Etat de l’art sur les organes-sur-puce, les organoïdes et les organes-sur-puce vascularisés

Les modèles de test de médicament actuels

Aujourd’hui, les cellules cultivées dans des boîtes de Petri ainsi que les animaux de laboratoire, constituent les principaux modèles utilisés pour les premières phases de développement d’un médicament ainsi que pour la recherche fondamentale sur les maladies humaines. Bien que ces modèles aient contribué à d’importantes avancées dans le domaine biomédical, ils possèdent des limites intrinsèques qui aujourd’hui poussent les chercheurs à développer des modèles alternatifs. En effet, cette section montrera pourquoi les résultats obtenus sur ces systèmes ne peuvent pas toujours être transposés à l’homme, dont la physiologie est souvent très différente. Par ailleurs, même l’humain ne constitue pas forcément un modèle parfait pour le patient, car les études cliniques sont dans un premier temps le plus souvent faites sur des volontaires en bonne santé, et ne peuvent ainsi pas nécessairement prédire les effets d’un médicament sur un autre groupe de personnes (femmes enceintes, personnes âgées, enfants, etc.).

Le développement d’un nouveau médicament

Chaque jour, des millions de personnes dans le monde consomment des médicaments dont il faudrait largement améliorer l’efficacité. Sur les dix médicaments les plus rentables pour l’industrie pharmaceutique aux États-Unis, on estime que seule une personne sur quatre bénéficie du traitement prescrit dans le meilleur des cas, et une sur vingt-cinq dans le pire d’entre eux . Il s’agit à la fois d’un énorme gaspillage de ressources et d’une épreuve psychologique pour le patient, qui se voit attribuer un traitement qui n’a aucun effet, voire le fait souffrir d’effets secondaires indésirables. Cette mauvaise capacité à prédire l’efficacité d’un médicament sur un patient donné vient en partie de l’imperfection des modèles sur lesquels sont testés les médicaments, que nous allons brièvement décrire.

Boîtes de Petri et plaques à puits : 

Pour réaliser les premiers tests de médicaments en laboratoire, on utilise des supports plastiques (soit des surfaces plates appelées boîtes de Petri, soit des puits séparés et alignés par dizaines dans ce qu’on appelle des plaques à puits) dans lesquels sont cultivées des cellules. Dans ces cellules, on peut par exemple au préalable avoir inséré un morceau d’ADN défectueux pour mimer une maladie. Des robots peuvent alors déposer dans les puits (les plaques à puits sont généralement constituées de 96, 384 voire 1536 puits chacune) les différentes molécules issues d’une immense collection de médicaments candidats, afin de déterminer si les cellules réagissent ou non à une substance donnée. Suivent alors des phases d’optimisation de plus en plus complexes et coûteuses afin d’identifier les molécules les plus efficaces et les moins toxiques vis-à-vis de la cible thérapeutique.

Expérimentations animales : 

L’étape suivante consiste à tester sur des animaux les substances identifiées comme médicaments potentiels. On peut par exemple modifier le génome de souris afin de créer un modèle de maladie mimant celle du patient. L’ensemble des expériences sur les animaux, exigées par les organismes de réglementation du marché des médicaments, prend plusieurs années : il s’agit de comprendre comment le médicament candidat pénètre dans les tissus, comment il est éliminé, quel est son effet sur les organes vitaux, sur les organes reproducteurs etc.

Les essais cliniques : 

Après que les études sur les animaux ont donné des résultats satisfaisants, commencent des essais cliniques chez l’homme. Dans une première phase, on détermine si le médicament est sûr et s’il a un effet ; dans une deuxième phase, s’il est efficace sur un petit groupe de patients ; lors d’une troisième phase, une étude en double aveugle est menée sur un groupe plus important de patients. Ce n’est qu’une fois ces essais terminés qu’une entreprise pharmaceutique peut demander aux organismes de réglementation l’autorisation de mise sur le marché du médicament (à l’Agence Européenne du Médicament (AEM) en Europe, à la Food and Drug Administration (FDA) aux Etats-Unis).

A ce stade, pour un médicament considéré, les entreprises pharmaceutiques ont dépensé en moyenne 2 milliards d’euros et 14 années se sont écoulées depuis le moment où la molécule candidate a été identifiée . Etant donné que le brevet du médicament a également été déposé depuis plusieurs années, il n’est pas certain que l’entreprise puisse bénéficier d’un retour sur investissement suffisant avant la date d’expiration du brevet. Naturellement, il est de plus en plus compliqué de découvrir de nouvelles molécules efficaces (car les molécules d’une efficacité thérapeutique « faciles » à identifier l’ont déjà été), ainsi les entreprises pharmaceutiques dépensent de plus en plus d’argent pour des retours de moins en moins certains. Les chercheurs ont décrit ironiquement cette situation par une loi baptisée loi d’Eroom (Moore écrit à l’envers) stipulant que le développement d’un nouveau médicament est de plus en plus cher et de plus en plus long au fil du temps .

Limites des modèles actuels

Au cours du développement de nouveaux médicaments, le processus peut échouer à différents moments, entraînant une perte considérable de temps et d’argent. Une cause importante de cet échec est que les modèles actuels ne sont pas toujours capables de rendre compte de la complexité physiologique des patients, ni des variations entre groupes de population. Devant cet état de fait, l’industrie pharmaceutique cherche à « échouer plus vite et moins cher » (« fail cheaper, fail faster ») pour réduire les coûts. Les organes-sur-puce, en détectant la toxicité de certaines molécules sur les cellules humaines à un stade précoce, pourraient permettre de répondre à ce défi, mais offrent également des perspectives beaucoup plus larges. Chacun des modèles couramment utilisés qui ont été décrits plus haut, souffre d’importantes limites. Les modèles in vitro classiques sont des modèles de test relativement bon marché qui peuvent être utilisés à grande échelle. Cependant, en réduisant la maladie à une simple succession d’étapes biochimiques, ils constituent souvent une simplification excessive de la réalité en vue d’une identification fiable de médicaments prometteurs. La réalité est que de nombreuses maladies résultent de la combinaison de plusieurs voies métaboliques, facteurs génétiques et environnementaux, de sorte qu’une substance avec un résultat positif dans un test peut n’avoir aucun effet chez le patient. Par des mécanismes similaires, il se peut à l’inverse qu’une molécule ne soit pas identifiée alors qu’elle aurait pu être un candidat prometteur pour un traitement.

L’utilisation d’animaux comme modèles est, quant à elle, beaucoup plus coûteuse et chronophage. Mais surtout, les animaux de laboratoire présentent une limite évidente : ils ne reflètent pas toujours avec précision la réponse des humains aux médicaments, car leur physiologie et leur bagage génétique sont sensiblement différents des nôtres. Cela signifie que des médicaments, qui peuvent être très efficaces dans un modèle de souris, n’auront aucun effet chez l’homme. Ainsi, même après avoir été validées sur des animaux (sûreté et efficacité), plus de 80% des thérapies échouent lorsqu’elles sont testées chez l’homme .

En outre, le modèle animal comme modèle de maladie humaine pose parfois un problème si le gène humain n’est pas présent chez la souris ou si un agent pathogène pour l’homme n’est pas reconnu dans le corps de la souris. C’est le cas par exemple du coronavirus Sars-CoV-2, qui pénètre dans une cellule humaine par le biais du récepteur ACE2. Chez la souris contrairement à l’humain, le récepteur ACE2 ne se lie pas ou très peu au virus, ainsi les cellules de souris ne sont pas infectées et ne peuvent aider à la compréhension de la façon dont le virus Sars CoV-2 affecte les humains. Autre exemple, le cœur d’une souris bat 500 fois par minute, alors que celui de l’homme environ 60 fois par minute. Il n’est ainsi pas surprenant de constater que les médicaments qui influencent le rythme cardiaque humain n’ont souvent aucun effet sur le cœur de la souris. En définitive, on estime que 80 à 90 % des médicaments prometteurs qui sont testés pour la première fois chez l’homme à la suite d’expériences sur les animaux échouent immédiatement en raison d’effets secondaires inattendus ou parce qu’ils n’ont aucun effet . Bien que les expériences sur les animaux resteront nécessaires dans les sciences biomédicales (ne serait-ce que pour les études comportementales), les organes sur-puce (en utilisant des cellules humaines) pourraient considérablement réduire l’utilisation d’animaux de laboratoire, qui, en plus de poser des problèmes éthiques, ne sont pas toujours de bons modèles pour prédire comment certaines maladies se manifesteront chez l’homme ou comment celui-ci réagira à tel ou tel médicament.

De ce qui précède découle naturellement l’idée que le meilleur modèle de test de médicaments pour l’humain est l’humain lui-même. En pratique, la réponse est moins évidente qu’il n’y paraît. D’une part, seuls les molécules candidates présentant un risque minimal estimé pour la personne peuvent être testés chez l’homme, d’autre part ce risque n’est jamais nul (en 2015 en France par exemple, lors d’un essai clinique de phase I sur 90 sujets s’étant portés volontaires pour absorber la molécule BIA 10-2474, cinq patients développèrent des graves effets secondaires et l’un d’eux en mourut). De plus, les essais cliniques sont généralement menés sur des hommes blancs en bonne santé, qui ne sont pas représentatifs de la variation mondiale du bagage génétique, de l’âge, du sexe, ou d’autres facteurs environnementaux. Mettre en place des essais cliniques prenant en compte toute cette variabilité serait d’ailleurs pratiquement impossible. Enfin, toutes les études ne peuvent pas être menées sur des sujets humains, par exemple lorsqu’il s’agit d’examiner l’influence des radiations sur la santé. Pour toutes ces raisons, même un humain ne constitue pas un modèle parfait.

Table des matières

INTRODUCTION
Chapitre 1 Etat de l’art sur les organes-sur-puce, les organoïdes et les organes-sur-puce vascularisés
Partie 1 : Contexte général
1 Introduction
2 Les modèles de test de médicament actuels
2.1 Le développement d’un nouveau médicament
2.2 Limites des modèles actuels
3 Les organes-sur-puce
3.1 Définition
3.2 Observation
3.3 Potentiel pour l’industrie
4 Les organoïdes et les organoïdes-sur-puce
Partie 2 : Réseaux microvasculaires sur puce : vers une facilité d’utilisation des dispositifs microfluidiques et des organoïdes vascularisés sur puce
1 Introduction
2 Développer des réseaux microvasculaires in vitro
2.1 Architecture microfluidique
2.2 Nature des cellules et mise en culture
2.3 Nature de l’hydrogel et injection dans la puce
2.4 Incorporation d’organoïdes/sphéroïdes
3 Contrôle des écoulements
3.1 Différentes approches pour générer l’écoulement
3.2 Evaluation de la pertinence physiologique des flux générés
4 Vers une automatisation et une industrialisation des dispositifs microfluidiques
4.1 Fabrication des puces microfluidiques, parallélisation et standardisation
4.2 Intégration des fonctions de suivi et de détection sur puce
5 Vascularisation d’organoïdes-sur-puce
6 Conclusion et perspectives
Bibliographie
Chapitre 2 : Plateforme microfluidique innovante pour la perfusion d’organoïdes-sur-puce
1 Introduction
2 Brique élémentaire du circuit microfluidique proposé
2.1 Dimensionnement du circuit microfluidique, simplification du contrôle des écoulements
2.2 Caractérisation géométrique de l’unité de piégeage des sphéroïdes / organoïdes
2.2.1 Règles de dimensionnement géométrique du piège
2.2.2 Unités de piégeage multiples, mise en série
2.3 Exploitation de l’architecture en serpentin pour les organes-sur-puces vascularisés
3 Procédé d’injection innovant dans le dispositif microfluidique choisi
3.1 Méthode originale et robuste d’encapsulation permanente de sphéroïdes
3.1.1 Généralités
3.1.2 Caractéristiques du dispositif microfluidique
3.1.3 Mise en œuvre du système
3.1.4 Autres modes de réalisation possibles
3.2 Vascularisation
4 Evaluation des paramètres de contrôle du dépôt du gel dans le canal microfluidique
4.1 Observation du dépôt de gel dans les coins et sur les parois du canal microfluidique
4.2 Présentation d’une approche fondamentale
Annexe A
Choix du matériau
Conception et usinage des puces microfluidiques
Annexe B
Bibliographie
Chapitre 3 Plateforme microfluidique automatisée pour la vascularisation d’organoïdes-sur-puce
1 Introduction
1.1 Idée directrice
1.2 Contexte de l’étude
2 Matériel et méthodes
2.1 Piégeage de l’organoïde et ensemencement de la puce microfluidique
2.2 Culture cellulaire et génération des sphéroïdes et des organoïdes
2.3 Préparation de l’hydrogel
2.4 Fabrication du dispositif
2.5 Imagerie cellulaire
2.6 Microscope à fluorescence à feuille de lumière
2.7 Immunomarquage sur puce
2.8 Analyse des réseaux endothéliaux
2.9 Analyse statistique
3 Résultats
3.1 Conception d’un dispositif microfluidique pour le piégeage précis d’organoïdes et de leur micro-environnement
3.2 Formation de réseaux endothéliaux interconnectés
3.3 Fonctionnalité du réseau endothélial
3.4 Organoïdes de vaisseaux sanguins
3.5 Anastomose entre réseaux endothéliaux et organoïdes
3.6 Organoïdes de cœur
4 Conclusion
Annexe A
Bibliographie
CONCLUSION

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