ETUDE COMPARATIVE DE DEUX METHODES DE DOSAGE DU CHOLESTEROL HDL

Structure générale des lipoprotéines

      Les lipoprotéines ont généralement une forme sphérique, avec une taille et une composition variables mais de structure générale identique. Elles sont formées d’un corps lipidique hydrophobe ou noyau contenant essentiellement des triglycérides et du cholestérol estérifié qui sont enrobés d’une monocouche de lipides polaires constituées de phospholipides et de cholestérol libre ou non estérifié. Des protéines spécifiques nommées apolipoprotéines dont la structure est faite de zones hydrophobes incluses dans la masse lipidique et des zones hydrophiles tournées vers le milieu plasmatique assurent la stabilité de la macromolécule et en contrôlent le devenir métabolique.

Les apolipoprotéines

       Les apolipoprotéines se situent à la surface des lipoprotéines grâce à leurs acides aminés hydrophiles. La partie hydrophobe de ces protéines est tournée vers l’intérieur. Les apolipoprotéines confèrent à chaque édifice lipoprotéique ses propriétés fonctionnelles et son devenir métabolique. Elles jouent un rôle critique dans le métabolisme des lipoprotéines, d’abord comme composants structuraux des lipoprotéines mais aussi comme activateurs ou inhibiteurs des enzymes du métabolisme des lipides à la surface de ces lipoprotéines et aussi en tant que ligands pour des récepteurs à la surface cellulaire. Ces fonctions sont extrêmement importantes dans le transport et le métabolisme des lipides et ducholestérol dans la circulation sanguine. Initialement, les apolipoprotéines ont été subdivisées en trois sous familles distinctes selon la nomenclature A, B, C et D [38] mais cette nomenclature a considérablement évolué au cours des 30 dernières années, en raison de la découverte de nouvelles apolipoprotéines et de profils de distribution spécifique au sein des lipoprotéines plasmatiques. Le tableau I permet une classification des apolipoprotéines en fonction de leur localisation, de leur expression tissulaire et de leur fonction. Par exemple nous pouvons dire que les apolipoprotéines A-I et A-II se localisent quasi-exclusivement dans les HDL, l’apolipoprotéine A-IV peut aussi s’associer aux lipoprotéines riches en triglycérides ; les apolipoprotéines B se localisent non seulement dans les LDL, mais également dans les VLDL et les chylomicrons : les apoE, comme les apoC, ne sont pas associées à un seul type de lipoprotéines, mais se retrouvent à la fois dans les VLDL et les HDL

Voie exogène : de l’intestin vers le foie

        Les lipides du bol alimentaire, acides gras et cholestérol, sont absorbés au niveau intestinal et sont ensuite sécrétés dans la lymphe, initiant ainsi la voie exogène de transport des lipides. Un grand nombre de protéines cellulaires distinctes peuvent influencer, de manière positive ou négative, l’absorption intestinale des acides gras et du cholestérol alimentaire (FABPpm, plasma membrane Fatty Acid-Binding Protein), Cavéoline 1, CD36, FATP( Fatty Acid Transport Protein), SR-B1 Scavenger Receptor class B1 (CLA-1), ABC (ATPBinding Cassette) ABCA1, ABCG5, ABCG8, MTP) [13,16]. La Microsomal Triglyceride Transfer Protein (MTP) va en particulier jouer un rôle essentiel dans l’assemblage et la sécrétion des lipoprotéines riches en triglycérides, qu’il s’agisse des chylomicrons dans l’entérocyte, ou des VLDL dans l’hépatocyte [33, 72, 79]. La MTP est une protéine intracellulaire de transfert des lipides (préférentiellement esters de cholestérol et triglycérides) qui stabilise l’apolipoprotéine B à un stade précoce lors de son entrée dans la lumière du réticulum endoplasmique. Dans les conditions normales, la synthèse et la sécrétion des lipoprotéines riches en triglycérides dans les entérocytes, en phase postprandiale, sont directement fonction du taux d’absorption des lipides. Au cours du jeûne, les entérocytes conservent une capacité de synthèse et de sécrétion de lipoprotéines riches en triglycérides ; ces molécules dérivent alors de l’hydrolyse des phospholipides biliaires, ou de débris cellulaires provenant de la muqueuse intestinale. Les chylomicrons prennent en charge et transportent également le cholestérol alimentaire qui est transformé en esters de cholestérol au sein des entérocytes par une enzyme spécifique localisée dans le réticulum endoplasmique l’acyl coenzyme A-cholesterol-acyltransferase (ACAT) [70]. Au niveau du réticulum endoplasmique, les particules de type chylomicron contiennent déjà l’apoB48, essentielle à leur assemblage. Elles sont ensuite concentrées au sein de l’appareil de Golgi dans des vésicules de sécrétion qui vont migrer, puis fusionner avec la membrane plasmique au pôle basolatéral de l’entérocyte afin d’être déversées dans l’espace extracellulaire. Les chylomicrons d’origine intestinale, initialement sécrétés dans la lymphe mésentérique, rejoignent la circulation sanguine. Les chylomicrons peuvent alors se lier très rapidement à la lipoprotéine lipase (LPL), enzyme lipolytique ancrée à l’endothélium des capillaires sanguins de nombreux tissus périphériques. En plus de l’apolipoprotéine B48, les chylomicrons natifs contiennent les apolipoprotéines A-I, A-II et A-IV nouvellement synthétisées. Ils acquièrent rapidement des apolipoprotéines C et E provenant des HDL. Au cours de l’hydrolyse des triglycérides par la lipoprotéine lipase, dont le cofacteur est l’apolipoprotéine C-II, des acides gras non estérifiés sont libérés et rapidement captés par les tissus. De plus, les apolipoprotéines A (en particulier l’apolipoprotéine A-I) et C vont se dissocier, contribuant ainsi à l’émergence de nouvelles particules HDL. Plusieurs tissus périphériques, principalement le cœur, le muscle squelettique et le tissu adipeux, internalisent directement une partie des particules résiduelles de chylomicron avant qu’elles ne soient prises en charge par le foie [45]. Finalement, les particules résiduelles non-captées, ayant perdu une large part de leurs triglycérides et de leurs apolipoprotéines mineures (dont les apoA-I et CII), sont catabolisées par les hépatocytes. Dans cette dernière étape, le récepteur des LDL et le récepteur LRP (LDL-receptor related protein) [45] contribuent à la reconnaissance et à l’internalisation hépatique des particules résiduelles qui contiennent l’apolipoprotéine E. Le récepteur LRP, récepteur cellulaire multifonctionnel, est également capable de lier la lipoprotéine lipase qui peut se retrouver associée à la particule résiduelle de chylomicron qu’elle a contribué à façonner [11]. La particule résiduelle (remnant) ainsi internalisée peut alors fusionner avec des lysosomes qui induisent une lipolyse et une protéolyse quasi complète de ses constituants Le cholestérol sera alors principalement intégré dans de nouvelles lipoprotéines synthétisées par le foie (VLDL) ou excrété dans les canalicules biliaires, sous forme native ou dérivée.

Mécanisme d’action du cholestérol HDL

    Plusieurs grandes études prospectives ont établi que le cholestérol HDL est un facteur de risque négatif, indépendant vis-à-vis de la maladie coronarienne, et qu’il représente aujourd’hui un facteur protecteur connu contre l’athérosclérose. Ainsi, à taux élevé, le HDL-cholestérol est considéré comme protecteur au point d’avoir reçu le qualificatif de « bon cholestérol ». Les HDL exercent des effets pléiotropiques, anti-inflammatoires, anti thrombotiques et antioxydants, potentiellement associés à leur rôle protecteur. Ainsi, les HDL peuvent véhiculer des enzymes comme la paraoxonase et la PAF-acétyl hydrolase [48], capables d’hydrolyser des phospholipides et des esters de cholestérol peroxydés. En outre, les HDL peuvent directement s’opposer aux effets des LDL oxydées sur les cellules endothéliales et musculaires lisses vasculaires. Ainsi, les HDL diminuent l’expression de molécules d’adhésion, des facteurs de recrutement des monocytes et des molécules pro thrombotiques tout en favorisant la synthèse d’oxyde nitrique (NO) et de prostacycline [71]. Cependant, l’effet protecteur des HDL est majoritairement attribué à la fonction centrale de ces lipoprotéines dans le transport-retour du cholestérol, un processus par lequel le cholestérol excédentaire des cellules est capté et estérifié au sein des HDL, puis ramené au foie avant d’être excrété dans la bile, sous forme de cholestérol libre ou après transformation en acides biliaires. Ce processus est sous-tendu par des interactions spécifiques entre les particules de HDL et les cellules, périphériques d’une part (efflux de cholestérol) et hépatiques d’autre part (captation de cholestérol HDL), ainsi que par le remodelage des particules de HDL dans le compartiment vasculaire. En effet, les HDL plasmatiques subissent des remaniements complexes sous l’action de protéines enzymatiques (comme la lécithine cholestérol acyltransférase) ou de transfert des lipides, qui permettent la prise en charge et l’estérification de grandes quantités de cholestérol dérivé des cellules, et la formation de particules HDL riches en lipides, secondairement éliminées par le foie. Le niveau du cholestérol HDL plasmatique est donc la résultante de ces interactions moléculaires complexes. Parmi les protéines interagissant avec les HDL, certaines contribuent à la formation des HDL – la lipoprotéine lipase ou le transporteur cellulaire ABCA1, par exemple – alors que d’autres sont impliquées dans le catabolisme des HDL, comme la lipase hépatique (ou triglycéride lipase hépatique – TGL-H), la protéine de transfert d’ester de cholestérol (CETP), le Scavenger Receptor class B type I (SR-BI) ou l’ATP-synthase/hydrolase membranaire, récemment décrite à la surface des hépatocytes. Au cours de la dernière décennie, des avancées considérables ont été réalisées dans l’identification et la compréhension du rôle des protéines cellulaires impliquées dans le métabolisme des HDL, ainsi que dans leurs régulations transcriptionelles, ouvrant de nouvelles perspectives en vue de la modulation du cholestérol HDL. En outre, des variants géniques ont été décrits, et d’autres seront probablement découverts, qui pourraient en partie expliquer la variabilité interindividuelle des taux de HDL.

Table des matières

PREMIERE PARTIE:RAPPELS BIBLIOGRAPHIQUES
INTRODUCTION
GENERALITES
I – ATHEROSCLEROSE
II – STRUCTURE, COMPOSITION ET CLASSIFICATION PHYSICO CHIMIQUE DES LIPOPROTEINES PLASMATIQUES
II – 1 – Structure générale des lipoprotéines
II – 2 – Composition des lipoprotéines
II – 2 – 1 – Le cholestérol libre ou non estérifié
II – 2 – 2 – Le cholestérol estérifié
II – 2 – 3 – Les triglycérides
II – 2 – 4 – Les phospholipides
II – 2 – 5 – Les apolipoprotéines
II – 3 – Classification des lipoprotéines
III – METABOLISME DES LIPOPROTEINES PLASMATIQUES
III – 1 – Voie exogène : de l’intestin vers le foie
III – 2 – Voie endogène : du foie vers les tissus périphériques
III – 3 – Voie de retour
IV – INTERET PHYSIOPATHOLOGIQUE DU DOSAGE DU CHOLESTEROL HDL
V – TECHNIQUES DE DOSAGE DU CHOLESTEROL HDL ET LEURS INTERFERENCES
V – 1 – La méthode avec précipitation
V – 2 – Les méthodes directes
V – 2 – 1 – La méthode alpha cyclodextrine (α CD)
V – 2 – 2 – La méthode polyanions – détergents (PAD)
V – 2 – 3 – La méthode Anticorps anti bêta-lipoprotéines (AC)
V – 3 – La chromatographie liquide haute performance (HPLC)
V – 4 – L’Ultracentrifugation
V – 5 – L’électrophorèse
DEUXIEME PARTIE:TRAVAIL PERSONNEL
I – JUSTIFICATION ET OBJECTIFS DE L’ETUDE
I – 1 – Justification
I – 2 – Objectifs
I – 2 – 1 – Objectif général
I – 2 – 2 – Objectifs spécifiques
II – MATERIELS ET METHODES
II – 1 – Type d’étude
II – 2 – Cadre d’étude
II – 3 – Spécimens biologiques
II – 4 – Matériel
II – 5 – Méthodologie
II – 5 –1 – Dosage direct du cholestérol HDL
II – 5 – 2 – Méthode avec précipitation
II – 5 – 3 – Dosage du cholestérol total
II – 5 – 4 – Dosage du cholestérol LDL
II – 5 – 5 – Dosage des triglycérides
II – 5 – 6 – Estimation du cholestérol LDL par la méthode de Friedewald
II – 6 – Analyse statistique
III – RESULTATS
III – 1 – Résultats de l’effet des paramètres sur les valeurs observées
III – 2 – Comparaison des techniques direct et avec précipitation
III – 2 – 1 – Comparaison des moyennes journalières
III – 2 – 2 – Comparaison globale des moyennes
III – 2 – 3 – Etude de la tendance des méthodes
III – 2 – 4 – Répétabilité
III – 2 – 5 – Etude de la concordance et de la corrélation entre les méthodes
III – 3 – Comparaisons des résultats du LDL- Cholestérol : Estimation par calcul et Dosage direct
IV – COMMENTAIRES ET DISCUSSION
IV – 1 – Spécimens biologiques
IV – 2 – Réalisation technique
IV – 3 – Comparaison des techniques directe et avec précipitation
IV – 3 – 1 – Du point de vue de la performance analytique
IV – 3 – 2 – La discordance des méthodes
IV – 3 – 3 – En termes de cout par test et temps de réalisation
CONCLUSION
REFERENCES BIBLIOGRAPHIQUES

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