Etiologie des carcinomes broncho-pulmonaires 

Etiologie des carcinomes broncho-pulmonaires 

MATERIEL ET METHODES   

Etude épidémiologique

L’étude épidémiologique a été réalisée à partir des données et des prélèvements provenant de deux structures d’analyses médicales spécialisées. La première structure est dirigée par le Professeur Ahmed KACIMI au niveau du Service d’Anatomie et de Cytologie Pathologiques du Centre Hospitalo-universitaire Mohammed Seghir Nekkache d’Alger. La seconde structure est représentée par un Laboratoire d’Analyses Anatomopathologiques et dirigé par le Docteur Bahia MERAD.

Critères d’inclusion des patients

La sélection et l’inclusion de patients atteints de CBNPC dans la présente étude, devait impérativement tenir compte des critères suivants : Le sexe des patients sélectionnés ; L’âge des patients sélectionnés (détermination de l’âge d’atteinte tumorale si possible); L’historique médical pour chaque patient (connaissance de toute atteinte pulmonaire antérieure ou d’une exposition à des agents cancérigènes) ; La nature des échantillons prélevés et leur état de conservation (biopsies, tumeurs fraiches, tumeurs fixées dans du formol, tumeurs fixées dans du formol et incluse dans la paraffine (FFPE) ou échantillons cryo-préservés); La richesse de l’échantillon tumoral.

Description de la population sélectionnée

La réalisation de cette étude (Figure 07), a nécessité une consultation minutieuse d’environ 363 fiches de patients, destinés au diagnostic d’une pathologie pulmonaire tumorale. Ces derniers se subdivisent en deux lots (Tableau IV), provenant tous des deux structures d’accueil décrites précédemment. Le premier lot (Tableau IV) de patients est 3représenté par des prélèvements adressés du mois de Janvier de l’année 2008 jusqu’au mois d’Avril de l’année 2012. Tandis que le deuxième lot (Tableau IV) de patients issu du laboratoire de l’Ouest, a été sélectionné sur une période de 15 années d’exercice, allant de janvier 2015 à décembre 2009. En somme, un total d’environ 288 hommes et 41 femmes porteuses d’une pathologie carcinomateuse pulmonaire suspectée, ont été admis pour uneSexe dupatientTranched’âge(ans)Nombre depatientsTotal Période étudiée Région Centre étude histo-pathologique dans les deux structures durant une période de temps de 17 ans et 3mois. Il est cependant, important de signaler que certains prélèvements manquaient de renseignements (sexe et âge) et ne portait parfois que le patronyme du patient rendant ainsi l’opération d’échantillonnage difficile.
La sélection des patients a été réalisée sur la base du diagnostic fourni par la structure d’accueil. De ce fait, seuls les patients présentant un CBNPC ont été pris en charge par notreétude et plus précisément ceux atteints soit d’un carcinome épidermoide pulmonaire ou d’un adénocarcinome. Ces derniers représentent les deux types histologiques les plus fréquents des CBNPC. Ainsi, environ 17 cas d’ADK, 08 cas de carcinomes épidermoides, 01 cas de CBPC, 01 cas de carcinome à grandes cellules et 01 cas de sujet sain, ont été présélectionnés à partir de la structure hospitalière (1ier lot de patients). Cette présélection s’est vue réduite à 11 patients qui ont été concernés par l’étude génomique. Tandis, que seuls 37 des 45 cas de carcinomes épidermoȉdes présélectionnés dans la deuxième structure médicale, ont pu bénéficier d’une étude génomique. Concernant l’étude immunohistochimique, cette dernière a été essentiellement réalisée chez 08 cas d’ADK et 08 cas de carcinomes épidermoȉdes tous issus du 2ème lot de patients dans le but de confirmer le diagnostic différentiel. Alors que la sélection des patients du 2ème lot a été réalisée suivant le diagnostic déjà fourni par le médecin anatomopathologiste dans la fiche de renseignement.

Collecte des échantillons tumoraux

Lors d’une étude prospective ou rétrospective, plusieurs paramètres doivent absolument être pris en considération. Ceci nous a poussé a élaboré un questionnaire nommé « Fiche de dépistage » (tableau V) que nous avons renseigné soigneusement à partir des archives pour mieux visualiser la situation socioprofessionnelle et l’état clinique et pathologique de chaque patient.
Il est à noter qu’aucune action curative n’a été entreprise notamment concernant les traitements chirurgicaux, les cures de chimiothérapie ou de radiothérapie et les traitements ciblés tels que les TKI anti-EGFR. Cette dernière démarche avait pour but primaire de permettre la caractérisation des mutations somatiques responsables de l’enclenchement du processus tumoral chez les patients d’intérêt, avec éviction des mutations secondaires retrouvées dans le cadre d’une récidive après rémission totale ou d’une résistance aux traitements anti-EGFR.

Méthodes de prélèvement des échantillons tumoraux

Les prélèvements obtenus dans notre étude, sont tous représentés par des fractions de tumeurs fraiches ou de prélèvements biopsiques issus d’actes chirurgicaux ou biopsiques. Le compte rendu issu de l’examen macroscopique comporte plusieurs renseignementsnécessaires à l’étude histo-pathologique tels que la taille de la pièce reséquée ou de la biopsie avec identification précise, la taille de la tumeur et son aspect visuel (couleur, consistance), la présence ou non de nodules et la présence de prélèvements définissant les limites d’extension tumorale dans les tissus sains adjacents. Une fois la pièce disséquée, les prélèvements ont été effectués essentiellement au niveau de la tumeur, de la zone de jonction tumeur-tissu sain, sur les bronchioles proches de la lésion et sur l’ensemble des zones présentant un aspect suspect.
Une fois le prélèvement suspect obtenu, le diagnostic est confirmé par un examen anatomopathologique réalisé préférentiellement grâce à une étude histologique. Le bilan d’extension peut être réalisé de plusieurs façons et ceci au dépend de l’accessibilité de la tumeur pour un traitement locorégional ou non.
Il est important de signaler que les biopsies bronchiques et pulmonaires représentent des prélèvements de petite taille (micro fragments). Ces derniers ont été fixés dans une solution de formol à 10% et identifiés à l’aide d’une codification spécifique. Les pièces opératoires de lobectomie ou de pneumectomie ont été également fixées dans du formol à 10% ou dans du liquide BOUIN.

Etude Immunohistochimique (IHC) des CBNPC

Cette étude a été réalisée dans le laboratoire de Biologie du Développement et de la Différenciation à la Faculté des Sciences de la Nature de l’Université Oran 1, Ahmed Ben Bella d’Oran, Algérie, dirigé par le Professeur EL KEBIR Fatima Zohra. En pratique, chaque prélèvement obtenu a été soumis, par mesure de précaution, à une confirmation du type histologique concernant l’ensemble des patients admis dans cette étude. De ce fait, nous avons jugé utile et nécessaire de refaire l’étude histologique que nous avons soigneusement supplémenté par le marquage immunohistochimique (IHC) à l’aide d’un panel d’anticorps monoclonaux spécifique et ceci pour la quasi-totalité des patients (16 des 25 patients présélectionnés pour le 1ier lot). Certains cas ont été obtenus en dernier lieu et ont toutefois fait l’objet d’une relecture pour confirmation du type histologique.

Description des échantillons recueillis

Dans notre étude, les prélèvements tumoraux ont été collectés à partir d’échantillons tissulaires fixés dans du formol à 10% et inclus dans la paraffine (FFPE). Nous avons également obtenu d’autres prélèvements inclus dans du liquide BOUIN à partie du Laboratoire de Diagnostique Cytopathologique de l’Ouest. Les blocs FFPE spécifiques à chaque patient ont été soigneusement sélectionnés sur la base de l’existence d’un fragment de nature tumorale et non d’un tissu sain ou de jonction tumeur-tissu sain.

Description de la technique histologique utilisée

L’étude histologique a nécessité la préparation de coupes tissulaires avec une épaisseur de 2 à 3µm. Cette étude a été réalisée suivant la technique dite « standard », suivant des étapessuccessives décrites comme suit : 1- Fixation : les prélèvements obtenus ont été fixés dans 2 bains de formol à 10% ayant un pH neutre.
2- Déshydratation : les échantillons fixés sont déshydratés puis inclus dans de la paraffine. La déshydratation se fait par inclusion des échantillons dans plusieurs bains d’alcool à concentrations croissantes 75%, 80%, 85%,90%, 95% et 100% chacun durant 1H, sauf pour le dernier (1H30mn). Les échantillons sont ensuite placés dans 3 bains de xylène chacun durant 1H, le dernier à 1H30mn. La dernière étape consiste à mettre les échantillons dans 2 bains de paraffine à une température de 56 à 60°Cchacun durant 3H dans le but d’enlever l’excès de xylène imprégné déjà dans les tissus.

3- Inclusion en paraffine: cette étape est très importante car elle confère une résistanceprotégeant ainsi les blocs tissulaires de la pression exercée par l’arête du microtome qui peut entrainer la détérioration des tissus lors de la coupe. La paraffine a été liquéfiée (température de fusion 45 et 70°C) puis distribuée dans des moule métalliques contenant chacun un fragment tissulaire bien centré à l’aide d’un distributeur de paraffine. L’étape de collage des cassettes en plastiques a été réalisée immédiatement après distribution de la paraffine. Les blocs ont été ensuite mis à congélation (-20°C) pour faciliter la consolidation de la paraffine.
4- Confection de coupes histologique : Les coupes histologiques sériées d’une épaisseur de 5µ sont obtenues à l’aide d’un microtome et montées sur lame histologique propre et séchées prêtes à être colorées.
5- Confection de coupes à usage immunohistochimique : cette étape a été réalisée dela même façon que l’étape précédente mais les coupes sont d’épaisseur plus fine, 2 à 3µ et collées sur des lames prétraitées par le silane.
6- Coloration des coupes histologiques : cette étape a été réalisée à l’aide d’une coloration Hématoxyline-éosine (HE) qui permet la mise en évidence des noyaux colorés en violet par l’hématoxyline (substance basique) et celle du cytoplasme coloré en rose par l’éosine aqueuse (substance acide). Les lames ont été ensuite observées àl’aide d’un microscope photonique à différents grossissements.

Méthodologie de l’immunomarquage

Différentes méthodes d’immunomarquage ont été utilisées dans le but de localiser les antigènes d’intérêt et d’établir un diagnostic précis établissant la thérapeutique devant être adoptée. Ces marquages ont été effectués sur des coupes tissulaires incluses en paraffine.  La méthode directe ;  La méthode indirecte ; La méthode en 3 couches (en sandwich) ;  La méthode complexe enzyme – anti-enzyme (PAP ou APAAP) ;  La méthode basée sur le complexe avidine-biotine.

Description de la techniques immunohistochimique adoptée

Toutes les techniques immunohistochimiques (IHC) ont pour but de mettre enévidence des protéines sur des coupes tissulaires ou des étalements cytologiques, grâce à une réaction antigène-anticorps. La majorité des techniques d’IHC utilisées dans le Laboratoire de Biologie du Développement et de la Différenciation de l’Université Oran 1, Ahmed Ben Bella, suivent une procédure de marquage compatible avec le kit « EnVision™ + » (Dako). Ce dernier s’appuie sur une méthode polymérique (Figure 08), basée essentiellement sur la technologie des dextrans. Cette technologie unique dans son genre, permet à de nombreuses enzymes (horseradish peroxidase ou une phosphatase alkaline) de se lier à un anticorps secondaire via une colonne de dextrans.

Table des matières

INTRODUCTION
I- Rappels bibliographiques 
I-1. Histologie de l’arbre broncho-pulmonaire
I-2. Classification des carcinomes broncho-pulmonaires
I-3. Etude histopathologique du cancer du poumon
I-4. Etude épidémiologique et prévalence du cancer pulmonaire
II-Etiologie des carcinomes broncho-pulmonaires 
II-1. Cancérogenèse, historique et éventuelles implication
II-1-1. Tabac et cancer pulmonaire – Données épidémiologiques
II-1-2. Dérivés du tabac et cancérogenèse
II-1-3. Politique de lutte anti-tabac
II-2. Les polluants cancérigènes
II-3. Autres facteurs de risque
II-4. Facteurs professionnels et cancer du poumon
II-5. Radioactivité et cancer du poumon
III-Facteurs génétiques et cancérogenèse moléculaires des carcinomes broncho-pulmonaires
III-1. Le récepteur de facteurs de croissance épidermique, EGFR
III-1-1. Description structurelle de l’EGFR
III-2. Description fonctionnelle et voies de signalisation cellulaire de l’EGFR
III-3. Les voies de signalisation de l’EGFR
III-3-1. Les protéines à domaine Src Homology Region 2 et 3
III-3-2. La voie Growth Factor Receptor Bound-son of sevenless-Ras
III-3-3. La protéine Ras ou p21Ras
III-3-4. La cascade des Mitogen Activated Protein kinases (MAP kinases)
III-3-5. La voie de la phosphatidylinositol 3 kinase (PI3K)
III-3-6. La voie JAK, Janus kinase-Signal Transducer and Activator of Transcription
III-4. Identification des mutations touchant le gène EGFR
III-5. Description du profil des patients porteurs des mutations de l’EGFR
III-6. Les différents modulateurs de l’activité de l’EGFR
III-6-1. Amplification du gène EGFR
III-6-2. La surexpression du gène EGFR 5714
III-6-3. Amplification génique versus surexpression du gène EGFR 57
III-7. Inventaire des mutations activatrices de l’EGFR
III-8. Inventaires des altérations géniques caractéristiques des carcinomes
broncho-pulmonaires
III-9. Prédisposition génétique aux cancers pulmonaires
IV-Dépistage du cancer pulmonaire 
IV-1. Radiographie du thorax
IV-2. Tomodensitométrie thoracique avec injection (Scanner, TDM) :
IV-3. Tomographie par émission de positons au 18FDG (TEP)
V-Evaluation histopathologique des cancers pulmonaires
V-1. Les cytokératines
V-1-1. Rôle des cytokératine 5/6 dans le diagnostique pathologique
V-2. Facteur de transcription nucléaire tissu spécifique, TTF-1
V-3. EGFR et phénomène de surexpression histopathologique
VI-Méthodes de traitement des carcinomes pulmonaires 
VI-1. Classification des stades tumoraux
VI-2. Traitement chirurgical des CBNPC
VI-3. Notion générale sur les protocoles chimiothérapiques
VI-4. La radiothérapie
VI-5. Intérêt des traitements anti-angiogéniques
VI-6. EGFR et thérapie ciblée
VI-7. Résistance aux thérapies ciblant l’EGFR
VI-8. Relation entre le statut mutationnel de l’EGFR et le pronostic vital
VI-9. Cancers pulmonaires, métastases et survie globale
MATERIEL ET METHODES
I-.Etude épidémiologique 
I-1. Critères d’inclusion des patients
I-1-1. Description de la population sélectionnée
I-1-2. Collecte des échantillons tumoraux
I-1-3. Méthodes de prélèvement des échantillons tumoraux
II-Etude Immunohistochimique (IHC) des CBNPC 
II-1. Description des échantillons recueillis
II-2. Description de la technique histologique utilisée
II-2. Méthodologie de l’immunomarquage
II-2-1. Description de la techniques immunohistochimique adoptée
II-2-2. Description des anticorps utilisés
II-2-3. Etapes détaillées de la technique immunohistochimique
III-Etude génomique du récepteur de facteurs de croissance épidermique,EGFR
III-1. Méthodologie de la recherche des mutations du gène EGFR
III-1-1. Sélection des échantillons destinés aux études génomiques
III-1-2. Stratégies de détection des mutations de l’EGFR
III-2. Description de la technique d’étude du gène EGFR
III-2-1. Sélection avancée des patients
III-2-2. Mise en tube des prélèvements tumoraux
III-2-3. Protocole d’extraction des échantillons FFPE
III-2-4. Protocole de quantification de l’ADN génomique
III-2-5. Protocole d’amplification de l’ADN par PCR
III-2-5-1. Le design des amorces
III-2-5-2. Etapes de polymérisation en chaine de l’ADN, PCR
III-2-6. Protocole d’électrophorèse sur gel d’Agarose
III-2-7. Protocole de purification des produits amplifiés
III-2-7-1. Etapes de purification requises
III-2-8. Protocole d’analyse des mutations du gène EGFR
III-2-8-1. Principe de la technique du BigDye terminator
III-2-8-2. Protocole détaillé du séquençage d’ADN
III-2-8-2-1. Traitement des échantillons par le Sodium Dodécyl Sulfate (SDS)
III-2-8-2-2. Purification des produits amplifiés sur des colonnes spécialisée
III-2-8-2-3. Analyse des données génétique
RESILTATS
I-Résultats de l’étude épidémiologique 
I-1.Evaluation du flux de prélèvements
I-1-1.Nombre d’exérèses adressées
I-1-2.Nombre de Prélèvements biopsiques
I-1-3.Nombre d’analyses cytologiques
I-2.Evaluation du stade tumoral
I-3.Evaluation de la distribution des carcinomes pulmonaires
I-4.Evaluation de l’âge d’atteinte des CBNPC
II-Résultats de l’étude Histologique et Immunohistochimique 
II-1. Résultats Histologiques et Histopathologiques
II-2. Résultts de l’étude Immunohistochimique
II-2-1. Aspect du marquage immunohistochimique de l’EGFR
II-3. Aspect du marquage immunohistochimique des cytokératines
III- Résultats de l’étude génomique 
III-1. Résultats de la quantification d’ADN nucléaire
III-1-1. Variabilité de la quantité d’ADN
III-1-2. Evaluation du degré de pureté de l’ADN
III-2. Résultats des migrations électrophorétiques
III-3. Analyse des séquences génomiques
III-3-1. Résultats de l’analyse d’une partie de l’exon 1/Promoteur du gèneEGFR
III-3.2. Résultats de l’analyse de distribution du dinucléotide CA dans l’intron
III-3-3. Résultats de l’analyse de la région Tyrosine Kinase
III-3-3-1. Résultats de l’amplification de l’exon 18
III-3-3-2. Résultats de l’amplification de l’exon 19
III-3-3-3. Résultats de l’amplification de l’exon 20
III-3-3-4. Résultats de l’amplification de l’exon 21
III-3-4. Bilan des variations retrouvées dans le gène EGFR
III-3-4-1. Bilan des variations géniques chez le patient sain
III-3-4-2. Bilan d’existence des polymorphismes génétiques en fonction du sexe
III-3-4-3. Bilan des variations génétiques dans les adénocarcinomes pulmonaires
III-3-4-4. Bilan des variations génétiques dans les carcinomes épidermoides pulmonaires
III-3-4-5. Bilan des variations génétiques chez le sujet atteint de CBPC
DISCUSSIONS
I-Etude épidémiologique rétrospective 
II-Marquage immunohistochimique 
III-Etude génomique du récepteur de facteur de croissance épidermique, EGFR
CONCLUSION ET PERSPECTIVES

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