ETHOLOGIE ET BIOLOGIE D'AN. MASCARENSIS

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ECHANTILLONAGE

Capture de nuit sur homme

Les moustiques femelles agressifs sont le plus souvent capturés par cette technique qui permet aussi d’analyser les variations d’abondance horaire. Les captures ont été effectuées simultanément au niveau de 5 postes de capture à l’extérieur et à l’intérieur des maisons. Cette méthode permet de déterminer l’endo/exophagie des moustiques.

Capture au repos

La méthode est effectuée au lever du jour (à 6 heures du matin). Les moustiques endophiles qui restent dans les maisons sont tués par pulvérisation d’insecticide.

Piège O.B.E.T (Odor Baited Entry Traps)

Des tentes servent de piège pour attraper les moustiques qui sont attirés par l’odeur des mammifères. Deux tentes sont juxtaposées, dans le premier un homme dort sous un moustiquaire; dans le second, un veau y est placé. Cette méthode permet de déterminer la préférence trophique des moustiques (DUCHEMIN et al, 2001).

Identification d’An. mascarensis

Les moustiques capturés vivants sont tués au chloroforme puis identifiés sous loupe binoculaire en utilisant les clés de détermination décrites par GREJBINE (1966).
Critères de détermination d’An. mascarensis (Figure 3 et Figure 4)
Après avoir identifié les moustiques comme étant des Anopheles, ceux qui correspondent à tous les critères suivants sont des An. mascarensis.
– Aile avec au moins 4 tâches pâles sur la costa et la nervure 1, tache apicale incluse (moitié basale de la costa pas entièrement sombre)
– Troisième zone sombre principale de la nervure 1 interrompue par une tache pâle
– Segments abdominaux sans touffes latérales d’écailles saillantes
– Pattes non tachetées de pâles mais pouvant avoir des anneaux ou segments entièrement pâles
– Pas de tache pâle préapicale sur le fémur postérieur, articles 1-4 des tarses avec anneau apical pâle
– Segments 4 et 5 des tarses postérieurs au moins partiellement sombres

Traitement et conservation des moustiques

Après identification, les moustiques à jeun ont été conservés individuellement dans des micro-tubes tandis que les moustiques gravides étaient disséqués pour conserver séparément les ovaires. Chaque tube porte un numéro d’identification individuel, également recopié sur un cahier de capture.
Trois méthodes de conservation ont été utilisées selon les besoins ultérieurs.
• Conservation en azote liquide : les moustiques étaient placés dans des micro-tubes avant de les plonger dans de l’azote liquide. C’est le moyen de conservation idéal, il est surtout utilisé pour la technique des iso-enzymes. Les moustiques peuvent être conservés pendant un temps relativement long sans dégrader l’ADN. La conservation en azote liquide convient donc
à toutes les techniques PCR.
• Conservation à sec : les moustiques étaient placés dans un tube avec du gel de silice. L’humidité est absorbée par les grains de gel de silice. L’ADN peut être utilisé pour les PCR. Le moustique ne se décompose pas dans le tube à sec. Les ailes, les pattes et les palpes étaient intacts et ont pu être utilisés en morphométrie.
• Conservation en plaques ELISA : cela concerne le plus souvent les moustiques qui ont été disséqués. Les plaques sont transportées dans une boîte étanche contenant du gel de silice. Mais il ne faut pas oublier que la dissection de l’abdomen des moustiques s’effectue souvent sur une même lame. Si c’est le cas, la contamination croisée entre les moustiques est inévitable. Ils sont donc exclus surtout pour la RAPD. Par contre, les tests ELISA CSP ne sont pas compromis car la tête et le thorax ne sont pas touchés par la dissection.

TECHNIQUES PCR

Extraction

But

Le but est d’obtenir de l’ADN pur. L’extraction consiste en une série de séparation physique et chimique de l’ADN des différentes particules contenues dans la cellule. L’extraction ne doit pas cependant altérer l’ADN.
L’optimisation de la technique d’extraction consiste à tester différentes méthodes pour l’extraction d’ADN de moustiques. Cette étape permet de comparer les rendements et la faisabilité de chaque technique d’extraction pour la RAPD-PCR.

Principe

Les tissus cellulaires sont broyés manuellement pour que les détergents puissent agir au niveau des cellules.
L’application d’une très forte accélération sépare les molécules de poids moléculaires différents et élimine les débris cellulaires. A la fin de l’extraction, on obtient les acides nucléiques purifiés des autres molécules comme les protéines et autres macro-molécules.

Protocoles testés

Deux protocoles ont été testés, le premier protocole est le plus utilisé, utilisant le phénol-chloroforme (MARY et al, 1992) et l’extraction est effectuée à partir d’un moustique entier (ANNEXE I). Le deuxième protocole d’extraction testé est celui décrit par CORNEL et al (1996). Le protocole utilise 3 pattes de moustiques uniquement (ANNEXE I).

RAPD-PCR

But

Le but est d’amplifier (obtenir un grand nombre de copies) au hasard un ou plusieurs fragments de l’ADN. Les fragments amplifiés sont les séquences encadrées par les amorces utilisées.
L’optimisation de la technique RAPD-PCR réside dans l’essai de 26 amorces et l’amélioration de la reproductibilité de la PCR.

Principe

La PCR ou Polymerase Chain Reaction repose sur le mécanisme de réplication de l’ADN matrice. Mais la propriété de la double hélice d’être dénaturée de manière réversible à 94°C est une condition indispensable à la PCR. Les amorces oligonucléotidiques s’hybrident aux sites qui leur correspondent grâce à la complémentarité des bases azotées. Une enzyme Taq Polymerase thermorésistante assure l’élongation de la chaîne polynucléotidique. Les amorces de 10 à 25 nucléotides délimitent les zones qui sont amplifiées. Les produits de la PCR sont connus après électrophorèse et révélation.

Les étapes de la PCR

L’ADN bicaténaire est dénaturé à 94 °C pendant 1 minute. La baisse rapide de température à 45 °C va permettre aux amorces (et uniquement aux amorces) de s’hybrider spécifiquement sur les séquences qui leurs sont complémentaires de part et d’autre des deux brins séparés pendant 1 minute. La polymérisation des nucléotides (phase d’élongation) à la suite des amorces est effectuée par l’enzyme Taq polymerase à 72 °C pendant 2 minutes.

Particularité de la technique RAPD

Dans la solution de réaction, on utilise une seule amorce de même séquence. Tandis que pour les autres techniques PCR, un couple d’amorces de séquences différentes encadrent la zone à amplifier. En RAPD, l’amplification se fait au hasard. Les amorces n’ont pas été conçues pour amplifier une séquence pré-déterminée. Les produits d’amplification ne sont pa prévisibles avant un PCR : le nombre de fragments différents et la taille des fragments, mais ils doivent être reproductibles pour l’analyse. On doit retrouver les mêmes produits d’amplification pour un même spécimen pour des réactions différentes d’un même RAPD-PCR.

Réactifs et conditions physiques de la PCR

ADN

L’ADN est le matériel d’étude. Il doit être avant tout intact pour que la PCR puisse se dérouler normalement. La quantité d’ADN optimale est l’un des plus importants paramètres chimiques. Elle a été déterminée par la gamme de dilution suivante : 2,5 ; 5 ; 10 ; 20 et 50 fois.

Enzyme Taq Polymerase

Deux enzymes de marques différentes ont été testés. Le premier est fabriqué par Pharamacia Biotech et le second par QIAGEN. La quantité d’enzyme utilisée est de 0,5 U dans 12,5 µl de solution réactionnelle.

Tampon de réaction

Il assure le maintien du pH tout au long de la PCR à l’aide du Tris HCl et de l’EDTA. Les réactions peuvent alors se dérouler dans des conditions chimiques stables et optimales. Les kits d’enzyme Taq polymerase sont fournis avec les réactifs suivants : enzyme Taq polymerase, MgCl2, tampon de réaction . Ils ont variés pendant l’optimisation car les kits d’enzyme ont été différents.

dNTP (Désoxyribonucléotide)

La solution de dNTP contient les nucléotides suivants : dATP, dTTP, dGTP, dCTP. Ils seront polymérisés les uns à la suite des autres par l’enzyme Taq Polymerase. Si la quantité de dNTP est insuffisante la PCR s’arrête par épuisement avant la fin du programme d’amplification. Une concentration trop élevée favoriserait les appariements non-spécifiques.

MgCl2

L’ion Mg2+ est un catalyseur dans la réaction de polymérisation des dNTPs. Une concentration trop élevée en ion Mg2+ entraîne la formation de produits non spécifiques. Dans le cas contraire où la concentration est faible, la polymérisation des nucléotides ne peut pas s’effectuer. La concentration de Mg2+ est un paramètre important pour le bon déroulement des PCR. Cet ion est présent à une concentration de 1,5 mM dans le tampon de réaction.

Solution Q-sol (QIAGEN)

C’est une solution dénaturante. Elle élimine la formation des conformations secondaires. Celles-ci peuvent empêcher l’hybridation et la polymérisation au niveau de certaines séquences. L’optimisation de la technique consiste à tester les PCR en présence et en absence de la solution.

Amorces :

Dans la plupart des cas, les séquences sont choisies par hasard. Mais il ne faut pas qu’une amorce soit complémentaire avec elle même. Pour la mise au point de la technique, 24 amorces ont été testées. Les amorces constituées de 24, 25, 26 paires de base et les amorces décameriques (10 paires de base) ont été décrites respectivement par BARUFFI et al (1995), et DIMOPOULOS et al (1996).

Programme d’amplification

L’optimisation de cette étape consiste à trouver la meilleure température d’hybridation par gamme de température à partir d’un minimum de 35 °C (seuil de température d’hybridation théorique pour une amorce décamérique) jusqu’à 55 °C (température d’hybridation théorique la plus élevée pour une amorce de 25 paires de bases). La méthode de calcul thermodynamique ne donne pas de valeur de température d’hybridation qui convient aux conditions de réactions utilisées.

L’optimisation du programme consiste aussi à essayer 3 programmes de 35, 40 et 45 cycles chacun afin de déterminer le nombre de cycle adéquat à la RAPD-PCR.

Protocole

Préparation du tampon de réaction

Le tampon de réaction contient tous les éléments nécessaires aux réactions chimiques. Cette solution doit être préparée dans une pièce spécialement réservée à cet effet (ANNEXE II).

Toutes les manipulations doivent s’effectuer sur de la glace pilée. Les solutions de travail utilisées pour la PCR sont décongelées juste avant leur utilisation. Les solutions de travail d’amorces et d’ADN doivent être décongelées lentement sur de la glace pilée surtout quand la température ambiante est supérieure à 25 °C. La solution d’ADN est ajoutée à la fin de la préparation.

Amplification

L’amplification se fait immédiatement après la préparation de la solution mix. Le thermocycleur utilisé pour l’optimisation et la routine est un GENIUS Techne® à effet Peltier (ANNEXE II).

Témoin négatif

Le témoin négatif permet d’affirmer la non-contamination des solutions réactionnelles.

De l’eau distillée filtrée remplace l’échantillon d’ADN à amplifier.

Conservation

Les amplifiats sont conservés pendant une nuit à + 4 °C. Les amplifiats ne doivent en aucun cas séjourner ou traverser les pièces pré-PCR (salle d’extraction et pièce mix) pour éviter les contaminations.

Electrophorèse

But

On cherche à distinguer les différents fragments amplifiés au cours de la PCR. L’électrophorèse sépare les fragments et permet ainsi de déterminer la taille et la présence/absence des bandes.

Principe

Les groupements phosphates servant de pont dans les chaînes polynucléotidiques sont chargés négativement. L’application d’un champ électrique entraîne le déplacement des fragments d’ADN vers le pôle positif.

Selon le calibre des mailles constituées par les molécules d’agarose, les mailles retiennent les molécules en fonction de leur taille. Les molécules de petite taille traversent plus vite les mailles tandis que les molécules de taille plus grande passent lentement. La vitesse de migration des molécules dépend donc de leur taille.

Les molécules seront ainsi séparées selon leurs poids moléculaires. Cependant, le type d’électrophorèse en agarose utilisé ne permet pas de distinguer les molécules de même taille dont les séquences sont différentes.

Protocole

Migration

Le gel est préparé à partir de TBE 0,5X et d’agarose en poudre. La maille du gel est à 1,2 %. Les amplifiats sont déposés dans les puits (12,5 µl / puits) après avoir été mélangés avec du bleu de charge (2,5 µl / puits).

Le générateur est programmé à 100 V, 100 mA pour 2 heures de migration. Quand le programme est terminé, on retire soigneusement le gel du moule.

Photographie

Le gel est déposé sur le transilluminateur à UV ( = 312 nm). Grâce aux molécules de bromure d’éthidium qui s’intercalent entre les brins d’ADN, ceux-ci se révèlent au passage des rayons UV et impriment sur une pellicule photographique.

SAISIE DES DONNEES

Les bandes observées ont été enregistrées dans une matrice présence absence. Les bandes visibles à l’œil nu seront notées 1 et l’absence de bandes 0. Pour cela les marqueurs de taille permettent de déterminer la taille des fragments. Seules les bandes polymorphes serviront dans l’analyse. Les bandes monomorphes ne présentent aucune différence entre les individus et ne permettent pas de différencier les populations.

ANALYSES DES DONNEES

Les données ont été analysées par deux méthodes distinctes:

– l’analyse statistique qui est basée sur les présences et les absences de bandes

– et l’analyse génétique.

Pour pouvoir utiliser les résultats des RAPD-PCR pour des analyses génétiques, il faut poser les hypothèses suivantes :

– les marqueurs sont dominants : les homozygotes dominants et les hétérozygotes sont représentés par la présence de bandes

– les bandes présentes à une même taille pour la même amorce représentent un seul allèle

– l’absence de bandes à une même taille pour la même amorce indique le même allèle récessif au niveau de la région homologue à l’amorce

– les fréquences génotypiques sont réparties suivant l’équilibre de Hardy-Weinberg. Cela implique l’acceptation du modèle de panmixie.

Variabilité génétique

La fréquence q d’un allèle récessif pour une population à un locus donné est calculée par : q = (R/n)1/2 où R est le nombre de bandes absentes et n le nombre total d’individus.

Comme p+q = 1 alors la fréquence de l’allèle dominant est p = 1 – q. En utilisant l’hypothèse que les fréquences génotypiques soient réparties suivant l’équilibre de Hardy-Weinberg, nous avons les fréquence génotypiques suivantes p2 pour homozygotes dominants, 2 pq pour les hétérozygotes et q2 pour les homozygotes récessifs.

Après avoir calculé les fréquences alléliques avec RAPDBIOS 2.0, le logiciel BIOSYS-2 est utilisé pour procéder rapidement aux calculs de l’hétérozygotie.

Déséquilibre de liaison

Le terme « déséquilibre de liaison » (LEWONTIN & KOJIMA, 1960) se réfère à l’association non aléatoire d’allèles pris à des loci différents. Le phénomène de déséquilibre peut s’observer entre loci non liés. Ces liaisons sont à considérer dans les résultats obtenus par les calculs d’ordres génétiques. Le programme RAPDLD calcule les liaisons deux à deux entre les gènes. Le calcul du déséquilibre permet aussi d’identifier l’existence d’épistasie, quand plusieurs loci sont responsables d’un seul caractère.

Statistiques-F

Les logiciels RAPDFST et BIOSYS-2 permettent de calculer rapidement les valeurs des statistiques-F.

On estime le degré de subdivision d’une population au moyen de statistiques-F définies par Wright (1943). Ces statistiques correspondent aux corrélations de gènes pris à un certain niveau de subdivision par rapport à des gènes pris à un niveau supérieur de subdivision. Le coefficient de consanguinité f =FIS peut être exprimé comme la corrélation de deux gènes à l’intérieur d’un individu par rapport à deux gènes pris au hasard dans une subdivision (dans un dème). On peut définir des corrélations similaires pour des niveaux de subdivision supérieurs. On définit ainsi FST comme la corrélation de deux gènes pris dans une subdivision par rapport à deux gènes pris au hasard dans la population totale et FIT comme la corrélation de deux gènes d’un individu par rapport à deux gènes pris au hasard dans la population totale.

Les FST sont calculés à partir des fréquences alléliques suivant la formule (WRIGHT, 1943) : F  var( p) ST p(1p)

Où p est la fréquence d’un allèle à un locus RAPD et la moyenne p est une moyenne pondérée de la fréquence. La statistique FST est donc la variance observée des fréquences alléliques sur la variance attendue.

Les autres valeurs de statistiques-F sont calculées à partir de la relation : (1-FIT) = (1-FIS)(1-FST)

Distances géographiques

Elles sont calculées entre les sites à partir des coordonnées géographiques. Le logiciel Progiciel R4 effectue ce calcul.

Distances génétiques

Il est des plus utiles, en génétique des populations, de pouvoir quantifier les différences génétiques entre les populations par les fréquences de leurs gènes. En effet, ceci permet d’ordonner les populations selon des procédures de classification automatique ou de regroupement hiérarchique, et d’interpréter ainsi leurs affinités génétiques dans un contexte évolutif. Cette quantification des différences génétiques se traduit par le calcul de distances ou d’indices de similarité entre populations.

Les données présence/absence doivent être transformées par RAPDBIOS pour obtenir les fréquences alléliques et les fréquences génotypiques. Avec le logiciel BIOSYS-2, le calcul des distances génétiques entre les populations s’effectue facilement.

Il existe plusieurs formules décrites par différents auteurs dans le calcul des distances génétiques.

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Table des matières

INTRODUCTION
JUSTIFICATION DE L’ÉTUDE
GENERALITES
I- POSITION SYSTEMATIQUE D’AN. MASCARENSIS
II- ETHOLOGIE ET BIOLOGIE D’AN. MASCARENSIS
III- REPARTITION GEOGRAPHIQUE D’AN. MASCARENSIS
MATERIELS ET METHODES
I- PRESENTATION DES SITES D’ETUDE
II-1- Capture de nuit sur homme
II-2- Capture au repos
II-3- Piège O.B.E.T (Odor Baited Entry Traps)
II-4- Identification d’An. mascarensis
II-5- Traitement et conservation des moustiques
III- TECHNIQUES PCR
III-1- Extraction
III-2- RAPD-PCR
III-3- Electrophorèse
IV- SAISIE DES DONNEES
V- ANALYSES DES DONNEES
V-1- Variabilité génétique
V-2- Déséquilibre de liaison
V-3- Statistiques-F
V-4- Distances géographiques
V-5- Distances génétiques
V-6-Représentations graphiques
V-7- Indices de similarités et de correspondances (MARY et al, 1992)
V-8- Tests de Mantel (1967)
RESULTATS
I- OPTIMISATION DE LA TECHNIQUE RAPD-PCR
I-1- Extraction
I-2- RAPD-PCR
II- ANALYSES DE DONNEES
II-1- Variabilité génétique
II-2- Déséquilibre de liaison
II-3- Statistiques-F
II-4- Distances génétiques
II-5- Indices de similarités et de correspondance
II-6- Tests de Mantel
ANNEXE I
BIBLIOGRAPHIES