ETUDE BIBLIOGRAPHIQUE DE L’ANGIOGENESE REACTIONNELLE DYSFONCTIONNEMENTS ET PERSPECTIVES THERAPEUTIQUES

Stratégies d’investigation

De façon non exhaustive, nous allons rappeler les principales stratégies utilisées en recherche fondamentale pour étudier les fonctions d’une molécule.
1. Protéines recombinantes
L’utilisation de molécules synthétiques est une approche simple qui consiste à cloner le gène d’intérêt et à synthétiser la protéine à partir de son ARN messager (Acide Ribonucléique). Le codage moléculaire est parfaitement connu et les acides aminés peuvent être assemblés selon ce code. La difficulté, pour les gènes eucaryotes, est de connaître les séquences codantes (exons) et non-codantes (introns) de la molécule. De plus, il existe des modifications posttranscriptionnelles qui peuvent parfois être essentielles à la fonction de la protéine. Une parfaite connaissance de sa structure est donc nécessaire avant de produire des molécules recombinantes. L’introduction d’un plasmide codant pour le gène d’intérêt dans des bactéries de type E. Coli ou dans des levures permet ensuite une production à grande échelle.
2. Anticorps monoclonaux neutralisants
L’immunisation d’un animal par la protéine purifiée permet de générer des anticorps polyclonaux, c’est à dire capable de reconnaître plusieurs épitopes de la protéine. La fusion des cellules B sécrétant ces anticorps avec des cellules B tumorales mais dépourvues de récepteur immunoglobuline permet d’obtenir, par sélection et dilution limite, des clones de cellules immortalisées sécrétant chacun un anticorps mono-spécifique, appelé monoclonal.
Certains anticorps sont dits « neutralisants » lorsque leur liaison à la protéine inhibe sa fonction (site actif d’une enzyme ou zone de liaison à un récepteur par exemple).
3. Deoxynucléotides antisens
Il s’agit de molécules de synthèse constituées de la réplique complémentaire de tout ou d’une partie d’un transcrit d’ARN messager : l’assemblage avec leur complémentaire ARNm empêche ce dernier d’être traduit en protéine par la machinerie cellulaire ribosomiale, d’où l’absence de production de la protéine [176].
4. Souris Knock Out ou transgéniques
Les souris « Knock Out » (KO) sont des souris chez lesquelles le gène codant pour une protéine donnée a été éliminé du génome par recombinaison homologue, c’est à dire que l’ADN (Acide Désoxyribonucléique) d’une cellule souche embryonnaire a été modifié et le gène d’intérêt excisé. La cellule souche est ensuite réintroduite dans un embryon de souris, et, si elle se localise au niveau de la lignée germinale (phénomène aléatoire), pourra donner naissance à un individu portant la délétion (2e génération). Ceci permet principalement d’appréhender la fonction du gène pendant l’embryogenèse, et plus tardivement, si la délétion n’est pas létale. Les souris transgéniques sont au contraire des souris chez lesquelles un gène a été ajouté ou modifié, ou encore dont on a modifié le profil d’expression en changeant tout ou partie de son promoteur.
5. Transfert de gène et thérapie génique
La thérapie génique permet une expression localisée et soutenue du transgène et limite les effets indésirables systémiques. Plusieurs vecteurs existent avec chacun des avantages et des inconvénients, mais ils ont tous en commun une cassette d’expression contenant un promoteur modulateur, le transgène d’intérêt et les signaux stop appropriés pour stabiliser l’ARNm.
L’ADN peut être transféré sous forme native par l’intermédiaire d’un plasmide : l’ADN d’intérêt est simplement intégré dans une structure circulaire. Il n’existe aucune limite de taille du transgène pour cette méthode de transfert. Il existe en fait trois méthodes d’administration : la délivrance sous pression du plasmide, le « gene guns » qui est une méthode favorisant la pénétration membranaire du plasmide par l’utilisation de particules servant de support pour le plasmide, et l’incorporation à des liposomes, substances détergentes ou encore acides-aminés lipophiles (poly-L-Lysine). Le plasmide est capté via les endosomes cellulaires, transporté vers les lysosomes et dégradé. Une faible proportion de l’ADN arrive jusqu’au noyau et se localise épichromosomalement, ce qui évite les risques d’altération du génome. L’efficacité de transfection est très faible, toutefois l’intérêt majeur réside dans son très faible pouvoir immunogène.
Au contraire, les vecteurs viraux sont très efficaces pour transférer leur matériel génétique vers le noyau des cellules infectées. Plusieurs types de virus sont utilisables pour le transfert de gènes :
• Les adénovirus sont des virus à ADN à double brin de 36 kb, entouré par une capside protéique. Ces vecteurs peuvent transporter des transgènes de 7,5 kb. Le gène transféré reste en position épichromosomale. La réponse immunitaire contre le virus limite la durée d’expression du transgène, ce qui, dans le cas d’une thérapeutique pro-angiogénique, peut être un avantage pour éviter les risques d’angiogenèse inappropriée.
• Les rétrovirus sont des virus à ARN qui contiennent une enzyme appelée reverse transcriptase qui convertit l’ARN viral en ADN lorsque le virus est entré dans la cellule. Cet ADN est intégré de manière aléatoire au génome de l’hôte lors de la réplication cellulaire (phénomène rare chez les cellules différenciées comme les cellules myocardiques). L’intégration au génome pose plusieurs problèmes : l’expression du transgène pendant toute la durée de vie de la cellule hôte, et le risque de mutagenèse. Ces problèmes limitent pour l’instant l’utilisation des vecteurs rétroviraux aux seuls modèles animaux.
• Les virus associés aux adénovirus (AAV) sont en fait membres de la famille des parvovirus. Ils contiennent de l’ADN simple brin qui peut contenir un transgène de 5 kb, suffisant pour la majorité des angiogènes candidats. Ces virus sont non-pathogènes pour l’homme et peu immunogènes. Ils s’intègrent de manière aléatoire au génome mais ne nécessitent pas des cellules qu’elles soient en phase de division.
La thérapie génique ex vivo consiste à prélever des cellules, à les transfecter en dehors de l’organisme puis à les réimplanter. En ce qui concerne les thérapies pro-angiogéniques, ce type de protocole ne se prête pas bien à la revascularisation cardiaque ou des membres, par contre, elle peut s’envisager dans le cas de transplantation d’organe où le cœur est perfusé ex vivo par l’angiogène pour éviter sa dissémination dans l’organisme.
Pour optimiser l’utilisation des molécules pro-angiogéniques, il est nécessaire de bien contrôler la voie d’administration et la cinétique de production du transgène. Les AAV, de par leur nature peu immunogène et donc leur persistance plus prolongée dans l’organisme, représentent un espoir de traitement plus efficace que les adénovirus. La combinaison optimale des facteurs reste à déterminer dans chaque situation. Pour la revascularisation cardiaque, Webster rapporte une synergie entre VEGF et bFGF (basic Fibroblast Growth Factor), VEGF et angiopoiétine-1, ainsi qu’entre VEGF et HGF (Hepatocyte Growth Factor) [194].
La sécurité est également une question majeure : la dissémination des molécules proangiogéniques pourrait favoriser la croissance d’une tumeur quiescente ou déclencher une rétinopathie. Or les patients cibles de cette thérapeutique regroupent des personnes âgées et des diabétiques, ce problème ne doit donc pas être ignoré.
Pour éviter les problèmes liés à la dissémination du transgène, l’utilisation d’un promoteur spécifique de molécules exprimées par les cellules endothéliales, comme par exemple le promoteur des pré-proendothélines (PPE-1) qui sont des peptides produits par les cellules endothéliales sous l’effet de l’hypoxie, des médiateurs inflammatoires ou de l’étirement des vaisseaux par la pression sanguine, pourrait servir à diriger l’expression des gènes d’intérêt vers les cellules endothéliales [189]. Webster suggère également l’utilisation d’un AAV, et un promoteur du gène d’intérêt comportant des séquences HRE (hypoxia response elements) activées par des HIF (« hypoxy inducible factors ») spécifiques des tissus visés par la thérapie génique. L’AAV est choisi pour son efficacité et sa capacité d’intégration au génome. Le gène serait donc latent en conditions normales d’oxygénation, et activé en cas d’ischémie [194].

Table des matières

Liste des Abréviations Introduction
I. Etude de l’angiogenèse
A. Définitions
1. Angiogenèse
2. Vasculogenèse
B. Les cellules impliquées
1. Les cellules endothéliales
2. Les péricytes
3. Les cellules musculaires lisse
4. Etapes de la formation d’un nouveau capillaire
C. Modèles d’étude
1. In vitro
a) Cellules endothéliales en monocouche
b) Matrigel ou gel de collagène
c) Bourgeonnement à partir d’anneaux aortiques
d) Essai de la membrane chorioallantoïdienne (CAM assay)
e) Limites des essais in vitro
2. In vivo
a) Essai de la membrane chorioallantoïdienne (CAM assay)
b) Vascularisation cutanée
(1) Matrigel
(2) Chambre transparente intra-cutanée
c) Vascularisation de l’œil
(1) Cornéenne
(2) Rétinienne
(3) Choroïdienne
d) Modèles d’ischémie musculaire
(1) Périphérique
(2) Cardiaque
e) Modèles tumoraux
(1) Murins
(2) Xénogreffe chez la souris immunodéprimée
D. Méthodes d’étude
1. Histologie et Immunohistochimie
2. Mesure du flux sanguin par microsphères
3. Micro-angiographie
4. Echographie et laser doppler
5. Imagerie par Résonance Magnétique (IRM)
E. Stratégies d’investigation
1. Protéines recombinantes
2. Anticorps monoclonaux neutralisants
3. Deoxynucléotides antisens
4. Souris Knock Out ou transgéniques
5. Transfert de gène et thérapie génique
II. Les médiateurs de l’angiogenèse
A. Les facteurs de croissance
1. VEGF (Vascular Endothelial Growth Factor)
2. FGF (Fibroblast Growth Factor)
3. HGF (Hepatocyte Growth Factor)
4. PAF (Platelet Activating Factor)
5. PD-ECGF/TP (Platelet Derived Endothelial Cell Growth Factor/Thymidine Phosphorylase)
6. PDGF (Platelet Derived Growth Factor)
7. Angiopoïétines
8. Somatostatine
9. Angiogénine
B. Les cytokines
1. Pro-angiogéniques
a) TNFα(Tumor Necrosis Factor-α)
b) Monoxyde d’azote (NO)
c) TGFβ (Transforming Growth Factor-β)
2. Anti-angiogéniques
a) Interleukines 12 et 18 (IL-12, IL-18)
b) Interférons
c) TNFα(Tumor Necrosis Factor-α)
d) TGFβ (Transforming Growth Factor-β)
C. Les chémokines
1. Pro-angiogéniques
2. Anti-angiogéniques
a) IP-10, MIG et I-TAC
b) PF4 (Platelet Factor-4)
D. Les molécules d’adhésion et de structure intercellulaire
1. Les molécules d’adhésion
a) Récepteurs de la laminine
b) Récepteurs de la vitronectine
2. Le système des protéases de la matrice extracellulaire
a) Les métalloprotéinases
b) Les inhibiteurs des métalloprotéinases
c) L’angiostatine et l’endostatine
3. Les thrombospondines (TSP)
III. L’angiogenèse : insuffisances et excès
A. Les anomalies de la cicatrisation
1. Physiologie de la cicatrisation
2. Anomalies liées au diabète
3. Les ulcères
B. Les anomalies du système circulatoire
1. Ischémie musculaire
a) Périphérique
b) Cardiaque
2. Athérosclérose
3. Maladies vasculaires de l’œil
a) La néovascularisation cornéenne
b) La néovascularisation de l’iris
c) Les rétinopathies
(1) rétinopathie de prématurité
(2) rétinopathie diabétique
d) La néovascularisation choroïdienne
C. Les inflammations chroniques
1. Polyarthrite rhumatoïde
2. Psoriasis
3. Maladies inflammatoires chroniques de l’intestin
4. Fibrose pulmonaire idiopathique
D. Les tumeurs
1. Historique et généralités
2. Indices de vascularisation, médiateurs et pronostic
a) Carcinomes du poumon
b) Carcinomes du tractus gastro-intestinal
c) Carcinomes du tractus urogénital et carcinomes mammaires
d) Cancers hématologiques
e) Sarcomes
IV. Essais thérapeutiques
A. Difficultés méthodologiques des essais
1. Pro-angiogenèse
2. Anti-angiogenèse
B. Composés physiologiques
1. Pro-angiogéniques
a) Protéines recombinantes
b) Thérapie génique
2. Anti-angiogéniques
a) IFN γ et TNFα
c) PF4
C. Inhibition des interactions et des signaux intracellulaires précoces
1. Blocage du VEGF
a) Oligodeoxynucléotides anti-sens
b) Anticorps monoclonaux anti-VEGF
c) Inhibiteurs des tyrosines kinases
2. Blocage du bFGF
a) Tecogalan sodium
b) Carboxyamidotriazole
3. Thalidomide
4. Blocage des intégrines
a) Vitaxine
b) Triflavine
D. Inhibition des signaux intracellulaires tardifs
1. Rétinoïdes
2. Bryostatin-1
3. Inhibiteurs des cyclo-oxygénases (COX)
4. Combretastatine A4
E. Inhibition des molécules de la matrice extra-cellulaire
1. Inhibiteurs des protéases
2. TNP-
Conclusion
Bibliographie

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