Soutenance mémoire
ACTIVITE ANTIOXYDANTE
L’activité antioxydante d’une substance est définie par sa capacité de réduire ou d’empêcher les réactions d’oxydation provoquées par les radicaux libres dans l’organisme. Ces derniers peuvent oxyder les acides nucléiques, les protéines et les lipides. [2] [29] [W17] [W18] [W19]. Les composés antioxydants comme les acides, les Polyphénols et les Flavonoïdes phénoliques détruisent les radicaux libres. Ils empêchent ainsi les mécanismes oxydants qui mènent aux maladies dégénératives (A. Prakash, 2001) (A.F. Soares, 2005). Les scientifiques affirment que les antioxydants ont la capacité de réduire le risque de contracter les maladies chroniques comme le cancer et la maladie du cœur (A. Prakash, 2001). Ces composés peuvent être présents dans les aliments (légumes, fruits) [2] [28], dans les plantes, les vitamines ou les oligo-éléments. Les plus connus sont le β-carotène, l’acide ascorbique (vitamine C), les tocophérols (dont la vitamine E), les polyphénols, les flavonoïdes, les tanins, les anthocyanes et les acides phénoliques [26] [27] [30]. Les antioxydants sont aussi synthétisés en laboratoire [2] [18] [28] [29]
Analyse Chromatographique
La chromatographie est un procédé physico-chimique selon laquelle les constituants d’un mélange se séparent en fonction des vitesses auxquelles ils sont entraînés par une phase mobile à travers une phase stationnaire placée dans une colonne ou sur une surface plane [19] [20] [21]. Le principe de base de la chromatographie repose sur des équilibres de concentrations. Il y a diverses techniques chromatographiques mais celles développées ci-dessous ont été utilisées lors de notre étude.
Chromatographie sur couche mince : La chromatographie sur couche mince (CCM) est une technique qui permet de déterminer les produits contenus dans un extrait ou de les séparer. Elle repose principalement sur des phénomènes d’adsorption qui contrôlent l’action de rétention de la phase stationnaire. La phase mobile est un solvant ou un mélange de solvants qui progresse le long d’une phase stationnaire fixée sur une plaque de verre ou sur une feuille semi-rigide en plastique ou en aluminium [2] [22] [23] [W10] [W11]. Les constituants se déplacent alternativement de la phase stationnaire à la phase mobile.
Chromatographie sur papier : La chromatographie sur papier est une technique planaire qui consiste à exploiter le critère de la polarité des molécules pour mieux réaliser leur séparation. Selon cette méthode, il était possible de séparer sans acétyler les aminoacides sur la base de leur différence de solubilité entre une phase mobile organique et une phase stationnaire aqueuse sur une feuille de cellulose. [23] [24] [25] [26] [27]. La simplicité du matériel utilisé et les excellents résultats obtenus expliquent le succès reconnu de la chromatographie sur papier. Actuellement, elle conserve toutes ses valeurs pour séparer des substances très polaires comme les Flavonoïdes, malgré l’apparition de la chromatographie sur couche mince et plus récemment la chromatographie liquide à haute performance.
Chromatographie sur colonne Séphadex LH 20 : Cette chromatographie repose sur la séparation de constituants en mélange, en fonction de leur poids et tailles moléculaires (Hostettmann et al, 1997). Le Séphadex est un gel préparé par réticulation d’un polymère anhydroglucosé : le dextrane. Il joue un rôle de tamis moléculaire. Les grosses molécules de poids moléculaires élevés n’entrent pas dans les pores du gel mais restent dans le liquide extragranulaire et sortent les premières dans le volume mort de la colonne : elles sont dites exclues. Par contre, les petites molécules pénètrent facilement dans les pores du gel et leur élution se fait plus lentement. Ainsi, les molécules sont éluées par ordre de poids moléculaires décroissants. Cette technique est adaptée à la purification de faibles quantités de produit.
Cas des protons à 7,84, 7,58 et 6,87 ppm
– Le proton à 7,84 ppm, fortement déblindé se place sur le noyau B du flavonoïde.
– A partir du tableau 17, la faible corrélation observée en COSY entre H7,84 et H7,58 signifierait que ces deux protons sont en position méta, alors que la corrélation forte entre H7,58 et H6,87 positionne ces deux protons en ortho, l’un de l’autre. Par ailleurs, la même valeur de constante de couplage examinée dans leurs signaux corrobore cette position.
– Les fortes intensités de corrélation de C158,62 avec les deux protons H7,84 et H7,58, le fort déblindage de ce 13C, dû à sa liaison avec un hétéroatome favorisent sa place la plus probable en C2 du noyau flavonique.
– La mésomérie au niveau du noyau de carbone corrobore le fort déblindage du C2.
– En examinant les données du spectre HMBC, on remarque que H7,84 ; H7,58 et H6,87 sont corrélés avec C150,04. De ce fait, ces noyaux de 1H et 13C sont localisés sur le noyau B.
– La forte intensité de corrélation de C145,92 avec H7,84 et sa faible corrélation avec H6,87 corroborent à la position de ce 13C, en méta de H7,84 et en ortho de H6,87.
– Les forts déblindages de C150,04 et C145,92 pourraient être dûs aux oxygènes. Dans la zone entre 6,21 à 7,84 ppm sur S1, il reste à placer les deux 1H : H6,41 et H6,21. Etant donné que tous les 1H du noyau B ont été identifiés, ces deux 1H sont donc ceux du noyau A.
Activité antioxydante des extraits AcOEt
Le test de propriété antioxydante sur les extraits AcOEt, par pulvérisation du chromatogramme, par une solution méthanolique de DPPH à 0,1%, ayant donné un virage des couleurs des taches du violet au jaune, a montré que tous les constituants dans les espèces sauvages sont actifs et seulement cinq pour ceux de la plante cultivée. Tous les constituants des extraits des plantes sauvages et la tache numéro sept de celui de la plante cultivée ont des fortes activités antioxydantes.
Activité antioxydante du produit P1
Le test de l’activité antioxydante du produit P1 a montré qu’il possède une activité antioxydante (Figure 17). Par comparaison, les plantes sauvages présentent des taches de mêmes propriétés. Le produit P1 est présent dans les plantes sauvages à Ambositra comme à Arivonimamo. Comme la tache numéro sept de la plante cultivée est moins intense par rapport à ceux des plantes sauvages (Figure 16), le produit P1 peut être présent aussi dans les plantes cultivées mais en plus faible quantité. Cette dernière peut être due d’une part à l’âge de la plante, celle cultivée paraissait plus jeune, et d’autre part au changement de sites d’implantation (altitude) et au climat. Ainsi, ces résultats montrent l’intérêt des projets de protection environnementale et l’intérêt de la multiplication de la plante dans son milieu naturel [4] [5] [6].
CONCLUSION
Les objectifs de ce travail ont été de déterminer des familles chimiques, d’isoler et d’identifier un ou plusieurs constituants dans l’espèce Uapaca bojeri (EUPHORBIACEAE), ou Tapia, endémique de Madagascar, utilisée en médecine traditionnelle pour traiter la dysenterie, l’ulcère d’estomac et pour soigner les dents. Le mélange de la pâte obtenue à partir de l’écorce de Tapia et le tubercule de la pomme de terre gratté est utilisé en cas de brûlure. Le criblage phytochimique des feuilles de Uapaca bojeri a permis de mettre en évidence plusieurs classes de métabolites secondaires : des polyphénols, des tanins condensés, des flavonoïdes dont des flavonols, des flavones et des leucoanthocyanes. Les alcaloïdes et les saponines sont présents aussi mais en faible quantité. Les différentes étapes ont conduit à l’obtention de deux produits. L’analyse structurale de l’un d’eux a permis de l’identifier au 2-(3,4-dihydroxyphényl)-5,7-dihydroxy-4-oxo-4Hchromèn-3-yl-β-D-glucopyranoside, connu sous le nom 3-O-β-D-Glucosylquercétol ou Quercimeritroside. Ce composé n’a pas encore été décrit dans une espèce du genre Uapaca. Les objectifs ont été ainsi atteints. L’activité antioxydante de cette molécule a été démontrée. Les activités des plantes d’Arivonimamo et Ambositra n’ont pas montré des différences significatives au niveau de leur propriété antioxydante. Ainsi, l’influence de la nature des sites d’implantation n’est pas importante. L’activité antioxydante de l’extrait total est faible pour la plante cultivée mais la molécule majoritaire et active y reste présente. Les plantes cultivées sont exploitables mais il faut tenir compte des concentrations des extraits à utiliser dans les formulations thérapeutiques et cosmétiques. Cette étude a permis un début de comparaison des métabolites de l’espèce Uapaca bojeri poussant sur trois sites différents. Une première évaluation de l’effet de sa mise en culture sur son profil phytochimique a également été effectuée. Une estimation de la possibilité de sonexploitation en tant que source de substances antioxydantes a été faite. Elle ouvre une perspective de recherche plus approfondie sur la composition chimique de la plante et également sur la variation de la quantité des principes actifs selon différents facteurs.
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Table des matières
DEDICACE
REMERCIEMENTS
LISTE DES ABREVIATIONS
LISTE DES FIGURES
LISTE DES TABLEAUX
INTRODUCTION
I. GENERALITES
I.1 GENERALITES SUR LA P LANTE
I.1.1 Description botanique de la plante
I.1.1.1 La famille des EUPHORBIACEAE
I.1.1.2 Le genre Uapaca
I.1.1.3 Uapaca bojeri
Description et distribution géographique
I.1.2 Utilisations traditionnelles de la plante
I.1.3 Etudes antérieures sur le genre Uapaca
I.2 GENERALITES SUR LES COMPOSES PHENOLIQUES
I.2.1 Les polyphénols
I.2.2 Les flavonoïdes
I.3 RAPPELS SUR QUELQUES TECHNIQUES DE LABORATOIRE
I.3.1 Les extractions
I.3.2 Criblage phytochimique
I.3.3 Isolement et purification
I. 3.3.1 Analyse Chromatographique
Chromatographie sur couche mince
Chromatographie sur papier
Chromatographie sur colonne Séphadex LH 20
I. 3.3.2 Spectroscopie de Résonance Magnétique Nucléaire
I.4 ACTIVITE ANTIOXYDANTE
I. MATERIELS ET METHODES
II.1 MATERIELS
II.1.1 Matériel végétal
II.1.2 Matériels de laboratoire
II.2 CRIBLAGE PHYTOCHIMIQUE
II.3.1 Préparation des extraits bruts
II.3.2 Identification des grandes classes des composés chimiques
II.3 Extractions
II.2.1 Extraction par solvant
II.2.2 Fractionnements par solvants
II.4 Isolement et purification dU produit p1
II.4.1 Chromatographie sur couche mince
II.4.2 Chromatographie sur papier
II.4.3 Chromatographie sur colonne Séphadex LH 20
II.5 identification structurale
II.6 ACTIVITE ANTIOXYDANTE
II. RESULTATS ET DISCUSSIONS
III. 1 CRIBLAGE PHYTOCHIMIQUE
III. 2 EXTRACTIONS
III. 3 ANALYSES CHROMATOGRAPHIQUES
III. 3. 1 Chromatographie sur couche mince
III. 3. 2 Chromatographie sur papier
III. 3. 3 Isolement et purification des produits
III. 4 ANALYSE STRUCTURALE DES PRODUITS P1 ET P2
III. 4. 1 Analyse préliminaire des deux produits
III. 4. 2 Analyse du produit P1
III. 4. 3 Interprétation des spectres RMN du produit P1
III. 5 ACTIVITE ANTIOXYDANTE
CONCLUSION
BIBLIOGRAPHIES
WEBOGRAPHIES
ANNEXES
RESUME
ABSTRACT
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