Soutenance mémoire
MATERIEL VEGETAL
Description botanique (BOITEAU, 1986)
Le genre Pittosporum appartient à la famille des PITTOSPORACEES. C’est un arbrisseau mesurant environ 5 m. L’écorce de tige, glabre ou faiblement pubescente, est parsemée de lenticelles. Les feuilles sont groupées à l’extrémité des rameaux finement coriaces et fermes. Elles sont largement obovales, mesurant en moyenne 116 x 42 mm. La nervure médiane atteint toujours le sommet. L’inflorescence est généralement dense plus ou moins hémisphérique, presque toujours à axe pubescent et à ovaires pubescents.
La classification de cette plante est la suivante (JUDD et coll., 1999) :
• Règne : VEGETAL
• Embranchement : SPERMAPHYTES
• Sous embranchement : ANGIOSPERMES
• Classe : DICOTYLEDONES
• Sous classe : EUASTERIDES II
• Ordre : APIALES
• Famille : PITTOSPORACEAE
• Genre : Pittosporum
• Espèce : ochrosiaefolium
• Nom vernaculaire : Hazombary, Maimbovitsika.
Répartition géographique
Cette plante appartient aux bois littoraux ou aux forêts ombrophiles, dans les zones à climat humide et chaud de la partie Est de Madagascar. La figure 2 montre sa répartition géographique.
Récolte et préparation du matériel végétal
Les feuilles et les tiges de Pittosporum ochrosiaefolium ont été récoltées dans la forêt d’Analamazaotra à Andasibe au mois de Janvier 2005. Les feuilles sont lavées puis séchées à l’étuve pendant une semaine. Elles sont ensuite réduites en poudre au moyen d’un mixer. Le broyat est tamisé pour avoir une poudre fine qui constituera notre matériel végétal de départ. Les tiges sont écorcées et les écorces sont lavées puis séchées à l’air ambiant pendant deux semaines. Les écorces sont ensuite broyées à l’aide d’un mixer afin d’obtenir une poudre fine qui sera conservée dans une boîte hermétique à la température du laboratoire.
METHODES
METHODES D’EXTRACTION
Extraction à froid
Le matériel végétal sous forme de poudre est mélangé avec le solvant d’extraction (eau distillée ou mélange hydroalcoolique 75% : 75 ml d’éthanol dans 25 ml d’eau distillée) dans un rapport 1/10 (p/v), c’est-à-dire 1 g de matériel dans 10 ml de solvant. Le mélange est agité à l’aide d’un agitateur magnétique pendant au moins 3 h à la température ambiante. Ensuite, la suspension est laissée macérer pendant une nuit à +4°C. Une nouvelle agitation de 1 h est alors nécessaire pour homogénéiser la suspension. Le macérat est filtré sur 4 épaisseurs de gaze, puis le marc est éliminé. Le filtrat obtenu est centrifugé à 16000 x g pendant 20 min et à +4°C à l’aide d’une centrifugeuse BECKMAN J2-21 (rotor JA 20). Notons que toutes les opérations ultérieures de centrifugation seront réalisées à l’aide du même appareil. Le surnageant est récupéré et concentré par évaporation sous pression réduite jusqu’à un rapport 1/1 (p/v) . Le précipité qui peut se former au cours de l’opération de concentration est éliminé par centrifugation pendant 20 min, à 16000 x g et à +4°C.
Extraction à chaud et à reflux
La poudre d’organes est mise en contact avec le solvant d’extraction qui est l’eau distillée, dans le rapport 1/10 (p/v). Le mélange est chauffé à reflux pendant 2 h à 60°C et sous agitation magnétique. Après refroidissement, la suspension est laissée macérer pendant une nuit à +4°C, puis elle est de nouveau soumise à une agitation magnétique pendant 1 h. Le filtrat obtenu par filtration sur 4 épaisseurs de gaze, est centrifugé pendant 20 min, à 16000 x g et à +4°C. Le surnageant est concentré, puis centrifugé comme précédemment pour éliminer le précipité éventuel.
METHODES DE PURIFICATION
Précipitation par l’éthanol 50% (FONG et coll., 1973)
Principe
Cette technique repose sur la précipitation de certains composés, sous l’effet de la diminution de la polarité d’un milieu aqueux, par addition d’un solvant organique miscible tel que l’éthanol.
Mode opératoire
L’éthanol absolu est mélangé progressivement à un volume égal d’extrait à traiter sous agitation magnétique. Le mélange est soumis à une centrifugation pendant 15 min, à 16000 x g et à + 4°C. Le surnageant et le culot sont chacun débarrassés de l’alcool par évaporation puis repris dans de l’eau distillée dans le rapport 1/1 (p/v), c’est-à-dire 1 g de matériel de départ pour 1 ml d’eau distillée.
Traitement par l’acétate neutre de plomb (ANP)
Principe
Le traitement consiste à précipiter à l’aide d’un sel de métal lourd de nombreux composés tels que les protéines, les polysaccharides, les acides organiques ou les acides nucléiques, sous forme de sels insolubles.
Mode opératoire
Une solution aqueuse d’ANP 20% (p/v) de volume déterminé, est ajoutée goutte à goutte sous agitation magnétique à l’extrait à traiter. Le précipité formé est éliminé par centrifugation pendant 15 min, à 16000 x g et à + 4°C, et le surnageant est recueilli. Cette opération est répétée jusqu’à ce qu’il n’y ait plus formation de précipité. L’excès d’ANP dans le surnageant est précipité par addition progressive d’une solution aqueuse de phosphate disodique Na2HPO4 à 10% (p/v), sous agitation magnétique. Le précipité est également éliminé par centrifugation dans les conditions précédentes.
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Table des matières
INTRODUCTION GENERALE
1. Introduction
2. Matériels et méthodes
2.1.Matériels
2.1.1. Matériel végétal
2.1.1.1. Description botanique
2.1.1.2. Répartition géographique
2.1.1.3. Récolte et préparation du matériel végétal
2.1.2. Animaux d’expérimentation
2.1.3. Produits chimiques
2.2. Méthodes
2.2.1.Méthodes d’extraction
2.2.1.1. Extraction à froid
2.2.1.2. Extraction à chaud et à reflux
2.2.2. Méthodes de purification
2.2.2.1. Précipitation par l’éthanol 50%
2.2.2.1.1. Principe
2.2.2.1.2. Mode opératoire
2.2.2.2. Traitement par l’acétate neutre de plomb (ANP)
2.2.2.2.1. Principe
2.2.2.2.2. Mode opératoire
2.2.2.3. Traitement par l’acétone
2.2.2.3.1. Principe
2.2.2.3.2. Mode opératoire
2.2.2.4. Traitement par le charbon actif
2.2.2.4.1. Principe
2.2.2.4.2. Mode opératoire
2.2.2.5. Dialyse
2.2.2.5.1. Principe
2.2.2.5.2. Mode opératoire
2.2.2.6. Fractionnement par le n-butanol
2.2.2.6.1. Principe
2.2.2.6.2. Mode opératoire
2.2.3. Evaluation des rendements
2.2.4. Méthode de concentration
2.2.5. Méthodes analytiques
2.2.5.1. Chromatographie sur couche mince
2.2.5.1.1. Principe
2.2.5.1.2. Mode opératoire
2.2.5.2. Réactions de détection des familles chimiques
2.2.5.2.1. Préparation des extraits
2.2.5.2.1.1. Extrait aqueux
2.2.5.2.1.2. Extrait hydroalcoolique
2.2.5.2.1.3. Extrait acide
2.2.5.2.1.4. Extrait chloroformique
2.2.5.2.2. Détection des alcaloïdes
2.2.5.2.2.1. Test de MAYER
2.2.5.2.2.2. Test de WAGNER
2.2.5.2.2.3. Test de DRAGENDORFF
2.2.5.2.3. Détection des flavonoides : Test de WILSTATER (cyanidine)
2.2.5.2.4. Détection des leucoanthocyanes : Test de BATE-SMITH
2.2.5.2.5. Détection des stérols insaturés : Test de SALKOWSKI
2.2.5.2.6. Détection des stéroïdes et triterpènes : Test de LIEBERMANN-BURCHARD
2.2.5.2.7. Détection des tanins et polyphénols
2.2.5.2.7.1. Test à la gélatine
2.2.5.2.7.2. Test à la gélatine salée
2.2.5.2.7.3. Test au FeCl3
2.2.5.2.8. Détection des désoxyoses : Test de KELLER-KILIANI
2.2.5.2.9. Détection des iridoides
2.2.5.2.10. Détection des saponines
3. Résultats
3.1. Extraction et purification des principes toxiques
3.1.1. Extraction
3.1.1.1. Extraction aqueuse à froid
3.1.1.2. Extraction hydroalcoolique 75% à froid
3.1.1.3. Extraction aqueuse à chaud à reflux
3.1.2. Purification
3.1.2.1. Précipitation par l’éthanol 50%
3.1.2.2. Précipitation par l’acétate neutre de plomb (ANP)
3.1.2.3. Traitement par l’acétone
3.1.2.4. Filtration sur charbon actif
3.1.2.5. Dialyse
3.1.2.6. Fractionnement par le n-butanol
3.1.2.7. Evolution de l’homogénéité des extraits
3.1.3. Rendements
3.2. Caractérisation chimique
3.2.1. Propriétés physico-chimiques
3.2.2. Nature chimique des principes actifs
4. Discussion et conclusion
CONCLUSION GENERALE
