecules d’Hb e tant trop larges POUI passer Ii travers les lesions membranaires initialement formees, leur fuite se fait posterieurernent acelle des electrdytes comme le 86Rb ».
Les resultats obtenus dans le cas de la thuringidysine ne soot pas en faveur d’un tel mecanisme osmotique cdloidel.
La nature des lesions membranaires n’est pas cmnue et des observations directes en microscopic electronique nous manquent pour demontrer l’existence des structures en anneaux sur les membranes erythrocytaires traitees par la toxine, COllUDe c’etait le cas pour la SLO (DOURMASHKIN et ROSSE, 1966), et les autres toxines SH-dependantes apparentees Ii la SLO.

Table des matières

PREMIERE PARTIE PURIFICATION ET £TUDE DES PROPRI£T£S PHYSICO· CHIMIQUES, BIOLOGIQUES, IMMUNOLOGIQUES DE LA THURINGIOLYSlNE
MAT£RIEL ET M£THODES
I – SOUCHES BACT£RIENNES ET MlllEU DE CULJURE 
II – CONDITIONS DE PRODUCTION DE LA THURlNGIO· LYSINE .
Ill – DOSAGE DE L’ACTIVIT£ H£MOLYTIQUE 
111.1. Preparation de la SEN
m.2. Reactivation de la thuringiolysine
III3 .. Determination de la dose hemolytique 50% (DH 50)
IV – INHIBITION DE L’ACTIVITE H£MOLYTIQUE DE LA THURINGIOLYSINE 
IV.l. Effet des inhibiteurs de groupes sulfhydryls
IV.2. Effet du TLCK et du TPCK
IV.3. Effet des sterols
V – CIN£TIQUE D’H£MOLYSE -,
VI – ETUDE DE LA FUlTE DE RUBIDIUM INTRACELLULAlRE .
VI.1. Incorporation de 86 rubidium (86 Rb +) dans les erythrocytes
VL2. Mesure de la fuite du 86 Rb + . . • . . • . • . •
VII – PRE>ARATION DES STROMAS
VIII – RECHERCHE DES ACTIVIT£S ENZYMATIQUES
VIlLI. Activites proteasiques
VIII.2. Galeries Api-Zyrn
VIII.3. Activite phospholipasique
VIII.3.I. Les solutions
VIII.3 .2. Dosage de l’activite phospholipasique
IX – OOSAGE DES PROT£INES
X – TECHNIQUES CHROMATOGRAPHIQUES
X.l. Chromatographie d’affinite sur thiopropyl sepharose 6B .
X.2. Chromatographie par echange d’ions sur DEAE~ellulose
X.3. Chromatographie d’exclusion 29
XI – £L£CTROPHORESE SUR GEL DE POLYACRYLAMIDE-SDS . 
XI.I. Preparation du gel de polyacrylamide-Slxi
XI.2. Preparation des echantillons
XIA. Coloration du gel au bleu de Coomassie
XI.5. Coloration du gel au nitrate d’argent
XII – ISOELECTROFOCALISATION EN VEINE UQUIDE 
XIII – ANALYSE DE LA COMPOSITION EN ACIDES AMlNEs 
XIV – TESTS BIOLOGIQUES IN VIVO
XIV. 1. Tests de toxicite
XIV.2. Tests dermonecrotiques
XV – TECHNIQUES IMMUNOLOGIQUES
XV.1 . Preparation de serum antithuringiolysine
XV.!.!. Detoxification de la toxine
XV.1.2. Immunisation des lapins
XV.2. Les autres immunserums
XV3. Immunodiffusion..
XVA. Determination du titre neutralisant des imrnunserums
XV.5. Transfert de proteines sur filtre de nitrocellulose et reaction avec les anticorps (immuno-empreinte)
R.£SULTATS
I – PRODUCTION DE LA THURINGIOLYSINE 
1.1. Activites hemolytiques de differentes souches de B. thuringiensis
1.2. Mise en evidence de deux hemolysines differentes excretees par B. thuringiensis .
1.3. Effet de La concentration en glucose sur la production d’hemolysines  104. Etude de la toxinogenese
1.5. Activites enzymatiques dans Ie milieu de culture de B. thuringiensis
1.5.1. Mise en evidence d’activites enzymatiques par Ie systeme Api-Zym
1.5.2. Test al’azocoll .
1.5.3. Inhibition de l’activite proteasique .
II – PURIFICATION DE LA THURINGIOLYSINE . 
11.1. Concentration sur fibres creuses Amicon .
11.2. Colonne de thiopropyl sepharose 6B
11.3. Colonne de DEAE-eellulose
1104. Criteres de purete
1104.1. Electrophorese sur gel de polyacrylamide-SDS
1104.2. Immunodiffusion double sur gel d’agarose
11043. Acttvttes enzymatiques
11.5. Formes oxydee et reduite de La thuringiolysine
-8III- PROPRIf:T£s PHYSICO-elflMIQUES DE LA THURINGIOLYSINE
IIIJ. Poids moleculaire
III.2. Spectre d’absorption et constante optique
III 3 . Activite specifique
IlIA. Point isoelectrique (PI)  m.s. Composition en acides amines
I1I.6. Stabilite de la thuringiolysine
III.6J. Effet de la temperature
111.6.2. Effet du pH
IV – ACTNIT£S BIOLOGIQUES DE LA THURINGIOLYSlNE 
IV.I. Cinetique de la lyse erythrocytaire
IV.1J. Effet de la concentration en toxine sur la cinetique de lyse
IV.1.2. Effet de la temperature sur la cinetique de lyse.
IV.13. Etude de la fixation de la thuringiolysine sur les erythrocytes adifferentes temperatures
IV.2. Etude du mecanisme de la lyse erythrocytaire : fuite du 86Rb + intracellulaire
IV.3. Toxicite de la thuringiolysine
IVA. Effets dermonecrotiques
IV.5. Inhibition de I’activite.lytique de la thuringiolysine par les sterols
IV.6. Inhibition de l’activtte lytique par les bloquants des thiols
V – PROPRIf:T£S IMMUNOLOGIQUES ‘.’
V.I. Neutralisation de l’activite en milieu liquide
V.2. Immunodiffusion double en milieu gemfie
V.3. Imrnuno-empreinte
DEUXIEME PARTIE ETUDE Gf:Nf:TIQUE DE LA THURINGIOLYSlNE  MAT£RlEL ET M£THODES
IV – PWARATION DE PLASMIDES EN PETITE QUANTIT!:
V – PWARATION DE PLASMIDES EN GROSSE QUANTITf:
I – SOUCHES BACTf:ItIENNES
II – MIUEUX DE CULTURE
III – LES ADN
PAR LA Mf:THODE ALCALINE
PAR LA Mf:THODE AU PEG
VI – f:UCTROPHORESE D’ ADN SUR GEL D’ AGAROSE
VII – f:UCTRO£LUTION DE L’ ADN
VIII – MARQUAGE DE L’ ADN PAR TRANSLATION DE C »£SURE
IX – TRANSFERT SELON LA Mf:THODE DE SOUTHERN (1975) – HYBRIDATION ADN : ADN ..  » .
XI – SOUS-CLONAGE DES FRAGMENTS D’ ADN DE Bacillus thuringiensis
XLI. ligature
XI.2. CelluIts competentes
XL3. Transformation
XII – S£L£cTION ET CONSERVATION DES CLONES TRANSFORM£S
XIII – UTIUSATlON DE MINICELLULES DE E. coli
XlII.1. Preparation des minicellules
XlIL2. Incorporation de [3SS] Lrnethionine .
R£SULTATS
– CONSTRUCTION DE LA BANQUE DE Bacillus thuringiensis
II – TEST DE LA BANQUE: IDENTIFICATION DES COLONIES H£MOLYTIQUES
III – CARACT£RISTIQUES DE LA TOXINE «CLON!E»
III.1. Activite speciflque
111.2. Poids moleculaire
III 3 . Point isoelectrique
III.4. Cinetique de lyse
111.5. Effet du serum antithuringiolysine et des serums anti-Sl.O sur l’activite hemolytique de la toxine «clonee »
111.6. Inhibition de l’activite lytique par Ie cholesterol
111.7. Action du chlorure de mercure sur l’activite hemolytique .
IV – CARTE DE RESTRICTION
IV.1. Digestions simples
N.2. Digestions doubles
V – SOUS-eLONAGE
VI – POLYPEPTIDES SYNTH£TIS£S PAR LES MINICELLULES
VII – ETUDE DES STROMAS OBTENUS PAR LYSE ERYTHROCYTAIRE AVEC LA SOUCHE E. coli AR 1062.pMa
VIII – LOCALISATION CHROMOSOMIQUE DU’GENE 101
IX – HYBRIDATION DU GENE AVEC LES ADN DES BACTERIES PRODUISANT DES H£MOLYSINES APPARENTEES A LA SLO  »
DISCUSSION ET CONCLUSIONS
R£SUM£.
BIBLIOGRAPHIE 

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