Etude de la corrélation entre la commutation LEF – CEF et la transition des antennes

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Formation de NADPH et ATP

La ferrédoxine, protéine soluble hydrophile à centre fer-soufre, va donc être réduite et va pouvoir à son tour distribuer les électrons à un complexe du stroma, la ferrédoxine-NADP+ réductase (FNR) (figure 8). Finalement, l’électron arrive sur le NADP+, qui avec la consommation d’électrons et de protons, donne lieu à la production de NADPH, selon la formule suivante, qui avec l’énergie lumineuse donne : 2e- + 2H+ + NADP+ NADPH + H+. Il est notamment montré que le pool de NADPH est un donneur d’électron dans plusieurs processus métaboliques (Godde and Trebst 1980).
Ce transport d’électrons génère une différence de potentiel électrochimique transmembranaire de protons. Cette force proton-motrice est utilisée pour le fonctionnement de l’ATP synthase, complexe enzymatique intra-membranaire responsable de la synthèse d’ATP.
Selon les données structurales de l’ATP synthase (Abrahams, Leslie et al. 1994) qui présente une symétrie rotationnelle, les changements conformationnels dans chacun des trois hétérodimères αβ induits par la rotation de l’unité catalytique β, permet par une rotation de 360° de ce dernier la production de trois molécules d’ATP.
Certains complexes impliqués dans le transfert des électrons dans la chaîne participent au pompage de protons. En effet, à chaque réaction d’électrons peut être associée un pompage de proton, dont les mécanismes de translocations diffèrent en fonction des complexes.
Sachant que pour une rotation de 360°, 14 protons sont nécessaires, alors 4,7 protons sont nécessaires pour la synthèse d’une molécule d’ATP, ainsi que 6 protons transférés de part et d’autre de la membrane pour la formation d’une molécule de NADPH.
Selon une estimation du nombre de protons transférés par un électron, le flux d’électron linéaire allant de l’eau au NADP+, permet le transfert transmembranaire de douze protons correspondant alors à la formation de 2,55 ATP pour deux NADPH.
Pour finir, la production d’ATP et de NADPH sont utilisées pour le fonctionnement du cycle de Benson-Calvin qui aboutit à la fixation de molécule de carbone. Il a été montré que la métabolisation d’une molécule de dioxyde de carbone requiert au total trois ATP et deux NADPH (Calvin. 1962). Selon ces calculs il est donc montré qu’avec uniquement le fonctionnement du transfert d’électrons en mode linéaire, il y a un déficit en ATP par rapport au NADPH qui doit être compensé par un autre mécanisme capable de produire de l’ATP avec ou sans consommation de NADPH.
Il est possible d’invoquer la respiration mitochondriale : celles-ci présentes dans l’organisme peuvent consommer le NADPH et l’oxygène, permettant ainsi la production d’ATP, selon la formule, NADH + O2 NAD+ + H2O + ATP. Une autre hypothèse est que les électrons suivent un autre type de transfert, dit cyclique, comme le montre la figure 14, présentée dans la partie suivante, qui résume les deux types de transferts d’électron et leurs applications.

Flux d’électrons cyclique

De nombreuses discussions dans la littérature se penchent sur la question de savoir si le ratio ATP / NADPH généré par le transfert d’électrons linéaire satisfait la fixation du carbone, pour une revue sur le sujet voir (Allen. 2002). Ce qui est certain c’est que ce déficit pourrait être comblé par la respiration puisque les mitochondries sont impliquées dans de nombreux échanges redox entre ces derniers et les chloroplastes. Celles-ci permettent de fournir de l’énergie au(x) chloroplaste(s) par le transport des électrons respiratoire dans les mitochondries (Marcel, Hoefnagela et al. 1998). Cependant, il est également possible de produire de l’ATP sans production de NADPH, selon un transfert d’électrons cyclique dans lequel les électrons produits par la séparation de charge reviennent au donneur primaire ; ce retour étant associé à un transfert de protons. Ce flux cyclique a été établi dans les conditions anaérobiques, par Arnon et al. où ils montrent la production d’ATP sous illumination d’un système composé exclusivement de PSI et de complexe cyt b6f, (Arnon, Whatley et al. 1955). Dont la participation de la ferrédoxine à ce transfert d’électron est montrée plus tard par Tagava & al. (Tagawa, Tsujimoto et al. 1963).

Etudes du processus métabolique

Au-delà d’une modification des états redox des complexes protéiques composant la chaîne photosynthétique, il se développe un propre état métabolique dans les conditions de variation de l’oxygène. L’inhibition de la respiration mitochondriale comme dans les conditions anaérobiques, amène la dégradation d’amidon (Gfeller and Gibbs 1984), mais aussi des lipides, dont la destruction produirait la majorité du NAD(P)H, dans les cellules, quand celles-ci sont altérées dans d’autres réserves majeures, comme l’amidon et l’acétate (Johnson and Alric 2012). Cela en vue, de répondre aux privations en nutriments externes, que les cellules rencontrent dans un environnement qui serait parfois considéré comme hostile à tout organisme vivant.
Beaucoup de voies métaboliques, comme le montre la figure ci-dessus, sont opérationnelles chez les algues dans les conditions d’anaérobiose (Atteia, van Lis et al. 2006 ; Grossman, Croft et al. 2007 ; Terashima, Specht et al. 2010 ; Grossman, Catalanotti et al. 2011 ; Atteia, van Lis et al. 2013), dont découle l’induction d’un assortiment d’enzymes spécifiques. Ces nombreuses études ont apportés des données quantitatives ainsi que des informations sur la localisation chloroplastique ou mitochondriale des protéines.
Chez Chlamydomonas, la plus importante gamme de chemin métabolique a été identifiée comme étant celle dépendant de la formation du pyruvate (Hemschemeier and Happe 2005 ; Dubini, Mus et al. 2009). De plus, d’autres analyses biochimiques ont démontré qu’à cette voie, se rajoute les produits fermentatifs majeurs tels que le formate, l’acétate et l’éthanol, formés en parallèle avec l’hydrogène (Gfeller and Gibbs 1984 ; Ohta. 1987).
Ce qui ressort à ce niveau de la discussion, c’est que l’implication de nombreuses enzymes intervenant dans la chaîne photosynthétique et les chemins métaboliques pouvant être empruntés par les électrons semblent dépendre fortement des conditions oxygéniques dans la cellule. Qu’il existe deux modes de transferts et que les acteurs y participant sont, pour l’essentiel, les mêmes, mais qu’il existe tout de même une hétérogénéité dans leurs distributions à travers les membranes thylacoïdales. L’implication de deux types de transferts différents par les complexes majeurs {PSII-Cyt b6f -PSI} pour le linéaire et {Cyt b6f-PSI} pour le cyclique, et cela dans un contexte de localisations différentes amène à penser qu’il doit exister une structuration entre les différents complexes, capable d’optimiser le rendement d’efficacité des deux modes de transports des électrons, en limitant les interférences entre les deux modes de fonctionnement.
Des données fonctionnelles et chimiques vont dans ce sens, en établissant la formation de supercomplexes dans lesquels tous les acteurs du transfert cyclique se retrouveraient.

Formation des supercomplexes

Les deux types de transferts des électrons à travers les complexes de la chaîne photosynthétique sont maintenant bien établis. Et l’hétérogénéité de localisation de ces différents complexes aussi. Cette ségrégation suggère la possibilité de regroupements entre les différents complexes impliqués dans l’un ou l’autre des transferts d’électrons permettant l’augmentation de l’efficacité de la chaîne photosynthétique à fixer et métaboliser les molécules de carbone, par le cycle de Benson-Calvin. Ces regroupements se traduiraient par la formation de supercomplexes, comme le schématise la figure 18, dans lesquels seraient localisés les acteurs du CEF, comme le Photosystème I, ces antennes associées LHCI (bâtonnets verts), le cytochrome b6f (en violet) et la Fd-NADPH oxydoréductase (FNR, en gris), mais aussi des antennes mobiles LHCII phosphorylées provenant des Photosystèmes II (en orange). L’intervention des deux transporteurs d’électrons, tels que la ferrédoxine et la plastocyanine (en bleu) est vitale pour la réinjection des électrons et l’efficacité du CEF dans les composants regroupés du supercomplexe.
De plus, on retrouve dans ces supercomplexes des composants additionnels présents du côté stromal proche du PSI, dont l’absence diminue l’efficacité du CEF, soit : PGR 5 (Proton Gradient Regulation) (Munekage, Hojo et al. 2002), PGRL 1 (Proton Gradient Regulation Like 1) (DalCorso, Pesaresi et al. 2008), en interaction avec PGR 5 et la Fd. Les protéines CAS (Ca2+ -Sensor Protein) et ANR 1 (Anaerobic Response Protein 1) sont aussi trouvées dans les supercomplexes. La sous-expression de ces deux protéines n’a cependant pas d’impact fort sur le CEF, ce qui suggère une possible stratégie d’adaptation dans le transfert d’électrons cyclique, pour compenser ces pertes dans ces complexes, et permettre un CEF tout de même efficace (Terashima, Petroutsos et al. 2012).
Cette formation s’appuie également sur des données biochimiques permettant la déduction de l’intervention de ces protéines dans la structuration des supercomplexes.

Analyse fonctionnelle

Ces supercomplexes ont pu être isolés et identifiés chez le type sauvage de Chlamydomonas reinhardtii, contenant le Photosystème I, ces propres antennes LCHI, les LHCII, le cyt b6f, la FNR et PGRL 1 mais pas PGR 5 (Iwai, Takizawa et al. 2010). L’isolation de ces supercomplexes a été faite dans les conditions anoxiques et ils sont absents dans les conditions oxiques, suggérant que le transfert d’électrons cyclique intervient de façon plus importante dans les conditions anoxiques, qui nécessite alors une restructuration dans la membrane à travers le regroupement des acteurs inclus dans le CEF.
Sur cette base, il est proposé que la formation de ces CEF-supercomplexes soit contrôlée par les niveaux en concentration d’ATP dans le système. Lorsque celle-ci est basse, le regroupement des complexes en supercomplexes serait commandé afin de favoriser le transfert d’électrons cyclique et donc la synthèse d’ATP par le pompage de protons à travers la membrane. Cet événement aurait donc lieu dans les conditions anoxiques, où la demande en ATP est forte de part l’arrêt de la synthèse d’ATP mitochondriale. Et inversement, une forte concentration en ATP induirait la dissociation des supercomplexes, augmentant la fraction de PSI disponible pour le transfert d’électrons linéaire (Joliot and Joliot. 2002).
Leur étude fonctionnelle in vitro, après leur isolation, a été menée et montrerait une activité compatible avec le transfert d’électrons entre les deux complexes majeurs, le PSI et le cytochrome b6f, après l’ajout des deux transporteurs : la Fd et la PC (Iwai, Takizawa et al. 2010 ; Terashima, Petroutsos et al. 2012). Cette partie sera discutée ultérieurement dans un paragraphe, puisque l’étude in vitro, dans le cadre d’une collaboration à fait l’objet d’une partie de ma thèse.
Ces deux derniers paragraphes montrent que de nombreux processus mécanistiques ont lieu à travers les membranes thylacoïdales. Ces processus font intervenir les flux d’électrons passant par les différents complexes composant la chaîne photosynthétique et cela selon deux modes de transfert : le linéaire et le cyclique, utilisant donc les mêmes acteurs moléculaires pour leur fonctionnement. Il est légitime de se demander par quels paramètres deux transferts différents peuvent coexister à partir des mêmes entités ?

Migration des antennes mobiles collectrices de lumière (LHC II)

Commutation entres les flux d’électrons linéaire et cyclique

La problématique soulevée ci-dessus peut être posée en d’autres termes, à savoir quels sont les paramètres qui président à l’implication de l’un quelconque de ces acteurs dans l’un ou l’autre de ces deux modes de fonctionnement.
A cette étape de réflexion il est intéressant de soulever le fait que la ségrégation des deux Photosystèmes discutée précédemment, présente un intérêt du point de vue de la régulation des deux types de transferts d’électron. Ce point est discuté dans l’article de Albertson, P. (Albertson. 2001).
Cette dernière remarque suggère l’hypothèse d’une structuration, comme il l’a déjà été spécifié, qui permettrait d’isoler certains des maillons de ces deux chaînes, comme par la formation des supercomplexes. Ces différents maillons, regroupant les différents acteurs impliqués dans les transferts linéaire et cyclique, constitueraient des entités séparées permettant le fonctionnement prédominant selon l’un des deux modes. La question est maintenant de savoir, par le ou lesquels paramètre(s) cette commutation serait contrôlée.

Les transitions d’état

Les systèmes LHC (Light Harvesting Complex) qui sont les antennes collectrices de photons, présents autour des deux Photosystèmes, ont été décrits précédemment. Des rapports portent sur l’étude des changements de fluorescence des antennes LHC lors de modifications des conditions environnementales, comme l’utilisation de lumière de différente couleur, permettant l’excitation préférentielle de l’un des deux Photosystèmes (Bonaventura and Myers 1969).
L’idée de deux états différents et d’une transition entre ces deux états est lancée. Appelé état 1 et état 2, ils expliqueraient les variations de fluorescence observées précédemment selon des conditions où l’un des deux Photosystèmes est excité préférentiellement, (Murata. 1969 ; Delepaire and Wollman. 1985). L’observation des changements spectraux de fluorescence à basse température, sous les lumières spécifiques de l’excitation du PSI ou du PSI, (Murata. 1969), traduit le transfert d’excitation entres les deux systèmes pigmentaires, permettant ainsi aux organismes photosynthétiques d’utiliser efficacement l’énergie lumineuse absorbée.
En d’autres termes, lorsque le PSII est plus fortement excité que ne l’est le Photosystème I, une partie des antennes du PSII migrent vers le PSI, cette situation est nommée état 2. Inversement, lorsque le PSI est plus fortement excité que ne l’est le Photosystème II, les antennes LHCII associées au PSI migrent vers le PSII, appelé état 1. Ces déplacements des antennes vers l’un des Photosystèmes entraînent l’augmentation de sa section efficace de capture permettant donc de rééquilibrer les flux excitoniques au niveau des deux Photosystèmes, (Delosme, Olive et al. 1996). Chez l’algue verte Chlamydomonas reinhardtii, l’étude de la distribution de l’énergie lumineuse entre les deux Photosystèmes dans les deux états, par Delosme, R et ses collègues, a conduit à évaluer à environ 80 % la quantité de LHCII capables de se déplacer vers le Photosystème I, le reste des antennes restant fixé aux PSII (Delosme, Olive et al. 1996).
C’est un peu plus tard que le mécanisme de cette migration d’antennes a été trouvé. Cela correspond à l’identification des LHCII-Kinases, dont les mutants altérés sur les gènes codant pour certaines kinases, comme le gène stt7, montrent des souches affectées dans les transitions d’état. C’est par l’étude des données de fluorescence à froid 77 K, des cellules stt7 mutantes sous les deux conditions redox (oxydée et réduite) que l’observation de leur blocage à l’état 1 est faite. C’est-à-dire que les antennes LHCII, chez un mutant stt7, restent connectées aux Photosystèmes II (Fleischmann, Ravanel et al. 1999), sans aucune migration vers les régions membranaires où sont localisés les Photosystèmes I. Chez un type sauvage de Chlamydomonas reinhardtii, après phosphorylation de sous-unités spécifiques des protéines LHCII par la LHCII-Kinase, ces dernières sont détachées du Photosystème II par une répulsion électrostatique due à l’augmentation des charges négatives à la surface des membranes thylacoïdales empilées, du côté stromal (Baker, Harbinson et al. 2007) créant un déplacement de ces antennes hors des membranes accolées vers les membranes non accolées. Permettant ainsi, en d’autres termes, leurs déplacements des régions où sont principalement localisés les Photosystèmes II aux régions où sont exclusivement situés les PSI.
Cela traduit donc la transition réversible de l’état 1 vers l’état 2 liée à deux activités antagonistes. La phosphatase qui peut déphosphoryler les antennes et la LHCII-kinase qui contrôle de façon importante cette transition et qui peut être stoppée par la mutation du gène stt7 (Fleischmann, Ravanel et al. 1999). En effet, les phosphatases sont actives constitutivement, tandis que le gène stt7 peut être activé ou inactivé.
Il est intéressant de noter que les supercomplexes formés par {PSI-LHCI} sont plus larges chez l’algue verte Chlamydomonas reinhardtii, que dans les plantes supérieures (Germano, Yakushevska et al. 2002 ; Kargul, Nield et al. 2003). Le fait que Chlamydomonas possède neuf gènes Lhca alors que les plantes supérieures en ont seulement 4 ou 5 (Drop, Webber-Birungi et al. 2011) explique cette différence de taille.
L’étude des agents transporteurs d’électrons, oxydants et réducteurs de la chaîne photosynthétique sur l’activité de la kinase a été investie. L’étude de sa capacité de phosphorylation des antennes mobiles LHCII, a permis de mettre en évidence le déclencheur de cette transition d’état. Par différentes expériences, comme la fluorescence et avec différents inhibiteurs, comme le DBMIB, et en surveillant l’activation de la protéine kinase thylacoïdale, Allen, J.F et ses collaborateurs, ont situé l’élément redox de la chaîne de transport des électrons après le PSII et avant le complexe cytochrome b6f, déduisant alors que le plus sérieux candidat est la plastoquinone (Allen, Steinback et al. 1981).

Conditions d’études

Il est possible de placer la souche dans un état déterminé en contrôlant son milieu (aérobiose ou anaérobiose). L’utilisation de glucose/glucose-oxydase permet la condition anaérobique : la glucose-oxydase est une enzyme qui oxyde le glucose avec l’aide d’oxygène. Les conditions anaérobiques sont donc obtenues par une concentration de 20 mM de glucose et 2 mg/ml de glucose oxydase (type II, à partir d’Aspergillus Niger), ainsi que 50 UE de catalase. L’échantillon à étudier est ensuite placé dans une cuve étanche adaptée à l’appareil de spectroscopie : le JTS-10.

Techniques Physiques

Utilisation du JTS-10 (Joliot Type Spectrometer)

Le fonctionnement de la chaîne photosynthétique peut être évalué en utilisant la spectroscopie d’absorption résolue en temps. Cette technique permet de suivre les cinétiques de variations d’absorption associées aux transferts d’électrons au sein des différents complexes et ainsi de caractériser leur fonction. Plus important, elle peut être appliquée in vivo.
Le JTS-10 présenté sur la figure 8 est un spectromètre de mesure de fluorescence et d’absorbance. L’excitation de l’échantillon et la détection par la lumière permettent de suivre le transfert des électrons dans les organismes photosynthétiques, à différentes longueurs d’ondes. Il devient donc possible de regarder spécifiquement tel mécanisme de tel complexe en changeant la longueur d’onde d’étude.

Champ électrique transmembranaire – 520 nm

Le transfert d’une charge à travers la membrane résulte en une variation de la densité de surface de charge des deux côtés de la couche lipidique et, en conséquence, en un changement dans l’amplitude du champ électrique transmembranaire.
La détection se fait par une source blanche avec l’utilisation d’un filtre interférentiel de 520 nm. Des filtres bleus BG-39-6 placés devant les détecteurs (mesure et référence, figure 8) pour rejeter la plupart de l’excitation due à la LED utilisée.
La mesure du champ électrique se fait par un flash laser qui n’induit qu’un seul électron par Photosystème. Pour la mesure de taille d’antenne, la détection se fait en lumière continue où l’on mesure la vitesse initiale du mécanisme.

Oxydation de P700 – (705 et 735) nm

L’oxydation du dimère de chlorophylle du PSI, nommé P700 est induite par l’illumination continue. Le programme superpose un pulse saturant de façon à déterminer la quantité totale de P700 photo-oxydable.
La détection se fait par une LED émettant dans la région des 700 nm avec l’utilisation d’un filtre interférentiel de 705 nm. Des filtres RG 695-6 sont placés devant les détecteurs pour rejeter la plupart de l’excitation due à la LED utilisée.
Le programme utilise la méthode dite de ‘’pulse of dark’’ qui permet d’annuler la contribution potentielle de la lumière excitatrice quand cette dernière est trop proche en longueur d’onde de la lumière de détection pour être annulée par les filtres classiques.
Pour les mesures d’oxydo-réduction de P700 , l’absorbance en 705 nm est corrigée des contributions des autres composants de la chaîne photosynthétique, et cela par la soustraction de l’absorbance à 735 nm.

Casser les cellules

S’ensuit l’étape où les cellules sont cassées par French Press, veillant avant d’ajouter aux échantillons 100 mM (concentration finale) de PMSF et 10 mM (concentration finale) de NaF.
Le PMSF et le NaF sont des inhibiteurs de protéase, qui empêchent toute activité protéolytique après que les cellules soient cassées.
Les membranes et débris cellulaires sont récupérés dans la solution HEPES 1.

Flottaison des membranes

Les cellules cassées et récoltées dans l’HEPES 1 sont centrifugées (15344 RCF, 20 minutes, 4 °C) afin de re-suspendre le culot dans 50 ml d’HEPES 2.
Ensuite ce volume est séparé en deux, et mit dans des tubes d’ultracentrifugation (SW31), auquel s’ajoute 6 ml d’HEPES 3 et les tubes sont complétés avec 7 ml D’HEPES 4.
Cette étape vise à séparer les membranes thylacoïdales intactes, qui se présentera dans la solution HEPES 3, des débris cellulaires restant dans la région HEPES 2, après centrifugation (SW31, 106750 RCF, 1 heure, 4 °C).
Les membranes thylacoïdales ainsi séparées sont transférées dans l’HEPES 5, qui va permettre de laver ces dernières du sucrose présent dans les échantillons. Elles sont de nouveau centrifugées (15344 RCF, 20 minutes, 4 °C).

Quantité de chlorophylle

Pour pouvoir déterminer le volume à solubiliser selon la concentration de chlorophylle de chaque échantillon, nous devons déterminer cette dernière.
Pour cela chaque culot récupéré après la dernière étape de centrifugation et diluer 1000 fois dans l’acétone à 80 % et nous mesurons l’absorption de l’échantillon sous trois longueurs d’ondes. La mesure de la concentration de chlorophylle (en mg de Chl par ml) peut être calculée selon l’équation suivante, [Chl a + b] = 17.76*(Abs [646.6]-Abs [770]) + 7.34*(Abs [663.6]-Abs [770]). Celle-ci est ajustée à une concentration de 1,6 mg de Chl / ml.
J’ai préparé une solution de TDM (10 %) diluée avec la solution d’HEPES 5 (utilisée pendant la dernière étape d’isolation des MT) pour une concentration initiale de 1,7 %. Enfin, procédant à une dilution « volume pour volume », nous obtenons les concentrations finales de 800 µg de Chl / ml pour 0,85 % de TDM.

Solubilisation des membranes thylacoïdales

La solubilisation des membranes par le détergent a lieu en même temps que la dilution. L’échantillon lors de sa solubilisation est gardé dans la glace et agité délicatement toutes les cinq minutes pendant 20 minutes.

Dépôts des membranes isolées sur les gradients de sucrose

Puis 400 µg de chlorophylle est déposée sur chaque gradient de sucrose. Les tubes sont ensuite installés sur le rotor (SW41Ti) et ultra-centrifugés (247606 RCF, 24 heures, 4 °C).
Les tubes de gradients de sucrose pourront alors être fractionnés et les fractions spécifiquement étudiées in vitro.

Etudes in vitro – spectrophotomètre

Nous préparons, dans un premier temps un tampon contenant tous les éléments nécessaires à l’étude in vitro de la bande CEF -supercomplexe soit {0,005 % TDM, 2 mM MgCl2, 1 mM d’ascorbate, 30 mM NaCl et 30 mM de Tricine pH 8,2}. Nous diluons avec ce tampon les bandes PSI et CEF-supercomplexes afin d’obtenir la concentration finale de 20 µg Chl/ml dans l’échantillon.

Précision sur l’étude

Lors de notre premier essaie d’étude avec le tampon décrit ci-dessus, les cinétiques de flash montraient une différence de quantité de P700 photo-oxydé avec et sans {Tricine – NaCl}. Avec, la quantité était inférieur qu’en présence du tampon {Tricine – NaCl}. Nous avons alors déclenché les cinétiques par les flashs, en attendant une minute entre chaque détection sur le même échantillon dans notre tampon et en présence de ferrédoxine.
Il s’est alors avéré qu’après chaque minute que nous attendions, non seulement nous retrouvions la quantité initiale de P700 photo-oxydé mais également nous observions une diminution forte de l’amplitude de la réduction de P700 à l’obscurité (pour détail voir chapitre 3).

Etude ‘’physiologique’’ des algues

Les études présentées dans cette partie (paragraphe 1 et 2) sont issues d’expériences indépendantes.

Temps de re-suspension

Nous avons souhaité tester l’influence de la durée de re-suspension des algues, après avoir été mises à l’obscurité, sur la vitesse cyclique observée dans les conditions anoxiques.
La stratégie consiste à diluer les algues et à les partagées dans des volumes égaux et de même concentration dans différents erlens. Les cellules sont ensuite agitées à l’obscurité en attendant les différents temps d’étude.

Table des matières

I La photosynthèse : outil énergétique
II Organisme : Chlamydomonas reinhardtii
III Le chloroplaste
1 Complexes photo-réactionnels et leurs complexes pigmentaires associés
2 Le flux d’électron : une implication de divers complexes
IV Transfert d’électrons : deux types
1 Flux d’électron linéaire
1.1 Le Photosystème II
1.2 Vers le complexe cytochrome b6f
1.3 Vers le Photosystème I
1.4 Formation de NADPH et ATP
1.5 Production d’O2
2 Flux d’électron cyclique
2.1 Réinjection des électrons
V Changements métaboliques dans le système
1 Conditions oxiques
2 Conditions anoxiques
2.1 Limitation côté accepteur du PSI
2.2 Etudes du processus métabolique
VI Formation des supercomplexes
1 Analyse moléculaire
2 Analyse fonctionnelle
VII Migration des antennes mobiles collectrices de lumière (LHC II)
1 Commutation entres les flux d’électrons linéaire et cyclique
2 Les transitions d’état
PROBLEMATIQUE
Etude de la corrélation entre la commutation LEF – CEF et la transition des antennes
Et contradictions bibliographiques
I Etudes de corrélation transitions d’antennes – CEF
1 Descriptions des résultats
II Constats expérimentaux – Discussion
III Constats contradictoires théoriques
1 Migration d’antenne chez les plantes
1.1 Transfert d’électron cyclique chez les plantes
2 CEF à l’état 1 chez Chlamydomonas reinhardtii
MATERIELS ET METHODES
I Mutants
1 Chapitre 1
1.1 Mutant stt7-9
1.2 Mutant ptox2
1.3 Nos études des deux mutants – Publication
2 Chapitre 2
2.1 Mutants d’hydrogénase
II Inhibiteurs
1 Le glycol aldéhyde
III Techniques de culture de Chlamydomonas reinhardtii
1 Souches et conditions de cultures
2 Préparation des échantillons – Etudes biophysiques
2.1 Inhibiteurs
2.2 Conditions d’études
IV Techniques Physiques
1 Utilisation du JTS-10 (Joliot Type Spectrometer)
2 Champ électrique transmembranaire – 520 nm
2.1 Programmes
3 Oxydation de P700 – (705 et 735) nm
3.1 Programme
V Techniques biochimiques
1 Gradient de sucrose
2 Solutions tampons – étapes précédents l’isolation des membranes
2.1 Préparation des solutions tampons
2.2 Cultures de l’algue verte
2.3 Etudes en conditions anoxiques
3 Isolation des membranes thylacoïdales
3.1 Préparation
3.2 Casser les cellules
3.3 Flottaison des membranes…
3.4 Quantité de chlorophylle
3.5 Solubilisation des membranes thylacoïdales
3.6 Dépôts des membranes isolées sur les gradients de sucrose
4 Etudes in vitro – spectrophotomètre
4.1 Précision sur l’étude
VI Etude ‘’physiologique’’ des algues
1 Temps de re-suspension
2 Adaptation à l’obscurité ou à la lumière
3 Etude de la concentration des cellules – test de croissance
CHAPITRE 1 : COMMUTATION CEF INDEPENDANTE DES TRANSITIONS DES ANTENNES
Mesures Biophysique et Etudes Biochimique.
I Objectifs
1 Souches utilisées
II Méthodes physiques et résultats graphiques
1 Vitesse photochimique – Mesure à 520 nm
2 Oxydation du dimère de chlorophylle, P700 du PSI – Mesure à (705 et 735) nm
3 Vitesse d’électron cyclique
III Conditions expérimentales
1 Conditions oxiques
2 Conditions anoxiques
IV Résultats cycliques
V Intérêt biochimique
CHAPITRE 2 : ETUDE ANOXIQUE
Partie 1 – Etude de la recombinaison de charge
I La recombinaison de charge – Introduction bibliographique
II Observations de la recombinaison de charge
1 Variations d’absorptions
1.1 Selon l’oxydation de P700
1.2 Selon les mesures ECS
2 Conditions d’études anoxiques
3 forte réduction de P700 en début d’anoxie – Caractérisation
III Etudes de la recombinaison de charge
1 Processus de fermentation
1.1 Introduction de l’étude de la voie de fermentation pour la ré-oxydation du NADPH
1.2 Mutant fermentatif – Analyses spectroscopiques
2 Synthèse d’ATP – Contrôle de l’oxydation par l’application de la lumière
2.1 Utilisation de l’ATP synthétisé pour la ré-oxydation du pool de NADPH
2.1.1 Application de la lumière – Méthode
2.1.2 Souche mutante d’ATP synthase à la lumière
2.2 Implication d’une nouvelle voie métabolique
2.2.1 Nouveau transporteur, accepteur d’électron – l’hydrogénase
2.2.2 Application de la lumière – Mutant d’hydrogénase
2.3 Etude du temps d’oxydation de P700 dans les conditions anoxiques, sous illumination
3 Retour sur l’évolution spontanée d’oxydation photo-induite, des cellules à l’obscurité
3.1 Mutant d’ATP synthase – Analyses spectroscopiques
3.2 Etude du rôle de l’hydrogénase – Mutant
3.2.1 Induction de la protéine
3.2.2 Inhibition de l’hydrogénase – Cyclohéximide
3.2.3 Mutant d’hydrogénase – Analyses spectroscopiques
4 Cycle de Benson-Calvin
4.1 Etude de la Rubisco
4.2 Analyses spectroscopiques – Mutant Rubisco ΔRbcL 1-7.5
4.2.1 Evolution d’oxydation P700 photo-induite spontanée
IV Conclusion – Suppression de la limitation côté accepteur du PSI
CHAPITRE 3 : ETUDE ANOXIQUE
Partie 2 – Etude moléculaire et fonctionnelle des Supercomplexes
I Rappel de la problématique
II études précédentes – Supercomplexes
1 Description moléculaire
2 Etudes fonctionnelles in vitro
III Protocole biochimique
IV Etudes des supercomplexes – vérification moléculaire
1 Gradient de sucrose
2 Western blots
V Etude des supercomplexes – vérification fonctionnelle
1 Fluorescence à froid – 77 K
2 Etude de flash – Mesures à 705 nm
3 Etude en lumière continue – Mesures à 705 nm
4 Etude en lumière continue du Cyt b6f
4.1 Spectre de la plastocyanine –Etude
VI Conclusion
1 La chaîne mitochondriale
DISCUSSION
I CEF-transition d’état
1 Mécanisme de commutation vers le mode cyclique
2 Mesures du transfert d’électron cyclique
2.1 Méthode dite de la pente
2.2 Application de pulses intermédiaires – oxydation de P700
2.3 Autres résultats – Etude bibliographique
3 Etude des mutants sans antennes LHCII
4 Migration d’antenne chez Chlamydomonas reinhardtii
4.1 Etude de la migration d’antenne
4.2 LHC II libres ?
4.2.1 Antennes quenchées – études bibliographiques
II Etude anoxique – Recombinaison de charge
1 Inhibition du transfert d’électron cyclique
2 Influence de la lumière sur le mutant ATP synthase – précédent bibliographique —
III Supercomplexes
1 Co-migration ? – Activité ?
1.1 Transfert d’électron cyclique au sein du CEF-supercomplexe
2 Mutants de diffusion des transporteurs d’électron – formation des CEFsupercomplexes
2.1 Mutant T26 – Limitation de la diffusion entre PC et PSI
2.2 Mutant PsaC – Limitation de la diffusion entre PSI et Fd
2.2.1 Analyses spectroscopiques – Résultats préliminaires
3 Imagerie-supercomplexes
REFERENCES

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