ETUDE CHI M I QUE ET TOXICOLOGIQUE DES TUBERCUL ES DE Dioscorea esculenta

UTILISATIONS DES Dioscorea

              L’igname constitue l’aliment de base de nombreux pays en Afrique occidentale et centrale, dans les Caraïbes et dans les îles du Pacifique. Plusieurs espèces d’ignames font déjà l’objet de culture dans ces pays et les méthodes de culture sont déjà maîtrisées par les populations. Parmi ces espèces figurent Dioscorea alata que l’on retrouve aussi à Madagascar, en particulier dans la partie orientale de l’Ile. Quelques espèces d’ignames sont impropres à la consommation à cause de leur amertume et de leur toxicité. Toutefois, il est bon de noter que les populations ont mis au point des techniques qui permettent à la fois de les détoxiquer et d’éliminer leur amertume. Des ignames sont aussi utilisées à des fins utiles autres qu’alimentaire. Certaines sont employées empiriquement pour soigner des maux d’estomac, des furoncles ou des brûlures, d’autres, pour chasser ou se débarrasser des animaux nuisibles. D’autres encore constituent des sources importantes de précurseurs à la synthèse de médicament comme les contraceptifs.

DONNEES SUR LES FACTEURS ANTINUTRITIONNELS DE Dioscorea  esculenta (MARTIN F.W., 1979)

              Les tubercules de Dioscorea esculenta renferment des facteurs antinutritionnels. Ces derniers sont surtout des phytates à 0,30%, des cyanides à 0,24%, des tanins à 2,50%, de l’oxalate à 11,36% pour 100 g de poids humide. Aucune activité toxique sur Dioscorea esculenta n’a cependant été rapportée dans la littérature. Toutefois, des études antérieures ont démontré que des poules pondeuses recevant une quantité importante de tubercules de Dioscorea esculenta dans leur ration alimentaire ont cessé de pondre et que l’enlèvement des tubercules a rétabli la ponte. (MARANON et coll., 1967).

RECOLTE ET PREPARATION DU MATERIEL

Récolte Les tubercules de Dioscorea esculenta ont été récoltés à Tamatave au mois d’août 2004.
Préparation du matériel végétal Les tubercules frais sont tranchés en lamelles qu’on sèche au soleil pendant 2 jours. Ces dernières sont réduites en poudre à l’aide d’un mixer de marque BLACK et DECKER. La poudre ainsi obtenue constitue le matériel végétal de départ. Elle est conservée à la température ambiante dans un récipient en plastique bien fermé.

Mise en œuvre de la dialyse

             L’extrait à dialyser est versé dans une portion de boudin de dialyse dont une extrémité est fermée par un nœud simple. Un deuxième nœud est ensuite confectionné à l’autre bout en laissant un espace tel que l’extrait occupe juste le tiers du boudin. Cette précaution permet d’éviter l’éclatement de la membrane par augmentation de volume de l’extrait au cours de la dialyse. Le boudin est immergé dans de l’eau distillée (liquide de contre-dialyse) dont le volume est environ 100 fois celui de l’extrait à traiter. Le tout est soumis à une agitation magnétique pour éviter la formation de gradient de concentration des substances diffusibles autour du boudin. Le liquide de contre-dialyse est renouvelé quatre fois pour accélérer les échanges. Au total, l’extrait est dialysé contre 500 fois son volume d’eau distillée. Au bout de 24 h, le volume de l’adialysat, liquide à l’intérieur du boudin et celui du dialysat, liquide à l’extérieur du boudin, sont ramenés au rapport 1/1 (p/v).

Les désoxyoses : Test de KELLER – KILLIANI (FONG et coll., 1977)

              Le résidu d’évaporation à sec de l’extrait à analyser est repris dans de l’eau distillée. 0,5 ml d’une solution aqueuse de FeCl3 (10 %) additionnée de 0,5 ml d’acide acétique glacial sont ajoutés dans 0,5 ml d’extrait. Après une légère agitation, 1ml d’acide sulfurique concentré est versé en inclinant le tube. La formation d’un anneau pourpre ou rouge à l’interface révèle la présence de désoxyoses.

DISCUSSION ET CONCLUSIONS

              Les trois techniques d’extraction éprouvées permettent toutes d’extraire les principes toxiques à partir de la poudre de tubercules de Dioscorea esculenta, mais la technique d’extraction au méthanol à chaud et à reflux s’est avérée la plus performante. Le procédé de purification adopté comprend trois étapes qui sont une précipitation par l’acétone, une dialyse et un fractionnement par le n-butanol de l’adialysat. Deux extraits toxiques suffisamment purifiés E3 et E4 ont été obtenus, avec un rendement en toxines respectivement de 1,80 % et de 0,81 % et un rendement de purification de 50 % pour E3 et de 22 % pour E4. E3 est plus homogène. En effet, son chromatogramme ne présente qu’une seule bande majeure, qui ne migre presque pas dans le solvant B/A/E. Cette immobilité pourrait être due à une polarité élevée de la molécule en question. Par contre, 4 bandes sont révélées pour E4.
Etude chimique : Les principes toxiques des extraits E3 et E4 sont solubles dans l’eau, dans le méthanol et le n-butanol ; ils sont thermostables et précipitables par l’acétone. Le résidu d’évaporation à sec de E3 se présente sous forme de poudre amorphe de couleur grisâtre, et celui de E4 sous forme de poudre marron hygroscopique. D’après le criblage phytochimique, les principes toxiques pourraient être des saponosides à génines stéroïdiques, mais à polarité différente. Ce résultat pourrait confirmer les études antérieures mentionnées non prouvées indiquant la présence de diosgénine dans les tubercules de Dioscorea esculenta (ANZALDO, 1956). Ces substances sont également responsables de la toxicité de plusieurs espèces de Dioscorea : Dioscorea poilanei ou Dioscorea hispida (DEGRAS, 1986).

Table des matières

INTRODUCTION GENERALE
PREMIERE PARTIE : POINT BIBLIOGRAPHIQUE
1-DESCRIPTION BOTANIQUE 
1.1-Description botanique du genre Dioscorea
1.2-Description de Dioscorea esculenta
2-UTILISATIONS DES Dioscorea …
3-DONNEES SUR LES FACTEURS ANTINUTRITIONNELS DE Dioscorea esculenta 
4-DONNEES SUR LES FACTEURS ANTINUTRITIONNELS DANS D’AUTRES Dioscorea 
DEUXIEME PARTIE : ETUDE CHIMIQUE
1-INTRODUCTION
2-MATERIELS 
2.1- Matériel végétal
2.1.1- Classification
2.1.2- Répartition géographique
2.1.3- Récolte et préparation du matériel végétal
2.1.3.1- Récolte
2.1.3.2- Préparation du matériel végétal
2.2- Produits chimiques
3-METHODES
3.1- Méthodes d’extraction
3.1.1-Extraction aqueuse à froid
3.1.2- Extraction à chaud
3.2- Méthodes de purification
3.2.1- Précipitation par l’acétone
3.2.1.1- Principe
3.2.1.2- Mode opératoire
3.2.2- Dialyse
3.2.2.1- Principe
3.2.2.2- Mode opératoire
3.2.2.2.1- Préparation de la membrane de dialyse
3.2.2.2.2- Mise en œuvre de la dialyse
3.2.3- Fractionnement par le n-butanol
3.2.3.1- Principe
3.2.3.2- Mode opératoire
3.3- Méthode de concentration
3.4- Calcul du rendement
3.5- Méthodes d’analyse
3.5.1- Chromatographie sur couche mince
3.5.1.1- Principe
3.5.1.2- Mode opératoire
3.5.1.2.1- Dépôt des échantillons
3.5.1.2.2- Solvant de développement
3.5.1.2.3- Révélation du chromatogramme
3.5.2- Réactions de détection des familles chimiques
3.5.2.1- Les anthraquinones (test de BORNTRÄGER)
3.5.2.2- Les triterpènes et stéroïdes
3.5.2.2.1- Test de LIEBERMANN-BURCHARD
3.5.2.2.2- Test de SALKOWSKI
3.5.2.3- Les flavonoïdes et leucoanthocyanes
3.5.2.3.1- Les flavonoïdes (test de WILSTATER (cyanidine))
3.5.2.3.2- Les leucoanthocyanes (test de BATE–SMITH)
3.5.2.4- Les saponines
3.5.2.5- Les tanins et les polyphénols
3.5.2.5.1- Test à la gélatine 1%
3.5.2.5.2- Test à la gélatine salée
3.5.2.5.3- Test au chlorure ferrique
3.5.2.6- Les désoxyoses (test de KELLER –KILLIANI)
3.5.2.7- Les alcaloïdes
3.5.2.7.1- Test de MAYER
3.5.2.7.2- Test de WAGNER
3.5.2.7.3- Test de DRAGENDORFF
3.5.2.8- Les iridoïdes
4- RESULTATS
4.1- Extraction
4.2- Purification
4.2.1- Précipitation par l’acétone
4.2.2- Dialyse
4.2.3- Fractionnement par le n-butanol
4.2.4- Homogénéité des extraits
4.2.5- Rendement de purification
4.3- Caractérisation chimique
4.3.1- Propriétés physico-chimiques
4.3.2- Nature chimique
5 – DISCUSSION ET CONCLUSION
TROISIEME PARTIE : ETUDE TOXICOLOGIQUE
1- INTRODUCTION
2- MATERIELS
2.1- Les animaux d’expérimentation
2.1.1- Les souris
2.1.2- Les larves de moustique
2.1.3- Les poissons
2.1.4- Les têtards
2.2- Les plantes d’expérimentation
2.3- Les souches microbiennes et les milieux de culture
2.3.1- Les souches microbiennes
2.3.2- Les milieux de culture
3– METHODES
3.1- Méthodes d’étude des effets sur les animaux
3.1.1- Etude des effets sur les animaux à sang chaud
3.1.1.1- Sur la souris
3.1.1.1.1- Estimation de la toxicité
3.1.1.1.2- Détermination de la DL50
3.1.1.1.3- Etude histo-pathologique
3.1.1.1.3.1- Prélèvement et fixation d’organe
3.1.1.1.3.1.1- Principe
3.1.1.1.3.1.2- Mode opératoire
3.1.1.1.3.2- Inclusion
3.1.1.1.3.2.1- Principe
3.1.1.1.3.2.2- Mode opératoire
3.1.1.1.3.3. Microtomie et étalement des coupes
3.1.1.1.3.4- Coloration des coupes et montage des lames
3.1.1.2-Test hémolytique sur les hématies de mouton
3.1.1.2.1- Principe
3.1.1.2.2- Mode opératoire
3.1.2- Test sur les animaux à sang froid
3.1.2.1- Estimation de la toxicité sur poissons
3.1.2.2- Estimation de la toxicité sur les autres animaux à sang froid
3.1.2.2.1- Mode opératoire
3.1.2.3- Détermination de la CL50
3.2- Méthodes d’étude des effets sur les végétaux
3.2.1- Etude des effets sur le pouvoir germinatif de graines
3.2.1.1- Principe
3.2.1.2- Mode opératoire
3.2.2- Détermination des effets sur la croissance des jeunes plantules
3.2.3- Détermination des effets sur le développement des bourgeons axillaires
3.3- Méthode d’étude des effets sur la croissance des microorganismes
3.3.1- Isolement et purification des germes
3.3.1.1- Isolement
3.3.1.2- Estimation de la pureté des colonies
3.3.2- Identification des germes
3.3.2.1- Méthode de coloration GRAM
3.3.2.2- Identification…
3.3.2.2.1- Milieu mannitol–mobilité–nitrate
3.3.2.2.2- Milieu HAJNA–KLIGLER (lactose–glucose)
3.3.2.2.3- Milieu SIMMONS (Citrate de sodium)
3.3.2.2.4- Milieu urée-indole
3.3.2.2.5- Milieu lysine-fer
3.3.3- Test anti-biogramme
3.3.3.1- Principe
3.3.3.2- Mode opératoire
3.3.4- Détermination de la concentration minimale inhibitrice (CMI)
3.3.5- Stérilisation
4- RESULTATS
4.1- Effets sur les animaux
4.1.1- Effets sur les animaux à sang chaud
4.1.1.1- Estimation de la toxicité sur souris
4.1.1.1.1- Description des symptômes d’intoxication
4.1.1.1.2- Examens histo-pathologiques
4.1.1.1.3- Effets de l’EB, E3 et E4 sur les hématies de mouton
4.1.2- Effets sur les animaux à sang froid
4.1.2.1- Effets de E3 sur Gambusia holbrooki
4.1.2.2- Effets de E3 sur les larves de moustiques
4.1.2.3- Effets de E3 et E4 sur les têtards de grenouille
4.2- Effets de l’extrait sur les végétaux
4.2.1- Effets sur le pouvoir germinatif de graines
4.2.2- Effets de l’extrait E3 sur la croissance de jeunes plantules
4.2.3- Effets de E3 sur le développement des bourgeons axillaires
4.3- Effets des extraits sur les microorganismes
4.3.1- Isolement et identification des germes
4.3.2- Recherche d’une activité antimicrobienne des extraits
5- DISCUSSION ET CONCLUSION
CONCLUSION GENERALE ET PERSPECTIVES
REFERENCES BIBLIOGRAPHIQUES
ANNEXES
LISTE DES TABLEAUX

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