Etapes pré analytiques pour l’extraction de l’ADNc

Histoire des acides nucléiques

5 ans avant la description de la structure en double hélice de l’ADN (Acide Désoxyribonucléique) par Watson et Crick, la présence d’acide nucléique dans le plasma a été décrite en 1948 par Mendel et Metais. Ils ont montré qu’ils pouvaient être détectés dans le plasma humain de sujets malades et sains. C’est en 1977 que Leon et al. ont mis en évidence l’ADN circulant (ADNc) dans le sérum de patients atteints de cancer en quantité plus importante que chez des sujets non cancéreux. En 1997, l’équipe de Lo a montré la présence d’acide nucléique circulant d’origine foetale dans le sang maternel ; grâce à ces travaux, la première méthode de diagnostic de la trisomie 21 a été mise en place ([Lo et al, 1997], [Chiu et al, 2011]). Les acides nucléiques circulants extracellulaires sont des ADN retrouvés hors des cellules dans le sang, le plasma et la lymphe, les acides nucléiques sont également retrouvés dans les fluides non circulants comme les ascites, le lait maternel, les fluides de lavages bronchiques, la bile, et l’urine [Galeazzi et al, 2003]. Il a été montré également que les différentes procédures thérapeutiques et les traumatismes peuvent entraîner la libération d’ADN libre dans la circulation [Bettegowda et al, 2014]. Plus récemment, les ADN circulants se sont avérés porter une partie de la même information moléculaire que les biopsies tissulaires [El Messaoudi, 2016]. Les étapes clés de la découverte de l’ADNc sont résumées dans le tableau suivant Tableau 1 Les étapes clés de la découverte de l’ADNc.

Avantages d’ADN

La possibilité d’isoler et d’enrichir les ADN dérivés de tumeurs dans des échantillons plasmatiques complexes va pouvoir donner des avantages indénombrables grâce à sa préparation facile, rapide et moins couteuse. Il est considéré comme une source potentielle d’informations pour la détection du cancer et l’évaluation de la progression tumorale et des métastases. La sous-représentation de l’hétérogénéité d’une tumeur et la faible disponibilité des échantillons signifient que les biopsies tissulaires ont une valeur limitée pour l’évaluation de la dynamique de la tumeur aux stades avancés de la maladie [Emily Crowley, 2013]. Or, une simple prise de sang de 5mL a un avantage qui est la possibilité de réaliser l’analyse sanguine à tout moment du traitement tout au long de la maladie, à presque tous les stades de la prise en charge des patients atteints de cancer et de présenter une invasivité nettement réduite [Schwarzenbach H, 2011]. Un avantage majeur de l’isolement d’ADNc est le diagnostic précoce ; c’est l’une des stratégies clés pour freiner le cancer, chez des individus pré-symptomatiques. Un simple prélèvement du sang suggère la possibilité d’une analyse et l’identification de l’ADNc comme outil de détection et de dépistage plus précoce. La surveillance parallèle de multiples mutations peut augmenter la sensibilité de la détection de l’ADNc et peut être utilisée pour évaluer l’évolution clonale de la maladie du patient et peut identifier des mutations de résistance avant que la progression clinique ne soit observée [Jonathan C. M. Wan, 2017]. En résumé, l’ADNtc possède les caractéristiques d’un marqueur tumoral. Dans son application théranostique, l’ADN circulant offre une alternative rapide et de prélèvement aisé au matériel tissulaire. La spécificité de l’analyse est primordiale, afin d’éviter l’administration à un patient d’un traitement qui serait inefficace.

Isolement de l’ADN normal à partir des leucocytes

L’extraction de l’ADN génomique a été fait à l’aide du kit PureLink ™ (référence K1820-01, K1820-02), son protocole est basé sur la liaison sélective de l’ADN à une membrane à base de silice en présence de sels chaotropes. Le lysat est préparé à partir du sang, les cellules sont digérées avec la protéinase K à 60oC en utilisant une formulation de tampon de digestion optimisée facilitant la dénaturation des protéines et renforçant l’activité de la protéinase K. Le lysat est mélangé à l’éthanol et au tampon de liaison génomique qui permet une forte liaison de l’ADN avec la colonne de rotation. L’ADN se lie à la membrane à base de silice dans la colonne et les impuretés sont éliminées par lavage en profondeur avec des tampons de lavage. L’ADN génomique est ensuite élué dans du tampon d’élution à faible teneur en sel.

Dans un tube Eppendorf de 1,5ml, un volume de 200μl du sang a été mélangé avec 20μl de la protéinase k et 200μl de la solution de lyse, vortexé puis incubé pendant 10 min à 60oC. Par la suite, une série de lavages a été effectuée; à l’aide de 200μl de l’éthanol absolu dans un premier temps. Par la suite, le mélange est mis dans une colonne PureLinkTM et centrifugé 1min à 8000 rpm, le filtrat qui se dépose dans le tube collecteur fourni par le kit doit être jeté à chaque fois. Un deuxième lavage se fait avec 400μl d’une solution tampon Wash Buffer1, le mélange est centrifugé 1min à 8000rpm et le culot est jeté. Le dernier lavage est réalisé avec 400μl de tampon Wash Buffer 2 et centrifugé 3min à 14000rpm. Le résultat de lavage est mis dans un tube eppendorf de 1,5ml et 70μl de tampon d’élution sont ajoutés. L’ensemble est incubé 1min à température ambiante. Une dernière centrifugation d’1min à 8000rpm est réalisée pour récupérer l’ADN génomique (fig.10)

CONCLUSION ET PERSPECTIVES

Nous avons mis au point une méthodologie d’extraction d’ADN circulant, cette méthode offre une sensibilité et une spécificité en plus de sa rapidité et son caractère automatisable pour la récupération de l’ADNc à partir d’un volume faible de plasma. Il est donc possible d’intégrer cette méthode dans la routine du dépistage de cancer chez les personnes saines, en évaluant la quantité des ADN circulants avec une simple prise de sang. L’étude est toujours en progression et les résultats de l’amplification PCR à partir de l’ADNc extrait du plasma vont être évalués par séquençage afin de détecter les différentes mutations qui touchent le gène BRCA1 chez les patientes atteintes de cancer de sein. La détection et la recherche des mutations sur l’ADNtc seraient essentielles dans l’évaluation de la réponse au traitement et permettraient l’adaptation des traitements en fonction de l’apparition des résistances grâce aux différents types de biomarqueurs moléculaires (ADNc, cellules tumorales circulant, exosomes). Cette méthode peut être utilisée pour suivre l’avancement du cancer et la présence des métastases, tout ceci en diminuant la souffrance des patients et en rendant la surveillance plus accessible et économiquement plus intéressante. Des recherches avancées dans ce domaine vont nettement diminuer la mortalité par cancers.

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Table des matières

LISTE DES ABREVIATIONS
LISTE DES FIGURES
LISTE DES TABLEAUX
LISTE DES ANNEXES
LIEU DE STAGE
INTRODUCTION
REVUE BIBLIOGRAPHIQUE
I.Histoire des acides nucléiques
II.L’ADN circulant
III. biopsie liquide
I.Source des ADN circulants
V.Caractéristiques générales des acides nucléiques circulants
VI.ADN circulant dans les pathologies autres que le cancer
VII. L’intérêt de la recherche d’ADN circulant
1) La détection des altérations géniques
2) La détection des stades de cancer
3) Le suivi et la surveillance des récurrences
4) L’évaluation de la réponse au traitement
VIII. Avantages d’ADN circulant
MATERIEL ET METHODES
Etapes pré analytiques pour l’extraction de l’ADNc
Méthodes d’extraction
1) Isolement de l’ADN normal à partir des leucocytes
Principe
Protocole
2) L’isolement de l’ADNc
I.Principe
II.Protocole
III. Dosage Méthodes de quantification de l’ADNc
IV.PCR = Technique d’amplification en chaine par polymérase
1) Principe de base d’une PCR
2) Choix du gène de référence
3) Choix des amorces
4) Protocole
Analyse d’ADN par électrophorèse sur gel d’agarose
RESULTATS ET DISCUSSION
I.L’extraction de l’ADNc
1) Essai No1
2) Essai No2
3) Essai No3
4) Essai No4
II.L’amplification du gène BRCA1
III. Utilités cliniques potentielles de l’ADN tumoral circulant
CONCLUSION ET PERSPECTIVES
REFERENCES BIBLIOGRAPHIQUES