ETUDE DE LA DETECTION D’HELICOBACTER PYLORI DANS LA CAVITE BUCCALE

Pathogénicité

     Les propriétés d’H. pylori permettant l’infection sont maintenant divisées en facteurs de colonisation et en facteurs de pathogénicité. Les facteurs de colonisation comprennent : la production de l’uréase par l’H. pylori, la mobilité, la microaérophilie et les facteurs d’adhésion comme les récepteurs bactériens. Une fois l’H. pylori dans l’estomac, son uréase lui sert à produire de l’ammoniac qui va tamponner l’environnement autour de la bactérie (Matisko, 1995). La morphologie et les flagelles d’H. pylori lui permettent ensuite de se déplacer dans le mucus et des adhésines lui permettent d’adhérer aux cellules sur un récepteur cellulaire de nature glycolipidique ou autre (Mégraud, 2000). Les facteurs de pathogénicité d’H. pylori ne sont pas encore élucidés. Mais on sait maintenant qu’au niveau de la cellule épithéliale, l’ammoniac libéré par la réaction de l’urée stomacale avec l’uréase de l’H. pylori au contact des cellules peut être cytotoxique. De même, la lysolécithine et l’alcool déshydrogénase sont produites par l’hydrolyse de la lécithine des membranes cellulaires à l’aide de la phospholipase de l’H. pylori. En présence d’un excès d’éthanol, il y a la production de l’acétaldéhyde. Tous ces métabolites sont cytotoxiques. Il existe d’autres facteurs de pathogénicité pas très bien connus et qui font l’objet de plusieurs études actuellement comme la cytotoxine Vac A codé par un gène de l’H. pylori, le Vac A et l’ilôt de pathogénicité Cag (ensemble d’environ 40 gènes d’H. pylori). H. pylori interagit également avec le mucus qui devient moins épais, moins hydrophobe, alors qu’au niveau de la lamina propria les antigènes diffusibles d’H.pylori vont avoir un rôle sur le chimiotactisme et l’activation des monocytes et macrophages induisant une inflammation (Mégraud et Broutet., 2000).

La sérologie

      La recherche des anticorps sériques spécifiques à H. pylori est la méthode la plus utilisée (Elisa de type IgG) et permet le diagnostic d’infection à H. pylori avec une sensibilité et une spécificité de l’ordre de 85 à 95% (Gosciniak et al, 1993; Megraud et Broutet, 2000; Hisada et al, 2001). Elle est intéressante parce qu’elle permet de diagnostiquer plusieurs personnes, rapidement et à coûts réduits. De plus, elle a l’avantage de ne pas être trop invasive en comparaison à la biopsie par endoscopie (Li et al, 1996; Samuels et al, 2000). Elle est la méthode la plus recommandée pour un test initial non seulement parce qu’elle est non-invasive mais aussi parce qu’elle est précise, à coût réduit et est reproductible. La sérologie est la technique la plus indiquée pour les études épidémiologiques, surtout la trousse utilisant des antigènes purifiés reconnus pour leur sensibilité et leur spécificité.

Le test respiratoire à l’urée marquée ou « urea breath tests C-13 »

     Ce test est basé sur l’hydrolyse de l’urée marquée rendue possible par la quantité d’uréase produite par H. pylori. Une hydrolyse rapide produit du CO2 marqué qui est absorbé puis transmis aux poumons et rejeté par expiration. On se base donc sur la détection des métabolites et l’hydrolyse de l’urée dans la respiration. Ce test permet une estimation semi-quantitative de l’infection. La spécificité et la sensibilité de ce test sont proches de 95% (Vandenplas et al, 1992). L’innocuité de ce test permet de le répéter à volonté et donc de l’utiliser pour le dépistage et le suivi des sujets infectés après traitement. Il permet en effet de confirmer l’éradication du germe ou, au contraire la persistance de l’infection, et d’éviter ainsi une endoscopie de contrôle qui est invasive (Logan et al, 1998).

L’amplification génique

     L’amplification génique permet de mettre en évidence des fragments d’ADN d’H. pylori directement sur du matériel biologique tel que biopsie gastrique, liquide gastrique, plaque dentaire, salive ou selles (Labigne et al, 1994). Cette méthode est connue pour sa rapidité, sa sensibilité et sa possibilité de mettre en évidence toutes les formes d’H. pylori, y compris les formes coccoïdes non cultivables ou les bactéries mortes. La tendance actuelle est telle qu’on ne devrait plus se fier à un seul test pour faire le diagnostic d’H. pylori mais plutôt à la combinaison de 2 tests si cela est possible (Vaira et al., 2000). Le choix des tests dépend des conditions cliniques et des moyens disponibles dans le milieu.

Choix des paires d’amorces pour H. pylori

     Après une revue de la littérature, notre choix s’est porté sur la paire d’amorce JW23/22 (7,9) : Forward : 5’-GAG CGC GTA GGC GGG ATA GTC-3’ correspondant aux nucléotides 536 à 556 et Reverse : 5’-CGT TAG CTG CAT Etude de la détection d’Helicobacter pylori dans la cavité buccale TAC TGG AGA-3’ correspondant aux nucléotides 830 à 810 de GenBank numéro U01330. Les paires d’amorce ont été « blastées » sur PubMed pour évaluer leur spécificité dans la détection du gène 16S rRNA d’H. pylori. Les paires d’amorce ont été « designées » par Proligo® Primers & Probes, Paris, France. A partir des échantillons d’ADN des différents prélèvements cliniques et de la souche de référence d’H. pylori ainsi que les paires d’amorce « designées », nous passons à l’étape de détection d’H. pylori dans les différents prélèvements.
Préparation du Mix-PCR : Les capillaires du LightCycler® les plus fréquemment utilisés sont ceux de 20µl dans lesquels 5µl sont réservés à la solution d’ADN extrait, et 15µl au MixPCR (Eau, MgCl2, paires d’amorce et Mix-Taq). Nous travaillerons avec le kit LightCycler FastStart DNA MasterPLUS SYBR Green I de chez Roche® Diagnostics GmbH (Germany). Nous commençons par décongeler le tube 1b (Reaction Mix) tout en le protégeant de la lumière. Nous centrifugeons très brièvement le tube 1a (Enzyme) et en prélevons 14µl qui seront injectés dans le tube 1b : nous mélangeons très doucement ce Master Mix par aspiration/refoulement (ne jamais vortexer). Nous conservons cette solution de Master Mix à +4°C pendant une semaine (valable pour 32 réactions). Au sein des 15µl de Mix-PCR, le MgCl2 doit être à une concentration finale de 4mM, le volume de MgCl2 sera de 2,4 µl. La concentration de la paire d’amorce est entre 0,5 et 1mM avec un volume de 2 µl par amorce. 2µl de Master-Mix suffisent bien que le fabriquant en préconise 4µl. Le reste du volume sera complété par de l’eau pure stérile (qsp).

Table des matières

INTRODUCTION
PREMIERE PARTIE : REVUE DE LA LITTERATURE
CHAPITRE I : CARACTERISTIQUES D’HLICOBACTER PYLORI
1- CARACTERISTIQUES D’HELICOBACTER PYLORI
2- HELICOBACTER PYLORI DANS L’ULCERE GASTRODUODENAL
CHAPITRE II : HELICOBACTER PYLORI DANS L’ULCERE GASTRIQUE
2.1- PATHOGENESE DE L’INFECTION A HELICOBACTER PYLORI
2.1.1 PATHOGENICITE
2.1.2 REACTIONS LOCALES ET IMMUNITAIRES
2.2- DIAGNOSTIC DE L’INFECTION A HELICOBACTER PYLORI
2.2.1 LES METHODES NON INVASIVES
2.2.1.1 La sérologie
2.2.1.2 Le test respiratoire à l’urée marquée ou « urea breath tests C-13 »
2.2.2 LES METHODES INVASIVES
2.2.2.1 Endoscopie et biopsie
2.2.2.2 Le test rapide à l’urée
2.2.2.3 L’amplification génique
2.2.2.4 Examen bactériologique
2.3- PRISE EN CHARGE DE L’INFECTION A HELICOBACTER PYLORI
2.3.1 TRAITEMENT
2.3.2 ÉRADICATION
2.3.3 CONTROLE DE L’ERADICATION
* Ulcère duodénal
* Ulcère gastroduodénal
CHAPITRE III : HELICOBACTER PYLORI DANS LES PRELEVEMENTS BUCCAUX
3 – HELICOBACTER PYLORI DANS LES PRELEVEMENTS BUCCAUX
1- DETECTION D’H. PYLORI DANS LES PRELEVEMENTS ORAUX DE SUJETS SAINS
DEUXIEME PARTIE : TRAVAUX EXPERIMENTAUX
CHAPITRE I : DETECTION D’ HELICOBACTER PYLORI DANS LES PRELEVEMENTS ORAUX DE SUJETS SAINS
1.1- INTRODUCTION
1.2- MATERIEL ET METHODE
1.2.1 TYPE D’ETUDE
1.2.2 CADRE D’ETUDE
1.2.3 POPULATION D’ETUDE
1.2.4 CRITERES DE SELECTION
1.2.4.1 Age
1.2.4.2 Symptomatologies gastriques
1.2.4.3 Statut parodontal
1.2.4.4 Prise de médicaments
1.2.4.5 Consentement éclairé
1.2.5 DEROULEMENT DE L’ETUDE
1.2.5.1 Prélèvement des échantillons cliniques
1.2.5.2 Choix de la souche de référence d’Helicobacter pylori
1.2.5.3 Extraction rapide de l’ADN bactérien
1.2.5.4 Choix des paires d’amorces pour H. pylori
1.3- RESULTATS
1.4- DISCUSSION
1.5- CONCLUSION
CHAPITRE II : COMPARAISON DE QUATRE PAIRES D’AMORCES DIFFERENTES DANS LES BIOPSIES GASTRIQUES ET LES PRELEVEMENTS ORAUX
2.1- JUSTIFICATION ET INTERET
2.2- MATERIEL ET METHODE
2.2.1 SUJETS ET ECHANTILLONS CLINIQUES
2.2.1.1 Recueil des prélèvements
2.2.1.2 Prélèvements buccaux
2.2.1.3 Biopsies gastriques
2.2.2 SOUCHES DE REFERENCE D’H. PYLORI
2.2.2.1 Souches de laboratoire
2.2.2.2 Souches cliniques
2.2.3 EXTRACTION D’ADN
2.2.4 CHOIX DES PAIRES D’AMORCE
2.2.4.1 Vérification de la spécificité des paires d’amorce
2.2.4.2 Analyse de la sensibilité
2.2.5 ANALYSE PCR EN TEMPS REEL
2.3- RESULTATS
2.3.1- ANALYSE DE LA SPECIFICITE DES PAIRES D’AMORCES
2.3.2 ANALYSE DE LA SENSIBILITE DES PAIRES D’AMORCES
2.4- DISCUSSION
2.5 CONCLUSION
CHAPITRE III : DIFFERENTES FLORES BACTERIENNES POUR DIFFERENTES ENTITES DE LA MALADIE PARODONTALE
3.1- JUSTIFICATION ET INTERET
3.2 MICROBIOLOGIE DES DIFFERENTES ENTITES DE LA MALADIE PARODONTALE
3.2.1 GINGIVITES
3.2.1.1 Gingivite gravidique
3.2.1.2 Gingivite chronique
3.2.2 PARODONTITE CHRONIQUE (PC)
3.2.3 PARODONTITE AGRESSIVE
3.2.4 SYNDROME DE DOWN (TABLEAU V)
3.2.5 PATHOLOGIES PARODONTALES NECROTIQUES
3.3 SPECIFICITE BACTERIENNE DES DIFFERENTES ENTITES DE LA MALADIE PARODONTALE : DOUTES ET CERTITUDES
A. actinomycetemcomitans
4.1 JUSTIFICATION ET INTERET
CHAPITRE IV : COMPARAISON DES RESULTATS MICROBIOLOGIQUES DU DEBRIDEMENT DE LA POCHE PARODONTALE PAR LE SYSTEME ULTRASONIQUE VERSUS INSTRUMENTATION MANUELLE PAR LA PCR EN TEMPS REEL
4.2 MATERIEL ET METHODE
4.2.1 TYPE D’ETUDE
4.2.2 POPULATION D’ETUDE
4.2.3 DONNEES CLINIQUES
4.2.4 PROCEDURES THERAPEUTIQUES
4.2.5 ECHANTILLON
4.2.6 PROCEDURES MICROBIOLOGIQUES
4.2.6.1 Souches bactériennes
4.2.6.2. Extraction de l’ADN
4.2.6.3 Conception des paires d’amorce
4.2.6.3 PCR en temps réel
4.2.7 ANALYSE STATISTIQUE
4.3 RESULTATS
4.3.1 RESULTATS CLINIQUES
4.3.2 RESULTATS MICROBIOLOGIQUES
4.3.2.1 Comptes bactériens totaux
4.4 DISCUSSION
4.5 CONCLUSION
CHAPITRE V : PREVALENCE D’ HELICOBACTER PYLORI DETECTE PAR PCR EN TEMPS REEL DANS LA PLAQUE DENTAIRE SOUS-GINGIVALE DE SUJETS ATTEINTS DE PARODONTITE CHRONIQUE
5.1 JUSTIFICATION ET INTERET
5.2 MATERIEL ET METHODE
5.2.1 PATIENTS ET ECHANTILLONNAGE
5.2.2 EXTRACTION DE L’ADN
5.2.3 CHOIX DES PAIRES D’AMORCE
5.2.4 DETECTION DE L’ADN
5.2.4.1 Préparation du Mix-PCR
5.2.4.2 Préparation des capillaires pour la détection de l’ADN
5.2.4.3 Programmation du LightCycler 2.0
5.2.5 ANALYSE STATISTIQUE
5.3 RESULTATS
5.4 DISCUSSION
5.5 CONCLUSION
TROISIEME PARTIE : EXPOSE ANALYTIQUE
3 EXPOSE ANALYTIQUE
4 CONCLUSION GENERALE ET PERSPECTIVES
BIBLIOGRAPHIE
ANNEXES

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