Étude dans un modèle dystrophique : utilisation du muscle mdx comme producteur de protéine transgénique sécretée TNFR-Is/mIgG1

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Modification de la capside AAV

Il est possible d’exploiter la diversité des sérotypes AAV pour transduire plus efficacement. Le sérotype AAV rh32.33, provenant comme son nom l’indique du macaque rhesus, a par exemple démontré une prévalence rare chez l’homme insia qu’une capacité à transduire le muscle et très peu les autres organes [68]. Cependant il est difficile de trouver des variants naturels ayant toutes les caractéristiques voulues pour en faire le vecteur idéal pour une application donnée. Des approches visant à modifier la capside AAV pour mieux cibler la population cellulaire d’intérêt ont donc été développées. L’altération de la capside virale permet la modification du tropisme, mais peut également rendre le vecteur plus « furtif » face au système immunitaire, et éviter la mise en place systématique de protocoles immunosuppresseurs. Il existe actuellement deux méthodes : les conjugués bispécifiques, et la modification génétique de la capside.
L’utilisation de molécules adaptatrices bispécifiques,c’est-à-dire se liant à la fois au virus et au récepteur cellulaire, permet d’altérer la capside indirectement. Cela revient à « décorer » le virus avec des molécules plus ou moins affines pour sa capside et la cible (fig. 13). La capside de certains vecteurs peu efficaces comme l’AAV3b peut être modifiée pour acquérir une nouvelle propriété en y fixant des peptides ou molécules. L’AAV3b auquel est fixé de l’héparine est ainsi capable de se lier aurécepteur FGF-R2, qui se dimérise et est endocyté avec le vecteur. Ce récepteur de facteur ed croissance est aussi connu pour transloquer vers le noyau. La nouvelle propriété obtenue par cet AAV3b modifié lui confère une meilleure capacité de transduction (Présentatio orale de Emily Messina au congrès ASGT 2007). Cette approche permet de nombreuses combinaisons mais en pratique il peut être difficile de l’adapter à la production de vecteurs à grande échelle, et le système présente souvent une certaine instabilitéin vivo. L’AAV de gauche est un vecteur « classique » pseudo-typé avec une capside de sérotype 6 et possédant un génome recombinant à ITR2. L’AAV du milieu correspond à un vecteur AAV2 décoré avec un molécule adaptatrice bispécifique. Le vecteur AAV chimérique de droite a été produit à partir de séquencecap modifiée comme nous allons le voir ci-après.
La modification génétique de la capsideest réalisée par l’insertion de peptides aléatoires ou de ligands connus dans la séquence des gènes cap, parallèlement à la mutation du motif natif de liaison du récepteur. La premièredémonstration de cette approche pour « recibler » un vecteur AAV2 a été décrite par Girod et coll. en 1999, qui ont identifié un site de la protéine VP3 (aa 587) tolérant l’insertion d’un peptide [69]. Cela a ouvert la voie à la création d’AAV chimériques, par introduction ou susbstitution d’une région provenant d’un parvovirus donné vers un AAV cible, ce qui lui confère une nouvelle propriété. A plus large échelle il est également devenu possible avec le développement des techniques de criblage à haut débit de combiner cette approche aux techniques de mutagénèse ou « d’évolution » dirigée de la capside AAV. Les mutants créés sontlorsa criblés in vitro (ou in vivo) pour une ou plusieurs propriétés, comme le niveau de transduction d’une lignée donnée, ou la résistance à l’inhibition par les anticorps neutralisants. Cela peut être réalisé de deux façons : i) soit le criblage est utilisé pour sélectionner esd ligands d’intérêt avant de créer l’AAV mutant, ii) soit une multitude de mutants AAV est générée puis criblée contre une cible
d’intérêt. La première approche peut être réaliséepar exemple en utilisant la technologie du phage display pour identifier in vitro des interactions protéiques entre ligands peptidiques aléatoires et cellules d’intérêt. Puis les ligandssélectionnés sont utilisés pour créer des AAV chimériques. Cette approche où le ligand est déterminé par phage display est essentiellement empirique, car rien ne peut assurer le fonctionnement attendu du peptide sélectionné une fois inséré dans le contexte de la capside AAV [70, 71].
La seconde approche (DNA shuffling) propose donc de générer aléatoirement des mutations ponctuelles ou des insertions peptidiques de la capside virale dans le site VP3 identifié en 1999, puis de cribler à haut débit les mutants pour sélectionner les vecteurs d’intérêt. Le groupe d’Oliver Müller a par exemple généré une librairie peptidique aléatoire de la capside AAV9, et a conféré de cette manière un tropisme cardiaque à un mutant de l’AAV2 [72]. Le groupe de Mark Kay réalise des AAV chimères entre différents sérotypes, et les crible pour leur efficacité de transduction sur une lignée hépatocytaire humaine en présence d’anticorps neutralisants. Ils ont identifié un mutant intéressant contenant des séquences provenant des sérotypes 2, 8 et 9 et ayant conservé la capacitéedlier l’héparine [73].
Le groupe de Hildegard Büning, qui travaille également sur la mutagénèse du motif de liaison aux HSPG de la capside de l’AAV2, s’est intéressé à la relation entre le tropisme des mutants AAV2 obtenus et la charge des peptides insérés. Ilsobservent que certains mutants obtenus par insertion de peptides de charge nette négative gagnent la capacité d’infecter des cellules indépendamment des HSPG (également négatif), ce quise traduit in vivo par un « déciblage » du foie et de la rate [74]. Les peptides cationiques à l’inverse favorisent l’infection via les HSPG, mais l’entrée dans la cellule est alors indépendante des clathrines et l’export nucléaire s’en trouve réduit. Il semble donc possible d’annuler ou de conférer un tropisme d’ordre électrostatique à des mutants, mais ceux-ci peuvent alors infecter par une voie d’endocytose différente du virus sauvage.
Enfin, différentes approches visant à s’affranchir du système immun ont été tentées, le but étant de « nettoyer » la capside des antigènes induisant une réponse anticorps neutralisante, ou l’activation de la réponse T mémoire chez l’homme. Des mutants aux épitopes immunogéniques modifiés ont donc été générés. L’étude de Huttner et coll. montre ainsi que certains mutants de capside perdent jusqu’à 70 % d’ affinité pour les anticorps reconnaissant l’AAV2 sauvage [75].

Approches pharmacologiques et adjuvants

Différentes approches pharmacologiques permettent d’influencer la transduction de l’AAV. Ces drogues agissent durant le routage intracellulaire, ou plus en aval, sur le devenir des génomes viraux dans le noyau.
Suite à l’échappement endosomal la capside de l’AAV2 peut être phosphorylée par l’EGFR protein tyrosine kinase (EGFR-PTK). Cette phosphorylation constitue un signal d’ubiquitination, l’hypothèse est donc qu’elle favo rise la dégradation des particules par le protéasome au détriment de leur translocation versle noyau. L’utilisation d’inhibiteurs de EGFR-PTK ou d’inhibiteurs du protéasome augmente la transduction par l’AAV2 [76]. Des mutants remplaçant les 7 résidus tyrosine cible de EGFR-PTK par des phénylalanines sur la capside AAV2 ont été créés, et ils montrentin vivo une amélioration de la transduction du foie de la souris [77].
Les inhibiteurs du protéasome (comme le MG132), lesagents génotoxiques et l’hydroxyurée affectent la translocation cellulaire de l’AAV d’un e manière cellule- et sérotype-spécifique et augmentent sa transduction [78]. Cependant le mode d’action de ces composés est mal connu. L’équipe de Samulski a récemment montré que les inhibiteurs du protéasome peuvent augmenter la transduction in vitro par potentialisation de l’accumulation du vecteur dans le nucléole. De plus, l’hydroxyurée mobilise les capsides du nucléole vers le nucléoplasme où la décapsidation aurait lieu. Ces produits peuvent agir en synergie par deux voies indépendantes qu’il nomme voie d’accumulation, et voie de mobilis ation [33] (fig. 14).
L’hypothèse est que l’AAV a appris à exploiter les protéines nucléolaires pour s’y séquestrer dans un état stable. Et qu’à l’occasion de la disso ciation du nucléole les virions achèvent la transduction en libérant les génomes viraux dans lenucléoplasme. La dissociation du nucléole peut être déclenchée par la co-infection par un virus helper, la mitose ou encore un stress génotoxique. Ainsi l’utilisation d’agents génotoxiques comme l’hydroxyurée, et la modification de la localisation des protéines nucléolaires permet d’augmenter la transduction. Notons cependant qu’entre leurs mains l’effet des i nhibiteurs de protéasome n’est pas retrouvé dans le cas de la transduction du muscle (communication orale de Jarod Johnson au congrès ASGT 2007).
D’autres groupes montrent aussi qu’il est possible de moduler le devenir des génomes viraux à travers certaines protéines intranucléaires. Ainsi, il est possible d’augmenter la transduction de l’AAV en inhibant les molécules MRe11 et Nbs1 qui sont impliquées dans le contrôle des ADN simple brin [40].
Il a également été montré que certains anti-retroviraux permettent l’augmentation de la transduction par l’AAV. C’est par exemple le cas de la zidovudine, un inhibiteur nucléosidique de la transcriptase inverse. Cet inhibiteur augmente la transduction de l’AAV in vitro, mais peut être aussi n vivo comme cela est souligné dans un essai clinique oùun patient suivant ce traitement montre la meilleure expression du transgène alors qu’il a reçu la plus faible dose AAV de l’essai par intramusculaire [79] .
Enfin d’autres approches dites adjuvantes ou co-facteurs, permettent l’augmentation de la transduction en agissant avant l’étape d’infection et d’internalisation de l’AAV. Ce sont principalement des agents perméabilisants et vasodilatateurs des vaisseaux, comme le VEGF (vascular endothelial growth factor), l’histamine o u la papavérine. L’injection du VEGF permet par exemple d’améliorer le profil de transduction musculaire de souris par l’AAV6, cependant son action n’est efficace qu’avec des tit res faibles de vecteur [80].

Transduction à l’échelle du corps entier

Plusieurs études de biodistribution comparant les différents sérotypes AAV lors d’une injection systémique ont été menées. Une étude conséquente compare ainsi les sérotypes 1 à 9, et les classe en terme de niveaux et cinétique d’expression dans le corps entier de souris Balb/c mâles. Ceci est possible grâce au suivi de l ’expression du transgène luciférase sous le contrôle du promoteur CMV (ubiquitaire et fort), de manière non invasive à l’aide d’une caméra CCD (fig. 15). Conditions expérimentales : injection à la veine caudale de 1E11 vg d’AAV-CMV-Luc chez des souris Balb/c mâles. L’expression est visualisée 9 mois après l’injection. Adapté de Zincarelli et coll. [58].
Les sérotypes 2, 3, 4 et 5 forment un groupe d’expression faible, les AAV1, 6, et 8 ont une expression moyenne, et enfin les AAV 7 et 9 ont montré les plus forts niveaux d’expression (fig. 15). Concernant la cinétique d’apparition de la protéine transgénique, deux groupes se démarquent : les AAV à cinétique lente (2, 3, 4 et5), et ceux à cinétique rapide (1, 6, 7, 8 et 9). Cette approche permet aussi de distinguer le tropisme des différents sérotypes, par exemple le sérotype 9 montre la meilleure distribution, l’AAV4 est le plus efficace dans les poumons, alors que l’AAV6 transduit essentiellement le cœur, le foie et les muscles [58].
En 2004, le groupe de Chamberlain a montré pour la première fois dans le petit animal (souris saine ou dystrophique), qu’il est possible de transduire la majorité des muscles squelettiques après une seule injection par voie intraveineuse [80]. Pour ce faire, ils ont utilisé le sérotype 6 très efficace dans le muscle en combinaison avec un traitement au VEGF pour permettre au vecteur de passer plus efficacement l’endothelium vasculaire. Le traitement VEGF permet un gain de transduction dans le cœur et différents muscles, cependant l’effet semble baisser avec l’augmentation de la dose du vecteur. La figure 16A présente l’expression du transgène β-galactosidase dans une souris ainsi traitée ayant reçu 1.10 12 vg d’AAV6.
A) Transduction musculaire (β-galactisidase en bleu) 11 jours après une injection IV de 1.1012 vg d’AAV6-CMV-LacZ + 10 µg de VEGF chez des souris mâl es C57BL/10ScSn (B10) A gauche et au milieu : dissection du côté gauche selon le plan sagittal présentant l’extérieur et l’intérieur respectivement. A droite : photographie du thorax et de la patte avant gauche selon l’axe cranio- caudal. D’après Gregorovic et coll. [80]. B) Photographie du corps entier en fluorescence (face ventrale) 1 mois après l’injection IV de souris nouveaux-nés (veine temporale) avec 1.10 vg/g d’AAV-CB-GFP double brin. C) Photographie du corps entier en fluorescence (face ventrale) 4 mois après l’injection IV d’un hamster F1B de 6 semaines avec 8.1011 vg d’AAV8-CMV-GFP double-brin. D’après Wang et coll. [41].
Une autre étude aux résultats impressionnants montre la possibilité de transduire les muscles du corps entier par voie systémique sans utiliser de stratégie adjuvante, en exploitant la capacité naturelle du sérotype 8 à traverser efficacement l’endothelium vasculaire. Ils montrent ainsi que le nouveau-né est mieux transdui que la souris adulte par voie systémique (en intrapéritonéale : IP, et en IV). En effet, latransduction des muscles du corps entier est obtenue en injectant par IV 1.1011 vg/g d’AAV8-CB-GFP chez la souris nouveau-né de 3
jours. La figure 16B compare le sérotype 2 peu efficace au sérotype 8 ermettantp une expression de GFP (green fluorescent protein) visible en photographie en fluorescence sur le corps entier. Cependant la GFP n’est pas visible au niveau macroscopique dans le cas de la souris adulte injectée avec une dose proche de ce qui est administré aux nouveaux-nés (6.10 vg/g), même si au niveau microscopique l’expressionest trouvée dans tous les muscles et dans le cœur. En revanche, l’injection IV d’AAV8-CM V-GFP avec relativement moins de vecteur (1,3.1010 vg/g) et un autre promoteur constitutif (CMV) dans un hamster, permet une forte expression visible en fluorescence de manière macroscopique (fig. 16C). Le sérotype 8 ne transduit pas ou très peu les autres organes dans ces conditions (poumons, rate et cerveau), à l’exception du foie [41]. Ces bons résultats sont obtenus car ils combinent divers avantages en plus du sérotype adapté : les AAV utisésl ont également des génomes double-brin, et dans le cas des nouveaux-nés les fibres musculaires plus immatures se transduisent mieux. Dans cette étude, les auteurs ne constatent pas de modification de la transduction musculaire avec un traitement au VEGF dans le cas de l’injection IV d’AAV1, 6 ou 8 (1.10 12 vg). Cela peut être attribué au fait que l’effet disparait avec l’injection de fortes doses de vecteur.
La preuve de principe étant établi chez le petit animal, les essais ont débuté chez le gros animal. Les premiers tests chez le chien se sont avérés écevants,d avec des transductions minimales dues à de fortes réponses immunes cellulaires contre le transgène en l’absence d’immunosuppresseur [81]. Récemment, l’injection systémique du sérotype 9 a été évaluée chez des chiens nouveaux-nés, dont le système immunitaire est encore immature (1 à 2.10 11 vg/g soit une dose totale de 4 à 8.10 13 vg) [67]. Dans ce cas une expression a été détectédans de nombreux muscles de manière stable pendant les 6 mois de l’étude. De manière surprenante, le cœur des chiens était peu transduit , ce qui diffère du cardiotropisme de l’AAV9 observé chez la souris.
La majorité des études administrant des vecteurs AAV chez le primate non humain par voie systémique visent à transduire le foie, et montrent que l’existence d’une réponse humorale mémoire empêche la transduction par cette voie. Unmacaque de 2 à 4 kg sera par exemple injecté avec 1.10 vg/kg pour transduire le foie [82], soit un bolus d’environ 4.10 total. Ces études chez le primate non humain démontrent donc l’innocuité de l’AAV à des doses de vecteurs comparables à ce que nous venons de voir chez le chien.
L’ensemble de ces données montre la faisabilité de la transduction d’une musculature complète. Cela ouvre la voie aux traitements non plus localisés, mais globaux, pour des patients atteints de maladies neuromusculaires par exemple. Cependant, pour obtenir de tels résultats, de très grandes quantités de virus sontnécessaires, ce qui dépasse les capacités de la plupart des laboratoires.
Il est difficile d’extrapoler les doses qui seront nécessaires chez l’homme avec les données obtenues chez l’animal, mais voici tout de même une estimation à titre indicatif. Si on se base sur un rapport de masse alors il faut 3000 fois plus d’AAV pour l’homme que pour une souris (60kg/20g). Or les résultats chez la souris indiquent une dose nécessaire supérieure ou égale à 1.1012 vg pour transduire efficacement les muscles du corps entier. Cela nous donne une estimation de la quantité d’AAV nécessair au traitement d’un enfant atteint de DMD tournant autour de 1.1015 à 1.10 16 vg.
Pour produire cette quantité en transfection, si onse base sur une lignée cellulaire ayant un bon rendement de production avec environ 1.104 AAV/cellule (HEK-293 par exemple), il faut donc 1.1011 à 1.10 12 cellules pour le traitement d’un patient. Soit une surface de culture de 10 à 100 m 2, ou encore de 500 à 5000 flasques de 175 cm 2 (avec une densité finale de l’ordre de 1.106 cellules/cm2). N’oublions pas l’importance de l’étape de purification et le conditionnement qui déterminent la concentration finale du lot de vecteur. Si l’on prend comme exemple la tri-transfection il est courant d’obtenir des titres de l’ordre de 5.1011 vg/ml, on voit dès lors que 1.1015 à 1.10 16 vg correspondent à 2 à 20 litres ce qui excède lar gement le volume injectable chez un humain. Ces chiffres astronomiques montrent les limites de la production actuelle et la nécessité de développer esd méthodes de production ayant un rendement supérieur comme la culture en bioréacteuret la technologie baculovirus par exemple. Le développement de stratégies permettantd’obtenir des transductions fortes avec une moindre quantité de vecteur serait également utile.

Adjuvants modifiant la biodistribution du vecteur AAV

Évaluation in vitro de différents polymères chargés

Dans une première approche nous nous sommes focalisés sur l’aspect électrostatique des adjuvants dans le but de modifier la transduction du vecteur AAV. Les molécules que nous avons séléctionnées sont des monopolymères d’acidesaminés cationiques (de lysine ou d’arginine), ou encore un monopolymère anionique ARN simple brin : l’acide polyinosinique (pI). Par souci de simplicité les polymères cationiques seront nommés par la lettre p minuscule pour poly, suivie de la lettre du code d’acide aminé leur correspondant, par exemple pK pour la poly-L-lysine. Le tableau 2 résume les noms abrégés de ces différentes molécules ainsi que leur masse moléculaire et le degré de polymérisation moyen leur correspondant.MM (Da)
Les polymères étant constitués de distributions dechaînes de longueurs différentes, les masses moléculaires sont donc moyennes. MM : masse moléculaire en Dalton. Dp : degré de polymérisation calculé d’après la masse moléculaire moyenne. Ab :nom abrévié attribué à l’adjuvant. NC : non connu.
Le choix des composés chargés positivement est basésur le fait que l’infection de l’AAV2 est en partie dépendante d’interactions éléctrostatique bien décrites. En effet le domaine de liaison de l’AAV2 à son récepteur primaire HSPG (négatif) correspond à 5 résidus basiques (4 arginines et une lysine) de la protéine VP3 formant une zone positive à la surface de la capside [83]. De plus comme nous l’avons abordé, une grande partie de l’AAV injecté par la voie vasculaire est captée par le foie. Nous avons donc également étudié l’impact de l’acide polyinosinique connu pour sa capacité à inhiber les récepteurs scavengers des cellules présentatrices d’antigènes, et notamment des cellules de Küpffer qui sont les macrophages résidants du foie.
Dans un premier temps nous avons effectué des expériences de transduction in vitro sur la lignée permissive HEK-293 et sur la lignée hépatique HepG2, en présence de quantités croissantes de ces polymères. Ces expériences sontprésentées dans lafigure 17.
Les quantités de polymères qui ont été pré-incubéessur les cellules sont présentées en abscisse (en µg). Chaque condition est réalisée en duplicat, etl’histogramme présente les moyennes ± l’écart type.
Les expériences A) et B) ont été effectuées le même jour sur les lignéesllulairesce HEK-293 et HepG2 en utilisant un AAV2 codant le gène de la luciférase. Les polymères sont incubés sur les cellules 20 minutes. Puis les cellules sont lavées et le milieu d’infection contenant le vecteur à une MOI de 20 000 est incubé 2 heures sur les cellules avant d’être remplacé par du milieu de culture. L’expression de la luciférase est analysée 30 heures après infection sur les lysats cellulaires. L’expérience C) est réalisée différemment : un AAV2 codant le transgène sécrété mSeAP est utilisé, la pré-incubation dure également 20 minutes, mais l’AAV est ensuite ajouté sur les cellules sans lavage des polymères à une MOI de 50 000. L’expression de mSeAP est dosée dans les milieux conditionnés récoltés 30 heures après l’infection.
La première barre des histogrammes correspond à la transduction de l’AAV pré-incubé avec du milieu normal. Les polymères cationiques pK et pR inhibent de manière équivalente la transduction de l’AAV2 ( fig. 17C). L’intensité de l’inhibition est cependant variable d’une lignée cellulaire à l’autre comme le montre la comparaison des HEK-293 et des HepG2 (fig. 17A et B). A noter que l’on observe une inhibition dépendante de la dose et du degré de polymérisation de la pK1. Le pI quant à lui inhibe de manière dose dépendante la transduction des 2 lignées cellulaires. Dans les expériences A te B de la figure 17 les milieux de pré-incubation sont lavés avant l’ajout du vecteur AAV2, alors que dans l’expérience C l’infection est réalisée en présence des composésAinsi,. l’inhibition de transduction inversement proportionnelle à la dose de pK3 et pK4 dans l’expérience B peut être expliquée par une moindre adhérence des pK de haut degré de olymérisationp aux cellules, ce qui n’est pas le cas dans l’expérience C du fait de la présence inhibitrice constante de pK dans les milieux.
L’ensemble de ces observations semble indiquer que les inhibitions observées sont conséquentes à des phénomènes de saturation des membranes cellulaires. Cependant cette expérience n’exclut pas une interaction des polymères avec la capside AAV, par exemple par relargage dans le milieu de polymères s’étant adsorbés de manière non spécifique sur les cellules avant le lavage.
Quoi qu’il en soit nous voulions essentiellement no us assurer avec ces expériences in vitro que ces polymères ont un impact sur la transduction de l’AAV2. Nous sommes donc rapidement passés à un criblage in vivo car aucun système in vitro ne permet la modélisation de multiples paramètres tels que le passage du vecteur à travers l’endothelium, la transduction des cellules du foie ou des cellules musculaires différenciées.
Nous avons donc choisi arbitrairement la pK2 parmi les différentes pK pour initier nos expériences de transductionin vivo chez la souris.

Polymères cationiques

Poly-L-lysine et transduction AAV in vivo

Notre stratégie consiste en l’injection intraveineuse (IV) d’un polymère avant l’administration – également par IV – du vecteur AAV2 codant la phos phatase alcaline sécrétée murine (mSeAP). La protéine transgénique mSeAP présente avantagel’ d’être non immunogène et d’être dosable dans le sang ou les tissus. De plus,elle possède une thermostabilité supérieure aux phosphatases endogènes, ce qui permet sa détection spécifique après une étape de chauffage des échantillons. Notre cassette d’expression AAV code la mSeAP sous le contrôle du promoteur fort CMV qui est transcriptionnellement actif dans de nombreux tissus, dont les muscles striés, lisses et cardiaque [84]. Le fait que la mSeAP soit sécrétée nous permet de suivre la transduction globale au cours du temps en dosant son niveau dans le plasma des souris qui sont prélevées en sang avant les injections, puis une fois par semaine post injection. La transduction a également été suivie au niveau des organes en dosant la mSeAP dans des broyats tissulaires, ou en la révélant sur coupe histologique.
L’acide aminé lysine est une base tout comme l’histidine et l’arginine. La chaîne latérale de la lysine possède un groupement amine ayant un pKa de 10,2. Le pH moyen du sang humain (et murin) étant de 7,4 environ, un polymère de lysineinjecté dans le sang sera donc chargé positivement (-NH3+). La poly-L-lysine est capable d’interactions électrostatiques avec le récepteur primaire HSPG de l’AAV2 [85], nous proposons donc que le polymère cationique pK2 peut altérer la biodistribution de l’AAV2 in vivo. L’AAV2 est un sérotype peu efficace pour transduire le muscle suite à une injection IV ; nous utilisons donc dans cette expérience pilote une dose de vecteur de 1.1012 génomes viraux (vg) par souris, ce qui est proche du maximum imposé par la concentration de notre production d’AAV2, et par le volume d’injection IV choisi de 450 µ l. L’expérience consi ste en des pré-injections de doses croissantes de pK2 (200 µ l), suivies 5 minutes après par l’injection du vecteur (soit un volume final injecté de 650 µl) chez des souris Balb/c femelles âgées de 8 à 10 semaines. Sauf indication contraire, nous utiliserons des souris Balb/c femelles âgées de 8 à 10 semaines ainsi que ces volumes d’injection dans toutes nos expériences ultérieures.
Les résultats du dosage plasmatique de la mSeAP chez les souris de cette première expérience sont présentés dans lafigure 18.
Chaque courbe représente une souris. Le temps est gradué tous les 7 jours en abscisse car les souris sont prélevées en sang chaque semaine post injectio. La courbe noire correspond à une souris contrôle injectée avec du PBS. La courbe bleue correspond à la souris de référence injectée uniquement avec 1.1012 vg d’AAV2-CMV-mSeAP. Les courbes jaune, orange et rouge correspondent aux souris ayant reçu respectivement des pré-injections IV de 25, 50 et 80 µg de pK2 5 minutes avant l’injection IV de 1.10 12 vg d’AAV2-CMV-mSeAP.
La souris contrôle injectée avec du PBS ne présentepas d’expression de mSeAP dosable ce qui valide le protocole d’inactivation des phosphat ases endogènes par la chaleur. La sécrétion de mSeAP croît constamment durant les 30 jours de l’expérience dans la souris contrôle injectée seulement avec l’AAV2 (en bleu). On observe un gain de sécrétion chez les souris pré-injectées avec 50 et 80 µg de pK2. Le dosage plasmatique présente l’avantage de renseigner sur l’efficacité de transduction sans nécessité de sacrifier l’animal, cela permet aussi de s’épargner de nombreuses analyses a posteriori dans le cas où le traitement adjuvant est sans effet. Ayant observé ce gain de transduction dès J14 nous avons donc décidé d’analyser plus avant les souris contrôles injectées avec du PBS ou l’AAV2 seul, ainsi que la souris ayant reçu 80 µg de pK2 avant le vecteur. Le tropisme naturel de l’AAV2 est essentiellement vers le foie et les muscles. Le foie ainsi que deux muscles (gluteus et quadriceps) ont donc été prélevés pour doser le nsgènetra in situ (fig. 19A), ainsi que divers autres muscles pour réaliser le marquage du transgène sur coupes histologiques (cœur, diaphragme, tibial antérieur et triceps) (fig. 19B).
Ces analyses sont réalisées sur les organes des souris de l’expérience présentée dans lafigure 2 (prélèvements à J29). A) Le bruit de fond détecté chez la souris injectéeveca du PBS est mesuré pour chaque organe et retranché aux valeurs obtenues dans les échantillons des souris injectées avec le vecteur AAV2-CMV-mSeAP. En bleu : souris contrôle injectée uniquement avec le vecteur ; en orange : souris pré-injectée avec 80 µg de pK2. B) Les champs présentés sont représentatifs de l’ensemblede la coupe. L’encart dans la photo du triceps contrôle PBS correspond à un muscle dont l’activité phosphatase endogène n’a pas été inactivée à la chaleur. Cr :œur,c Dia : diaphragme ; TA : tibial antérieur ; Tri : triceps.La barre d’échelle correspond à 200 µm.
La figure 19A montre que le gain plasmatique est en partie dû à une amélioration de la transduction dans le foie et les muscles. L’encadré du triceps PBS présente une coupe dont les phosphatases endogènes n’ont pas été inactivées àa lchaleur. Ce marquage non spécifique est situé entre les fibres musculaires ou au niveau des vaisseaux sanguins. Quand les phosphatases endogènes sont inactivées aucun marquage de la mSeAP n’est visible sur les coupes histologiques de la souris contrôle PBS. Le marquage mSeAP des coupes de la souris injectée uniquement avec le vecteur montre que l’AAV2 transduit peu le muscle après une injection IV de 1.1012 vg. Aucun marquage n’est visible dans les cœurs, e t le nombre de cellules positives pour la mSeAP dans le diaphragme est comparable avec ou sans pK2. En revanche, on observe l’apparition de fibres muscula ires positives pour la mSeAP dans le tibial antérieur (TA) et le triceps des souris pré-injectées avec la pK2, alors qu’aucune transduction n’est visible dans ces muscles chez la souris contrôle AAV2 sans pK2. L’ensemble de ces résultats indique que la pré-injection de pK2 permet d’augmenter la transduction du foie et des muscles par l’AAV2. Une des hypothèses concernant la modification de la biodistribution de l’AAV2 aurait été une inhibition de l’infectionconséquente à la saturation des récepteurs HSPG par la pK injectée, dans le cas d’une répulsion électrostatique entre la pK et des zones cationiques de la capside. Cela semble possible in vitro comme nous l’avons vu sur une lignée hépatocytaire, mais in vivo l’hypothèse ne tient pas puisque le foie présente un gain de transduction tout comme les muscles.

Effet dose de l’adjuvant pK2 sur la transduction systémique de l’AAV2

Chaque dose de pK2 correspond à une souris, toutes les souris sont injectées avec 1.10 vg d’AAV2-CMV-mSeAP. A) Vue en perspective de la sécrétion de mSeAP en fonction de la dose de pK2 pré-injectée et du temps.B) Vue de dessus du graphique.
Suite à cette première expérience encourageante nous avons baissé la dose de vecteur injectée à 1.10 11 vg afin de reproduire et d’étudier en détail l’effet des pK sur un plus grand nombre d’animaux. L’expérience utilisant 1.1012 vg d’AAV2-CMV-mSeAP a montré un effet dose du polymère, nous avons donc cherché la dose de pK2 donnant un gain de sécrétion maximal lors d’une pré-injection 5 minutes avant l’administration de 1.1011vg de vecteur. La figure 20 indique que cette dose optimale se situe autour de 150 µg de pK2. Les doses inférieures à 150 µg montrent une augmentation de la sécrétion de mSeAP, et au-delà il semble que l’effet soit moindre même si l’on observe toujours un gain de sécrétion. Cette expérience a été reproduite une seconde fois et montre également un pic de sécrétion à 150 µg. Au passage la pré-injection de 150 µg de pK2 5 minutes avant le vecte ur a été comparée chez quelques souris à la pré-injection par voie intrapéritonéale (IP), ouencore à la co-injection de pK2 et du vecteur sans délai d’attente. Les courbes de sécrétion présentant des gains inférieurs, nous avons donc conservé par la suite le délai de 5 minutes et l’injection de pK par voie IV.

Influence du degré de polymérisation de la pK

L’influence du degré de polymérisation des pK a ensuite été étudiée en pré-injectant des polymères de degré de polymérisation (dp) croissant5 minutes avant l’injection de 1.10 11 vg de vecteur AAV2-CMV-mSeAP.
Les souris sont pré-injectées avec 120 (courbes noires) ou 150 µg de pK (courbes rouges). Les courbes bleues correspondent aux 2 souris contrôle ayant été injectées uniquement avec 1.10 vg de vecteur AAV2-CMV-mSeAP. Chaque groupe comprend 2 souris. Le graphique de la pK4 présente une seule courbe rouge car une des 2 souris injectées avec 150 µg est morte. Les polymères pK1 à pK4 et leur dp sont décrits en détail dans letableau 2 vu précédemment.
La figure 21 montre que la pK1 n’altère pas significativement la transduction comparé aux souris ayant été injectées avec l’AAV2 sans pré-traitement, alors que les pK de plus haut dp augmentent la sécrétion de mSeAP à tous les temps estés. Les gains de transduction semblent également corrélés au degré de polymérisation depK,la les meilleurs résultats plasmatiques étant obtenus avec la pré-injection de pK4. Afin devérifier si cette propriété est restreinte au polycation pK nous avons réalisé la même expérienceavec la poly-L-arginine pR64. Le résultat présenté dans lafigure 22 ci-après indique que d’autres polycations sont également capables d’augmenter la transduction de l’AAV2.
Lors des injections de pK nous avons noté une toxicité du produit, les souris étant relativement léthargiques dans l’heure suivant l’injection. Il est également arrivé à une faible fréquence que des doses à partir de 150 µg tuent la souris dans les heures ou la journée suivant l’administration de pK ; cela a notamment été le cas pour une des deux souris injectées avec 150 µg de pK4 dans l’expérience de la figure 21. Cette toxicité n’a pas fait l’objet d’une étude approfondie puisque les polymères que nous utilisons ne sont pas initialement synthétisés pour une utilisationin vivo. De plus nous avons trouvé que la dose optimale est proche de 150 µg. A ce stade nous avon s donc décidé d’utiliser essentiellement la pK4 qui semble la plus efficace, et de limiter les doses de pK injectées à 150 µg ou moins. Voici un graphique présentant la mortalité après injectionl’ de pK dans la figure 23. Ce graphique a été réalisé rétrospectivement à partirdes données collectées dans tous les protocoles impliquant l’injection de pK.

Augmentation de la transduction musculaire de l’AAV2 avec l’adjuvant pK4

L’analyse de la cinétique d’expression de la mSeAP dans le sang est un protocole efficace de criblage d’adjuvants potentiellement modulateurs de la transduction de l’AAV administré en IV. L’utilisation du promoteur fort et ubiquitaire CMV nous permet ainsi d’observer la transduction de nombreux organes, et jusqu’à un cer tain point de nous affranchir au cours du temps de la sécrétion du foie qui capte une bonne artiep du vecteur administré en IV. Afin de distinguer dans quelle mesure les profils de sécrétion sont dûs à l’expression du transgène dans les muscles, nous avons utilisé un vecteur AAV2 codant la mSeAP sous le contrôle d’un promoteur muscle spécifique : le promoteur de la créatine kinase musculaire (AAV2-MCK-mSeAP). Le dosage plasmatique de la mSeAP chez des souris injectées avec l’AAV2-MCK-mSeAP avec ou sans pré-injection de pK4 est présent dans lafigure 29.
Chaque courbe représente une souris. Les souris contrôle 1 à 4 en bleu sont injectées avec 1.10 11 vg d’AAV2-MCK-mSeAP. Les souris 5 à 9 ont reçu une pré -injection de pK avant l’administration de 1.1011 vg d’AAV2-MCK-mSeAP par IV. La pré-injection des souris 5 et 6 correspond à 125 µg de pK4 (courbes rouges), et dans le cas des souris 7 à 9 il s’agit de 150 µg de pK2 (courbes vertes).
Une des trois souris pré-injectées avec la pK2 (envert) a répondu plus faiblement que les autres. En dehors de ce point le premier constat est la très faible sécrétion obtenue dans les souris contrôle avec le promoteur MCK. En effet, la concentration moyenne de mSeAP à J34 chez ces souris correspond à 11 pg/ml, alors que no us obtenons en moyenne 740 pg/ml à cette même dose de vecteur dans le cas du promoteur fortCMV. De plus, le gain de sécrétion plasmatique à J34 est ici de l’ordre de 160 à 190 f ois avec la pK selon que l’on intègre ou non la souris ayant moins répondu ; alors que nous obtenons des facteurs de l’ordre de 3 à 5 en utilisant le même transgène sous le contrôle du promoteur CMV (cf fig. 24). Cela laisse penser que les gains de sécrétion observés dans nosexpériences utilisant la pK et le promoteur CMV sont en grande partie dûs à une augme ntation de la transduction musculaire. Il est difficile de comparer les 2 pK avec si peu d’animaux injectés, mais ici nous obtenons des profils de sécrétion similaires avec la pK2 etla pK4. Or nous avons observé que le gain de sécrétion est supérieur avec la pK4 comparé à lapK2 quand nous utilisons le promoteur CMV (cf fig. 24). Une hypothèse serait alors que la pK2 et la pK4 agissent de manière équivalente sur la transduction du muscle mais que la pK4 augmente en plus la transduction d’autres organes.
Concernant la transduction des muscles, nous avions remarqué précédemment des gains intéressants dans le cœur et le diaphragme suite au traitement pK4. Cependant, des données issues de la transfection de cellules in vitro indiquent que 90 % de la mSeAP est sécrétée, et que seuls 10 % sont trouvés dans les lysats cellulaires [87]. Afin d’augmenter la sensibilité du marquage, et pour ne pas passer à côté de cellules transduites exprimants faiblement le transgène, nous avons utilisé un AAV2 codant la β-galactosidase sous le contrôle du promoteur CMV (AAV2-CMV-LacZ). Les marquages histologiques réalisés sur le cœur et le diaphragme de souris pré-injectées avec la pK4 5 minutes avant l’injection de 2.10 11 vg de ce vecteur sont présentés dans lafigure 30 ci-après.

Table des matières

Partie I – Modification de la biodistribution du vecteur AAV injecté par voie intraveineuse
Introduction
1. La thérapie génique
2. Le vecteur AAV
2.1. Le virus sauvage
2.2. Caractéristiques et production du vecteur AAV
2.3. Les différents sérotypes AAV
2.4. Récepteurs des AAV
2.5. Mécanismes de transduction du vecteur AAV
2.6. Le devenir des génomes AAV recombinants dans les cellules
2.7. Tropisme des différents sérotypes AAV
3. Voie d’administration et immunogénicité du vecteur AAV
3.1. Voie d’administration locale
3.2. Voie d’administration vasculaire
3.3. Immunogénicité suite à une administration intraveineuse
4. Stratégies d’amélioration de la transduction du vecteur AAV
4.1. Facteurs endogènes et exogènes influençant la transduction AAV par voie systémique
4.2. Modification de la capside AAV
4.3. Approches pharmacologiques et adjuvants
4.4. Transduction à l’échelle du corps entier
Objectifs
Résultats
1. Adjuvants modifiant la biodistribution du vecteur AAV
1.1. Évaluation in vitro de différents polymères chargés
1.2. Polymères cationiques
a) Poly-L-lysine et transduction AAV in vivo
b) Effet dose de l’adjuvant pK2 sur la transduction systémique de l’AAV2
c) Influence du degré de polymérisation de la pK
d) Comparaison de pK2 et pK4 et influence du temps entre l’injection de pK et de vecteur
e) Influence de la dose de vecteur et du sexe sur l’effet de la pK4
f) Augmentation de la transduction musculaire de l’AAV2 avec l’adjuvant pK4
g) Effet de la pré-injection de pK sur d’autres sérotypes AAV
1.3. Polymères anioniques
a) Acide polyinosinique
b) Sulfate de dextran
2. Facteurs sanguins modulateurs de l’infection par l’AAV
2.1. Facteurs dépendants d’ions métalliques bivalents
2.2. Le complément
2.3. Facteurs de coagulation
3. Facteurs exogènes et procédure d’administration
3.1. Shunt hépatique
3.2. Administration de l’AAV par voie sous-cutanée
3.3. Mise à jeun
Conclusion et discussion
Partie II – Étude dans un modèle dystrophique : utilisation du muscle mdx comme producteur de protéine transgénique sécretée TNFR-Is/mIgG1
Introduction
1. La dystrophie musculaire de Duchenne
1.1. Historique
1.2. Signes cliniques
1.3. Traitements
1.4. La dystrophine
a) Gène DMD et isoformes de la dystrophine
b) La dystrophine et ses protéines associées
1.5. Pathophysiologie des dystrophies musculaires de Duchenne et Becker
1.6. Modèle murin mdx
1.7. Stratégies de thérapie génique pour la dystrophie musculaire de Duchenne
a) Approche correctrice : la dystrophine
b) Approches palliatives
2. Thérapie génique du muscle squelettique
2.1. Immunobiologie du muscle sain ou inflammé
a) Cellules de l’immunité présentes dans le muscle
b) Capacités immunes de la cellule musculaire
2.2. Réponse immune induite lors d’une injection intramusculaire
a) Réponse immune dirigée contre le vecteur
b) Réponse immune contre la protéine transgénique
2.3. Immunobiologie du muscle dystrophique et thérapie génique
2.4. Le muscle en tant que sécréteur
2.5. Électrotransfert du muscle
2.6. Transduction du muscle par l’AAV
3. Inflammation, TNF et DMD
3.1. Le facteur de nécrose tumorale
a) Historique, gène et protéine
b) Production du TNF
c) Régulation de la synthèse et de la sécrétion du TNF
d) Rôle physiologique
e) Inhibiteurs du TNF
3.2. Hypothèse de pathophysiologie DMD : signalisation via le DGC
3.3. Rationnel des stratégies anti-inflammatoires pour DMD
a) Dérégulation de la signalisation de l’inflammation dans le muscle dystrophique
b) Traitements anti-inflammatoires actuellement utilisés ou en recherche pré-clinique pour DMD
3.4. Récepteur du TNF et dérivés
a) Les récepteurs du TNF
b) Inhibiteurs biologiques du TNF dérivés des TNFR
Objectifs
Résultats
1. Transfection du muscle dystrophique pour la sécrétion de chimères du récepteur I du TNF
1.1. Électrotransfert de plasmides codant la chimère hTNFR-Is/mIgG1
a) Étude cinétique chez la souris mdx
b) Évaluation des anticorps anti-hTNFR-Is
c) Immunogénicité du squelette plasmidique
1.2. Vectorisation du hTNFR-Is dans un AAV
a) Administration intramusculaire
b) Administration intraveineuse
1.3. Construction et caractérisation d’une chimère murine
a) Test de l’activité biologique du mTNFR-Is/mIgG1
b) Électrotransfert du plasmide codant le mTNFR-Is/mIgG1
c) Activité biologique du mTNFR-Is/mIgG1 produit in vivo et analyse histologique du muscle transfecté
d) Expression du TNF et du TNFR-Is chez la souris mdx
1.4. Cinétique de sécrétion et réponse immune contre les TNFR-Is/mIgG1 lors d’une injection d’AAV dans le muscle dystrophique
a) Expression d’un transgène sécrété non immunogène
b) Expression des transgènes TNFR-Is/mIgG1 dans le muscle
c) Cinétique de sécrétion des transgènes TNFR-Is/mIgG1 par le muscle
d) Caractérisation de la réponse immune contre le hTNFR-Is/mIgG
e) Dissémination du vecteur AAV6 après une injection intramusculaire
f) Activité biologique du mTNFR-Is/mIgG1 produit par le vecteur AAV6
2. Évaluation du potentiel thérapeutique du transfert de gène mTNFR-Is/mIgG1 chez la souris mdx
2.1. Protocole d’électrotransfert
a) Protocole
b) Expression du transgène et du TNF au cours du protocole
c) Évaluation fonctionnelle
d) Évaluation de l’atteinte membranaire et histologie du muscle dystrophique
2.2. Protocole utilisant l’AAV6-mTNFR-Is/mIgG1
a) Pic de nécrose de la souris mdx
b) Traitement AAV6-mTNFR-Is/mIgG1 précédant le pic de nécrose de la souris mdx
Conclusion et discussion
Partie III – Matériels et méthodes
1. Biologie moléculaire
1.1. Plasmides et clonages
1.2. Quantification de génomes viraux dans les organes par PCR en temps réel
2. Production et purification des vecteurs AAV
2.1. Production des vecteurs
2.2. Purification des vecteurs AAV
2.3. Titrage de la production de vecteur AAV
3. Expérimentation animale
3.1. Souris
3.2. Anesthésie
3.3. Injections
3.4. Aduvant et produits injectés
3.5. Electrotransfert in vivo
3.6. Shunt hépatique
3.7. Mise à jeûn
3.8. Sacrifices et prélèvements
a) Prélèvement de sang
b) Prélèvement et préparation des organes
3.9. Évaluation fonctionnelle
a) Étude in vivo
b) Étude in vitro
4. Dosages et mesure d’activité biologique
4.1. Dosage de la mSeAP
4.2. Titration des anticorps neutralisant le vecteur AAV
4.3. Dosage de l’activité luciférase
4.4. Mesure d’activité du complément
4.5. Mesure du temps de coagulation
4.6. Production de milieux conditionnés h et mTNFR-Is/mIgG1 par transfection
4.7. Dosage par ELISA du hTNFR-Is, mTNFR-Is et mTNF
4.8. Évaluation de l’activité biologique de la protéine TNFR-Is/mIgG1
4.9. Analyse d’IgG par ELISA
4.10. Dosage de la créatine kinase plasmatique
5. Histologie
5.1. Préparation des échantillons
5.2. Coloration HPS
5.3. Marquages histo-enzymatiques
a) Révélation de la mSeAP
b) Révélation de la β-galactosidase
5.4. Immunomarquages
a) TNFR-Is et CD8
b) Myosine lente
5.5. Observation du bleu Evans
6. Acquisition et analyse d’images de microscopie
a) Acquisition
b) Analyses morphométriques
7. Statistiques
Partie IV – Bibliographie

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