Étude de la dynamique métabolique et épigénétique des cellules souches hématopoïétiques

L’utilisation des modèles en Biologie

   Avant d’aborder l’aspect strictement Biologique de mon travail de thèse, il m’a paru approprié d’entamer ce manuscrit par une courte réflexion sur l’utilisation des modèles en Biologie. Leur utilisation est aujourd’hui quasi-systématique dans ce domaine, et mes travaux n’échappent pas à la règle. J’y ai eu recours sous diverses formes, et cela se vérifie jusque dans le matériel biologique sur lequel j’ai conduit l’intégralité de mon travail expérimental, à savoir les cellules CD34+. En effet, ces cellules peuvent elles aussi être qualifiées de modèle. C’est donc la multitude de définitions attribuées à ce terme, couplée à l’utilisation presque inconsciente que j’en ai faite durant ces trois années, qui m’ont poussé à interroger cet outil conceptuel. D’un point de vue mathématique, un modèle est une “machine” logique qui permet de faire des déductions à partir d’hypothèses. Lorsque le modèle est correct et que les postulats sur lesquels il est bâtit sont approuvés, alors il est logique d’en accepter les conclusions qui en proviennent. Il reste néanmoins à questionner les hypothèses sur lesquelles le modèle a été construit. Si ces hypothèses sont basées sur des lois fondamentales de la physique par exemple, il est raisonnable de considérer le modèle comme prédictif. C’est le cas parce que l’on peut admettre que les lois dites “fondamentales” de la physique ont déjà été soumises à l’exercice de la réfutation. Leur validité est donc admise, au moins temporairement, car elles pourront toujours être réfutées dans le futur. S’il est encore possible de construire des modèles qui reposent sur des lois physiques au niveau atomique [2], [3], dès lors qu’on atteint l’échelle moléculaire cela devient pratiquement irréalisable. Selon Rosenberg (1985), seuls deux aspects de la Biologie peuvent prétendre au même statut que les lois fondamentales de la physique, à savoir : la théorie de la sélection naturelle et quelques principes généraux de biologie moléculaire dérivés des lois physiques elles-mêmes [4]. Selon lui, tout le reste n’est qu’études de cas, et bien que certaines similarités puissent apparaître, elles ne font pas état de lois universelles. Bien que cette hypothèse ait été formulée en 1985, il me semble que celle-ci reste valide aujourd’hui. Je me risque tout de même à inclure dans son deuxième point la stochasticité d’expression des gènes, c’est-à-dire l’expression aléatoire des gènes. En effet, ce phénomène s’est peu à peu imposé comme une caractéristique inhérente à la biologie moléculaire, et ce notamment du fait de développements technologiques qui ont permis de passer des mesures populationnelles aux mesures en cellule unique. Pour passer outre cet obstacle qui obligerait n’importe quel modèle biologique à dépendre exclusivement de lois fondamentales, les biologistes ont recours à la phénoménologie. Ce travail repose davantage sur une approche empirique. Même s’il s’appuie sur l’observation de régularités expérimentales, il s’inscrit tout de même dans une tentative d’abstraction du sujet d’étude. Cette approche ne se construisant plus sur la base de lois fondamentales, les modèles qui en découlent ne sont pas des simulations capables de caractériser l’évolution d’un système dans toutes ses latitudes et à tous temps. En revanche, bien que de la subjectivité ait inévitablement été introduite dans leur élaboration, de tels modèles ont tout de même un potentiel prédictif. Le pharmacologiste James Black ira jusqu’à dire que de tels modèles ne sont que « la description précise de notre pathétique conception de la nature » [5]. Dans les faits, cela signifie que ces modèles peuvent uniquement être utilisés pour tester les (pathétiques) hypothèses sur lesquels ils ont été élaborés. Comme le mentionne J. Gunawardena [6], la conception de modèle en Biologie repose alors sur la capacité des chercheurs à formuler une question spécifique, et ensuite de s’assurer que le modèle choisi repose sur des hypothèses (réfutables) qui permettent de répondre à cette question. A l’issue de mon travail de thèse, il sera donc indispensable d’interroger les résultats obtenus à travers le prisme du modèle construit en vue de répondre à la problématique. Plus important encore, les hypothèses sur lesquelles notre modèle s’appuie devront être réfutables, si l’on désire que les observations faites dépassent le statut « d’étude de cas ». Dans la pratique, le terme de modèle est largement employé en Biologie pour décrire des systèmes expérimentaux. Il s’agit certainement d’un dérivé des sciences Mathématiques/Physiques, où le modèle représente la mise en équation d’un phénomène. En Biologie, la traduction mathématique du phénomène à étudier est peu réalisable dans la majorité des cas. Cette « mise en équation » se réalise alors à travers l’utilisation de lignées cellulaires, d’organoïdes ou bien encore d’animaux qui permettent de recréer expérimentalement diverses caractéristiques (structurelles, microenvironnementales, pathologiques…etc) dans le but d’en extraire les régularités observables. Le choix de la « plateforme expérimentale », pour reprendre les termes de J. Honey, dépend alors de nombreux paramètres. Cette plateforme expérimentale doit nécessairement partager des caractéristiques pertinentes avec le sujet d’étude original, mais d’autres critères entrent en jeu : disponibilité, éthique, prix, mesurabilité des caractéristiques, pour n’en citer que quelques-uns. En assimilant ces « plateformes expérimentales » à des « exemples types », le défi consiste à déterminer jusqu’où les extrapolations peuvent être admises. A mon sens, un élément de réponse à cette problématique réside dans une tentative de description objective des similarités et dissimilarités de notre « modèle » avec l’objet d’étude original. Bien que cette description ne puisse pas être exhaustive, il est nécessaire d’identifier quelles sont les caractéristiques partagées indispensables à la validation des hypothèses émises. Inversement, il faut aussi rechercher d’éventuelles différences qui porteraient atteinte au modèle théorique sur lequel est basée l’étude scientifique.

Hématopoïèse primitive

   Chez l’humain, et plus généralement chez les mammifères, la première manifestation de l’hématopoïèse apparaît dans le sac vitellin (SV), lorsque les besoins en oxygène et en nutriments de l’embryon ne peuvent plus être assurés par la seule diffusion passive [7]. De cette hématopoïèse primitive, extra-embryonnaire, émergent des cellules mésodermiques qui s’agrègent et forment des « îlots sanguins » [8]. Chez l’humain, ces îlots sanguins apparaissent entre 16 et 18,5 jours postconception (jpc) (Fig. 3). Ces îlots sont essentiellement à l’origine d’érythrocytes nucléés primitifs, mais aussi plus occasionnellement de macrophages et de mégacaryocytes [9], [10]. Vers 21 jpc les cellules périphériques de ces îlots se différencient en cellules endothéliales, formant ainsi les premières structures du réseau de circulation sanguine embryonnaire. La coexistence et le développement concomitant de ces cellules endothéliales et des cellules sanguines primitives ont conduit plusieurs équipes à présager une origine commune [11], [12]. Introduite sous le nom d’hémangioblaste, cette hypothèse remonte aujourd’hui à près d’un siècle [13] et bien que plusieurs études aient apporté des preuves tout à fait convaincantes de leur existence in vitro [14], [15], leur présence in vivo est encore très débattue [16]. Par exemple, l’équipe de M. Kennedy et al. est parvenue à partir de cellules souches embryonnaires (CSE) humaines à générer des hémangioblastes capables de produire de manière clonale des cellules avec un potentiel hématopoïétique, ainsi que des cellules endothéliales au potentiel vasculaire [17]. Cependant, une étude impliquant des souris chimères générées à partir de quatre clones de CSE modifiées génétiquement pour exprimer des marqueurs fluorescents différents remet en cause ces observations in vitro [18]. En effet, les résultats montrent que les îlots sanguins sont composés de clones de cellules endothéliales ainsi que de clones de cellules hématopoïétiques, mais jamais ces deux lignées ne proviennent d’un seul et même clone bipotentiel. Cette conclusion, complétée par une autre étude qu’il a menée [19], a conduit S. Nishikawa à conclure que les hémangioblastes ne seraient finalement que des artefacts résultant des conditions de culture trop éloignées des conditions physiologiques [16].

Le microenvironnement des CSH adultes

   Comme évoqué à plusieurs reprises précédemment, le destin des cellules souches est influencé par l’environnement auquel elles sont exposées. Selon le stade de l’hématopoïèse considéré, cet environnement change, soumettant les cellules à de nouvelles interactions mais aussi à des conditions physico-chimiques différentes. Le concept de niche a ainsi été proposé en 1978 par R. Schofield [32] pour faire référence à une « unité régulatoire qui maintient et contrôle l’autorenouvellement et la différenciation des cellules souches hématopoïétiques in vivo ». Si les niches étaient assez peu étudiées avant les années 2000, ces dix dernières années ont vu le nombre de travaux s’y rapportant exploser [33]. Cela s’explique notamment parce que leur étude permet d’apporter des éléments de réponse à l’hétérogénéité moléculaire, une propriété qui s’est peu à peu révélée être invariable dans les populations de cellules souches. Ces niches sont spatialement structurées par d’autres types cellulaires avec lesquelles les cellules souches vont interagir (Fig. 4). Ces interactions sont multiples et complexes et peuvent être d’ordre direct ou indirect (par l’intermédiaire de molécules solubles). De plus, du fait qu’il s’agisse d’un espace structuré, la nature de ces interactions peut changer selon où elles ont lieu précisément dans la niche. Dans la moelle osseuse, il apparaît ainsi qu’il y aurait des emplacements propres à chaque type de progéniteurs générés [34]. Des études montrent même que les CSH sont directement régulées par leur descendance au sein de la niche [33], [34]. Sans que tous les mécanismes soient clairement élucidés, il semblerait que les macrophages [35], [36], les mégacaryocytes [37], [38], les lymphocytes T [39], [40] et les cellules neutrophiles [41], [42] jouent toutes un rôle dans la rétention, la mobilisation, la survie et la quiescence des CSH dans la moelle osseuse.

L’hématopoïèse et le mythe de Sisyphe : un processus condamné à être  réinterprété ?

   Après ce qu’il vient d’être écrit, il paraît pertinent de souligner que la description de l’hématopoïèse, avec comme but principal la caractérisation de l’origine et du comportement des CSH, fait face à plusieurs écueils. En se bâtissant sur des concepts hiérarchiques, tels que les arbres de différenciation proposés par A. Pappenheim et CS. Minot un siècle plus tôt, la description de l’hématopoïèse n’a finalement que très peu dévié des premières esquisses. Aujourd’hui, l’hématopoïèse est toujours représentée sous la forme d’un arbre, avec la cellule souche au sommet et les différentes branches qui en émanent représentent les lignages sanguins. Bien que quelques modèles légèrement différents aient été proposés, l’écrasante majorité supposent que les cellules perdent peu à peu, et de manière irréversible, leur potentiel de différenciation au fur et à mesure de leur spécialisation (Fig. 6A). La réalité expérimentale est bien plus troublée que ce schéma organisé et séquentiel, qui n’est en réalité que la résultante d’une construction historique. Les multiples contraintes intrinsèques à son étude font de l’hématopoïèse un processus qui est paradoxalement l’un des plus étudiés de la Biologie, mais aussi l’un de ceux qui est le plus souvent réactualisé [44]. Par exemple, plusieurs travaux récents envisagent l’existence d’une population de cellules immunitaires (macrophages et cellules lymphoïdes innées) qui ne serait pas dérivée des CSH-LT [45], [46]. Idem, l’origine des lymphocytes B-1a est aujourd’hui questionnée du fait de l’incapacité des CSH-LT à régénérer cette sous-population lorsqu’elles sont greffées dans des récipients murins irradiés [47], [48]. Dès lors que le cadre conceptuel dans lequel les recherches sont effectuées n’est pas redessiné, on peut alors se demander si l’hématopoïèse n’est pas condamnée, à la manière du rocher de Sisyphe, à être éternellement redéfinie ? D’un point de vue développemental d’abord, il faut souligner que les premières CSH apparaissent quelques jours après le démarrage de l’activité cardiaque. Ce faisant, les premières cellules sanguines circulent librement dans le fœtus, compliquant ainsi leur suivi et la caractérisation de leur origine première. Pour parer à cela, le recours à des modèles d’embryons murins sans activité cardiaque ni circulation sanguine a parfois pu être utilisé pour tester le potentiel de certains tissus comme le placenta à générer des CSH de manière autonome [49]. Mais ce modèle murin implique la mort prématurée des embryons, révélant ainsi les conditions non-physiologiques d’un tel modèle. Les conclusions faites sur les caractéristiques des cellules qui en sont issues demeurent donc sujettes à débat. Des techniques plus récentes étudient l’aspect clonal de l’hématopoïèse in vivo en combinant les technologies de séquençage haut débit en cellule unique et l’identification àl‘aide de « codes-barres moléculaires ». Cependant ces méthodes n’en sont encore qu’à leurs débuts, et plusieurs défis techniques doivent être encore résolus pour que les interprétations qui en résultent ne soient plus brouillées [50]. On peut par exemple mentionner les travaux très prometteurs de K. Frieda et al. [51], qui permettent de détecter les « codes-barres moléculaires » grâce à la méthode d’hybridation in situ en fluorescence. De même, les nouvelles technologies permettant d’associer l’information spatiale de la cellule analysée avec les données moléculaires (protéiques [52] ou transcriptomiques [53]) pourront sans doute contribuer à lever certaines zones d’ombre. Ensuite, d’un point de vue expérimental, l’étude de l’hématopoïèse se heurte à deux principaux obstacles. Le premier concerne le protocole standard de transplantation cellulaire dans des modèles murins immunodéficients. En effet, cette méthode ne fournit des informations que sur le potentiel des cellules injectées, et non pas sur leur véritable comportement in vivo. D’une part parce que le réceptacle dans lequel elles vont proliférer (murin) est différent de leur environnement naturel (humain), et donc les signaux auxquels elles sont soumises sont différents. D’autre part parce que les techniques qui permettent d’extraire les cellules d’intérêt de leur environnement in vivo impliquent souvent plusieurs étapes qui ont un impact sur la viabilité des cellules. Un tel stress a très certainement un effet non négligeable sur le comportement des cellules après purification. Le second obstacle, d’ailleurs souvent additionné au premier, réside dans la description moléculaire qui est faite des cellules souches hématopoïétiques. En effet, en considérant les populations cellulaires comme des entités définies par des combinaisons restreintes de leurs protéines membranaires, ces populations sont vouées à être constamment redéfinies, et leur nombre voué à croître indéfiniment. Ce point fait d’ailleurs écho à un débat de longue date en Biologie, à savoir la question de l’appartenance des cellules souches aux catégories d’entité ou d’état [54]. Cet aspect sera détaillé plus tard dans l’introduction, lorsque les enjeux conceptuels de ces travaux seront abordés. Enfin, les nouveaux modes de régulations cellulaires et moléculaires sans cesse découverts dans les niches (Fig. 4) implique que le modèle déterministe, censé pouvoir rendre compte de toutes ces interactions, se complexifie potentiellement à l’infini. Une autre vision s’est alors développée, prônant au contraire une organisation plus flexible (Fig. 6C). Pour reprendre les termes de T. Krieger et B. Simons, « il s’agit cette fois de considérer les cellules souches comme un ensemble dynamique et hétérogène dans lequel les cellules fluctuent réversiblement entre des états de survie et de différenciation variables » [55]. Dans cette hypothèse, la variabilité d’expression des cellules souches n’est plus une conséquence, ou un bruit, contre lequel les cellules doivent lutter pour maintenir certaines voies indispensables. Au contraire, cette hétérogénéité serait alors la caractéristique fondamentale qui définit la population des cellules souches. Cette vision suppose que c’est justement cette hétérogénéité qui est permise par l’ensemble des interactions qu’ont les cellules souches avec leur niche. La différenciation passerait alors par la levée de ces interactions, facilitant ainsi la « dérive » des cellules vers un lignage. Cela peut survenir à la suite d’une division spatialement contrainte [56], dépendre de la localisation des cellules au sein de la niche (périphérique ou centrale) [57], ou bien tout simplement se manifester au hasard du déplacement des cellules. Des facteurs de différenciation, présents hors de la niche, vont alors venir stabiliser un des différents états vers lesquels la cellule souche a pu dériver.

Table des matières

INTRODUCTION
L’hématopoïèse comme modèle expérimental
L’utilisation des modèles en Biologie
Historique de l’établissement de l’hématopoïèse en tant que modèle d’étude
Origine de la cellule souche
Théorie de la différenciation
Caractérisation phénotypique et moléculaire du modèle d’étude
Une transition conceptuelle
Les caractéristiques in vivo de l’hématopoïèse
Hématopoïèse primitive
Hématopoïèse définitive
Le site primaire
Les sites secondaires
Le microenvironnement des CSH adultes
L’hématopoïèse et le mythe de Sisyphe : un processus condamné à être réinterprété ?
Les caractéristiques du modèle in vitro
Les cellules CD34+ de cordon ombilical
Le milieu de « pré-stimulation »
Les enjeux de l’étude de la différenciation cellulaire
Les enjeux conceptuels
La remise en question du modèle déterministe
Cellule souche : entité ou état
Les théories alternatives
Les enjeux thérapeutiques
Connais ton ennemi : cerner le caractère souche pour pouvoir agir dessus
Connais-toi toi-même : cerner le caractère souche pour pouvoir agir dessus
Etude de la dynamique : encadrement et implication
Dynamique du dialogue métabolisme-épigénétique
Le remaniement métabolique
La glycolyse
La phosphorylation oxydative
Métabolites sentinelles et carrefours métaboliques
Le rôle moteur du switch métabolique dans l’engagement cellulaire
Réorganisation spatiale de la chromatine
Le nucléosome
Les différents états de condensation de la chromatine
Les boucles CTCF
Modifications chimiques du matériel génétique
Modifications post-traductionnelles des histones
Méthylation de l’ADN
Dynamique transcriptionnelle et traductionnelle
Les facteurs de transcription
Les mécanismes d’action
Les réseaux de régulation
Les marqueurs de surface
Le CD34
Le CD90
Le CD133
Présentation de la problématique
RESULTATS
Article 1 : étude cinétique des changements morphologiques des cellules CD34+ humaines issues de sang de cordon à l’échelle de la cellule unique
Problématique et démarche expérimentale
Résumé des résultats expérimentaux
Analyse transcriptomique
Analyse morphologique
Analyse croisée
Résumé des conclusions
Présentation de l’article 1
Article 2 : étude couplée de la cinétique d’accessibilité chromatinienne et de la stabilisation transcriptionnelle dans les cellules CD34+ humaines issues de sang de cordon ombilical
Problématique et démarche expérimentale
Résumé des résultats expérimentaux
Analyse transcriptomique
Analyse chromatinienne
Analyse croisée
Résumé des conclusions
Présentation de l’article 2
Résultats préliminaires : étude des effets de la perturbation métabolique sur l’engagement des cellules CD34+ humaines issues de sang de cordon ombilical
Problématique et démarche expérimentale
Résultats
Détermination de la CL50
Observation de la dynamique de prolifération en microscopie time-lapse
Caractérisation phénotypique en cytométrie de flux
Le marqueur générationnel (CTV)
Les marqueurs de surface CD34 et CD133
Ajout d’alpha-cétoglutarate
Evaluation de la réorientation métabolique en spectrométrie de masse
Résumé des conclusions
Matériel et méthode
Culture cellulaire
Microscopie time-lapse
Cytométrie en flux
Spectrométrie de masse
DISCUSSION
Confrontation du modèle théorique avec les données expérimentales
Le rôle moteur du métabolisme
La contrainte épigénétique
Orientation phénotypique

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