Etalonnage de la mesure de la concentration en matière organique

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Mesure par médiateur rédox de la matière organique biodégradable

Plusieurs capteurs ont été développés dans la littérature se basant sur des médiateurs rédox. Habituellement, les micro-organismes oxydent la matière organique en condition aérobique. Ce-pendant, en présence d’un médiateur rédox, ce dernier agit comme un accepteur d’électrons à la place de l’oxygène [42, 43, 44, 45, 46].
La quantité du médiateur rédox réduit par la réaction de biodégradation est directement propor-tionnelle à l’activité métabolique des microorganismes et donc à la quantité de matière organique biodégradable.
L’ajout d’un substrat à un milieu contenant un excès d’un médiateur rédox entraîne une aug-mentation de l’activité métabolique des bactéries et de la quantité de médiateur réduit. La réoxidation de ce dernier génère un courant quantifiable par une méthode coulométrique [47] ou ampérométrique [42].
Les travaux de Pasco [47] et de Yoshida [42] dans les années 2000 ont permis le développement de capteurs basés sur ce principe.
L’équipe de Learoyd [44] a étudié le taux de réduction de sept colorants rédox par treize souches bactériennes. Diﬀérentes combinaisons de bactéries et colorant rédox ont été faites. Le bleu de toluidine et l’éthosulfate de phénazine ont été les plus rapidement réduits par la majorité des bactéries.
Le principal avantage est qu’avec ces médiateurs rédox, la réaction de biodégradation ne dé-pend pas de l’oxygène dans le milieu réactionnel [47]. De plus, avec un médiateur rédox, il n’est pas nécessaire de diluer les échantillons. Enfin, la durée d’analyse est plus courte que pour les méthodes standards étant donné que le médiateur rédox accélère la biodégradation.

Mesure du potentiel électrique

Des équipes de recherche ont travaillé sur le développement de capteurs basés sur le principe des piles à combustible microbiennes. Comme indiqué dans la figure 1.7, celles-ci sont composées d’un compartiment anaérobie avec une anode (électrode négative) et un compartiment aéro-bie avec une cathode (électrode positive) ; les deux étant séparés par une membrane. Dans le compartiment anaérobie, les microorganismes dégradent la matière organique et générent des électrons et des protons [7, 48]. Les protons migrent à travers la membrane vers la cathode, où l’oxygène est réduit pour former de l’eau (H2O) et les électrons passent de l’anode à la cathode par un circuit électrique externe.
La circulation des électrons dans le circuit électrique génère un courant mesurable propor-tionnel à l’activité de biodégradation microbienne, permettant ainsi l’estimation de la DBO d’un échantillon. Les piles à combustible microbiennes développées par [49] montrent une bonne cor-rélation avec la DBO5 obtenue avec la méthode standardisée (r2 = 0, 999).
Plusieurs travaux ont été centrés sur cette technique [49, 50, 51, 52, 53] mais peu ont été évalués avec des échantillons environnementaux réels. Ces méthodes ont permis d’élargir la gamme de détection jusqu’à 0-200 mg/L [7].

Dispositifs miniaturisés de mesure de polluants organiques (biodégra-dables)

Malgré leur forte robustesse et leurs bonnes performances, les méthodes conventionnelles présentent des limites conséquentes pour des mesures fréquentes. Les méthodes alternatives dé-veloppées afin d’améliorer les caractéristiques de ces dernières présentent des limites similaires liées principalement au fait que les mesures sont diﬀérées, ne sont pas réalisées sur site et né-cessitent également une durée de mesure importante [54]. L’intégration et la miniaturisation des capteurs oﬀrent des perspectives intéressantes pour améliorer les performances des mesures en milieux biologiques.
Des recherches de plus en plus nombreuses essayent de répondre à ce besoin en développant une grande variété de biocapteurs millimétriques et micrométriques.
Les biocapteurs sont des dispositifs de détection analytiques qui traduisent un phénomène bio-logique par un signal détectable et mesurable. Ils se composent de deux parties principales : le biorécepteur et le système de transduction dédié au biorécepteur.
Les éléments de détection biologiques représentent la partie du biocapteur qui intéragit avec l’analyte d’intérêt. Par analogie avec les méthodes conventionnelles, nous limiterons notre étude aux capteurs bactériens. Les biocapteurs bactériens sont couramment utilisés pour la surveillance de l’environnement [55, 56, 57, 58]. Ils sont capables de fournir des informations sur les niveaux de pollution [59]. Le transducteur physique convertit l’activité biologique en un signal lié à la concentration de l’analyte d’intérêt [59]. Plusieurs types de transducteurs physiques peuvent être intégrés sur un biocapteur.
Dans cette partie, nous présenterons les diﬀérents biocapteurs développés en fonction de la mé-thode de transduction choisie [60, 61] en nous focalisant sur les transductions électrochimique et optique qui sont les plus couramment utilisées.

Biocapteurs électrochimiques à bactéries

Les méthodes électroanalytiques oﬀrent un grand potentiel de surveillance des échantillons d’eau car elles sont simples à utiliser et suﬃsamment sensibles. De plus, elles sont très facilement miniaturisables.
De nombreux biocapteurs électrochimiques ont été développés pour détecter la biodégradation dans les eaux [50, 55, 62, 63].
Les bactéries sont immobilisées sur les surfaces des électrodes ou confinées dans un puits, avec ou sans étape de prétraitement. Cette dernière permet d’optimiser le procédé et donc d’avoir une mesure plus rapide.
Les techniques d’immobilisation peuvent être classées en trois groupes. Dans le premier cas, les bactéries sont piégées à l’intérieur d’un réseau polymère qui limite leur mouvement. Plusieurs matrices ont été évaluées, dont l’alginate [64], l’agarose [65, 66], le polycarbamoxyl sulfonate (PCS) [67, 8, 68], un gel de silice [69], un matériau composite de type sol-gel (silice et poly (alcool vinylique) -polymère greﬀé (vinylpyridine)) [70, 71, 72, 73], un sol-gel d’Al2O3 [74], la résine ENT-3400 (une résine de réticulation activée par ultraviolet) [75], l’alcool polyvinylique (PVA) [76] et l’ormosil (silicate organiquement modifié) [77].
Tous ces polymères sont biocompatibles et ont une faible toxicité pour les micro-organismes. Néanmoins, le choix du polymère dépend de l’application. L’alginate et l’agarose sont particuliè-rement faciles à utiliser mais peuvent manquer de stabilité mécanique adéquate dans certaines conditions [67]. Les polymères PCS et le sol-gel sont plus complexes à utiliser mais plus résistants mécaniquement. De plus, les sol-gel de polymères sont décrits comme chimiquement inertes et photochimiquement et thermiquement stables.
La deuxième méthode d’immobilisation consiste à intercaler des cellules entre deux couches de polymères. Plusieurs combinaisons de polymères : membranes de teflon / dialyse [78], acétate de cellulose / éthylène-propylène fluorée (EPF) [79], teflon / teflon [80], polycarbonate / teflon [81] ont été utilisées dans les études citées.
La dernière méthode d’immobilisation microbienne consiste à adsorber les cellules sur des sup-ports solides, par exemple, des membranes poreuses (cellulose [82], fibre de verre [83] ou nylon [84]).
Certains polluants peuvent exiger une phase de latence longue avant de devenir biodégradables par des micro-organismes. Une étape complémentaire de prétraitement consiste alors à hydro-lyser, physiquement ou biochimiquement, les macromolécules qui sont plus diﬃciles à dégrader dans les échantillons [82, 85, 86].
Karube [55] a développé en 1977 deux types diﬀérents de capteurs à base d’électrodes mi-crobiennes. Le premier comprend une électrode d’oxygène et utilise une membrane de bacté-ries/collagène. Le courant de l’électrode diminue de façon marquée avec le temps lorsque cette dernière est placée dans une solution de glucose ou d’acide glutamique (modèle d’eau usée). Le deuxième est une cellule de biocarburant utilisant une électrode de Clostridium Butyri-cum/Platine. Une relation linéaire a été obtenue entre le courant de l’électrode et la DBO avec une erreur de +/-10%. Une plateforme complète de mesure, développée par Ben-Yoav [9], permet l’analyse de la toxicité de l’eau (Figure 1.9). Le système électrochimique est composé de deux micro puces : une puce microfluidique en PDMS et une micro chambre à trois électrodes.

Bilan partiel sur les systèmes miniaturisés

Les systèmes de détection électrochimiques sont facilement miniaturisés et portables permet-tant une analyse sur site et un résultat rapide, en temps réel sur la qualité des eaux [59, 108]. Ils permettent l’analyse à une fréquence élevée car la période de stabilisation de la mesure est généralement courte. De plus, le bruit est proportionnel à la taille de l’électrode, donc bas. Ces systèmes sont précis et sensibles.
Cependant, l’utilisation de biocapteurs électrochimiques est limitée aux espèces électro-actives [9]. En outre, le contact direct du capteur avec la solution examinée peut entraîner une détério-ration de la surface des électrodes entraînant une modification des propriétés de détection.
La transduction optique présente plusieurs avantages par rapport à d’autres techniques telles que la possibilité d’eﬀectuer une analyse multiple simultanément [109]. De plus, les systèmes optiques peuvent être facilement fabriqués en masse et miniaturisés et sont sans interférences électriques et magnétiques [110, 111]. Le système de transduction n’est pas en contact avec la solution examinée, ce qui élimine les problèmes d’encrassement biologique [106, 112, 113].
La majorité des biocapteurs utilisant la transduction optique sont faits sur microplaque avec des systèmes de lecture commerciaux type spectrofluoromètre ou spectrophotomètre ce qui li-mite l’utilisation sur site. Ceci explique la faible production bibliographique sur des biocapteurs optiques miniaturisés par rapport aux biocapteurs électrochimiques. Les biocapteurs optiques présentent toutefois à leur tour des limites telles que l’interférence lumineuse ce qui signifie que les mesures doivent être eﬀectuées dans des chambres noires ainsi que leur incapacité à four-nir des résultats précis lors de l’examen d’échantillons troubles [59]. Ces limites restent peu contraignantes comparativement aux systèmes électrochimiques.

Optimisation du système de mesure avec du milieu LB et du glucose

Dans cette partie, l’objectif est de tester l’influence des paramètres pouvant impacter les per-formances de notre système de mesure. La finalité de ces expériences est de valider les conditions optimales permettant une bonne reproductibilité, une bonne sensibilité et une meilleure gamme de détection. Toutes les expériences reportées dans ce manuscrit ont été renouvelées au moins trois fois.

Reproductibilité des mesures

Les premières expériences ont été faites avec du milieu LB afin de tester l’étanchéité de notre système ainsi que la reproductibilité des mesures. Les puits sont remplis manuellement à l’aide d’une micro pipette. Le système est ensuite fermé et introduit dans la malette régulée en température (30°C). L’écart type moyen varie entre 0,15 et 0,25 mgO2/L d’une expérience à une autre, en fonction de la concentration en milieu LB et de la concentration bactérienne. La mesure est faite sur dix heures.
La même expérience est reproduite avec un milieu M9, diﬀérentes concentrations en glucose et diﬀérentes concentrations bactériennes. La préparation de l’échantillon est détaillée en annexe. Comme dans le cas des mesures en milieu LB, l’écart type de la reproductibilité des mesures varie d’une mesure à une autre de 0,15 à 0,25mgO2/L en fonction de la concentration en matière organique (glucose) et aussi de la concentration bactérienne. La figure 2.4 présente la consom-mation de la concentration en oxygène dans le temps ainsi que l’écart de la reproductibilité de mesure pour 5 expériences faites à 80mgGluc/L pour une concentration bactérienne de 0,8.108 cell/mL. L’écart type est de 0,25mgO2/L qui est un faible écart validant la reproductibilité des mesures.

Ecart de mesure entre les diﬀérentes chaînes de mesure

Un autre paramètre à prendre en compte est l’erreur d’une chaîne de mesure à une autre et d’un puits à un autre. Une même mesure est faite plusieurs fois dans tous les puits et aussi avec les quatre chaînes du système de mesure. Le but est de voir l’écart pour une même concentration bactérienne et concentration en matière organique entre les quatre fibres optiques du système de mesure. La figure 2.5 présente l’écart de mesure entre les diﬀérentes lignes optiques du système pour une concentration bactérienne de 2.108 cell/mL et une concentration en glucose de 80mg/L. Un léger écart est observable de l’ordre de 0,26 mg/L. On voit que cet écart est du même ordre de grandeur que l’écart type entre 2 expériences consécutives. On peut considérer que ce n’est donc pas pénalisant pour la mesure. Toutefois afin de minimiser cette erreur, la même expérience sera faite sur la même chaîne à chaque fois.

Eﬀet de la concentration bactérienne

Afin de voir l’eﬀet de la concentration bactérienne sur la consommation en oxygène, nous avons fait plusieurs expériences avec plusieurs dilutions du milieu LB (dilué 100 fois : 1/100 et dilué 300 fois : 1/300) et avec diﬀérentes concentrations bactériennes de 0,16.108 cell/mL qui correspond à une Absorbance590nm = 0, 02 jusqu’à une concentration de 2.108 cell/mL qui correspond à une Absorbance590nm = 0, 25.
La figure 2.6 illustre l’influence de la concentration bactérienne sur l’accélération de la consom-mation de l’oxygène dissous. Les résultats corroborent les observations eﬀectuées par L. Recoules.
La première constatation attendue est que la cinétique de consommation de l’oxygène est trés sensible à la population bactérienne. Pour la concentration de 2.108 cell/mL, la consommation en O2 est très rapide, inférieure à 30 minutes et la cinétique de consommation est peu visible.
On observe également un fort décalage du signal à t=0. La consommation rapide de l’oxygène avant t=0, peut expliquer ce décalage. En eﬀet, les bactéries, nombreuses et ayant beaucoup de nutriments, réagissent très rapidement avant le remplissage des puits et le lancement de la mesure, ce temps pouvant prendre entre 10 et 15 minutes. Ainsi, afin de voir la cinétique de consommation des bactéries il vaut mieux éviter des populations trop importantes surtout que cela peut entraîner également la mort de bactéries qui constitueront à leur tour une source de matière organique pour les vivantes.
On constate également que l’oxygène contenu en solution est totalement consommé ce qui montre la bonne étanchéité du système.
En calculant la pente à l’origine pour les diﬀérentes courbes (entre une heure et deux haures de mesure), on peut déduire la vitesse de consommation de l’oxygène dissous dans la solution. Ces valeurs sont rassemblées dans le tableau 2.1 qui donne également le temps de mesure nécessaire à l’analyse.
La concentration bactérienne joue un rôle important sur la vitesse de consommation de l’oxygène et donc la durée de mesure.

Optimisation du système de mesure avec du milieu LB et du glucose

Reproductibilité des mesures

Ecart de mesure entre les diﬀérentes chaînes de mesure

Eﬀet de la concentration bactérienne

Mesure de la concentration en matière organique à l’aide d’un capteur miniaturisé à optode

Afin de tester le microsystème, nous avons reproduit les expériences faites avec le macrosys-tème et avons comparé les deux systèmes pour les mêmes conditions expérimentales. Le protocole expérimental utilisé pour cette section est le même que celui utilisé pour le macrosystème.

Glucose mimant la matière organique

Comme dans le cas du capteur millifluidique, la biopuce est testée avec une solution contenant du glucose. Le protocole bactérien est exactement le même que précédemment. Nous reprenons le culot bactérien après lavage et ajustons la concentration bactérienne avec du milieu M9 jusqu’à obtenir de la densité souhaitée. L’échantillon final est préparé en diluant le milieu bactérien dans le milieu M9 enrichi en glucose.
Influence de la concentration bactérienne La figure 2.15 montre la consommation de l’oxygène dissous pour une concentration en glucose de 80mg/L pour quatre concentrations bactériennes diﬀérentes allant de 0,8.108 cell/mL à 4,8.108 cell/mL.
On note une absence complète de dynamique respiratoire en fonction des concentrations bactériennes, ce qui n’était pas le cas pour le macrosystème.
Mesure de la concentration en glucose L’absence de l’eﬀet de la concentration bactérienne pour la concentration en glucose de 80 mg/L, nous a poussé à regarder l’impact de la concentration de ce dernier pour une densité bactérienne donnée.

Milieu LB mimant la matière organique

Afin de comprendre l’absence de la respiration bactérienne (signal constant) , nous avons décidé de reproduire les expériences avec le milieu LB qui est très riche en nutriments. L’expérience a été faite pour deux concentrations en bactéries à savoir 2.108 cell/mL et 4,8.108
Comme pour le macrosystème, l’augmentation du taux en bactéries joue sur le temps de mesure et aussi sur la vitesse de consommation. En eﬀet, pour la concentration la plus importante, la mesure est faite en moins de 4 heures tandis que pour la concentration de 2.108 cell/mL, la mesure prend plus de 9 heures. Pour cette dernière concentration bactérienne, un temps de latence assez important, de l’ordre de 5 heures, est également noté. A partir de ce moment là, la cinétique de la consommation de l’oxygène reprend à une vitesse de 1,4 mgO2/L/h. Pour la concentration élevée, il n’y a pas de temps de latence. La vitesse de consommation de cette dernière est de 1,44 mgO2/L/h, soit similaire à celle observée avec la population bactérienne plus élevée.
Mesure de la concentration en matière organique La détermination du taux d’oxygène dis-sous consommé en fonction de la matière organique présente est un paramètre important pour valider notre système et aussi définir sa gamme de détection. Les échantillons sont préparés avec plusieurs dilutions du milieu LB et les résultats sont comparés à ceux obtenus de façon analogue avec le macrosystème. Les cinétiques de ces dernières sont illustrées dans la figure 2.18.
L’échantillon préparé est composé de bactéries avec diﬀérentes concentrations et du milieu LB avec quatre concentrations diﬀérentes (dilution 10, 100 et 300 fois).
Pour une même concentration bactérienne, nous avons voulu voir l’eﬀet de la concentration en nutriments sur la consommation en oxygène. La figure 2.18 illustre les résultats de la consomma-tion en oxygène en fonction de la dilution du milieu de culture pour une concentration bactérienne correspondant à une Absorbance590nm = 0, 25 (2.108 cell/mL).
Pour le macrosystème, l’influence de la concentration en nutriments est nettement visible sur la vitesse de consommation et aussi sur la durée de mesure. Pour le milieu non dilué, la réponse est très rapide et la vitesse de consommation est de 18,07mg/L/h. Pour les milieux LB 100 et 300 fois dilués, la durée de mesure et la vitesse de consommation de l’oxygène sont respectivement deux heures, quatre heures et 3,11 mg/L/h, 2,14 mg/L/h.
Les comportements sont radicalement diﬀérents dans le cas du microsystème. En eﬀet, cette absence de consommation bactérienne dans le cas des milieux LB dilués 100 et 300 fois avec le microsystème ne peut pas être expliquée par le manque en matière organique car les mêmes dilutions montrent une dynamique de consommation avec le macrosystème.
L’explication la plus probable est que la porosité du PDMS permet un renouvellement rapide de l’oxygène dans l’échantillon ce qui masque la consommation bactérienne. Cet eﬀet est d’autant plus visible que le rapport surface exposée/volume du réservoir est grand, ce qui est clairement en défaveur du système miniaturisé.

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Table des matières

chapitre1 1
1 Mesure de la concentration en polluants organiques dans l’eau : Etat de l’art et problématique
1.1 Problématique générale
1.2 Etat de l’art
1.2.1 Méthodes conventionnelles de mesure de l’oxygène dissous
1.2.2 Méthodes alternatives
1.2.3 Dispositifs miniaturisés de mesure de polluants organiques (biodégradables)
1.2.4 Conclusions sur l’état de l’art
1.3 Objectifs de la thèse
2 Développement du capteur à Optode
2.1 Macrosystème à optode
2.1.1 Optimisation du système de mesure avec du milieu LB et du glucose
2.1.2 Mesure de la concentration en matière organique à l’aide d’un capteur à optode
2.2 Microsystème à optode
2.2.1 Réalisation du système microfluidique
2.2.2 Mesure de la concentration en matière organique à l’aide d’un capteur miniaturisé à optode
2.3 Conclusion
3 Développement du capteur à résazurine
3.1 Introduction
3.2 Qu’est ce que la résazurine?
3.3 Préparation de l’échantillon
3.4 Mise en place d’une expérience de référence
3.4.1 Optimisation du protocole expérimental
3.4.2 Etalonnage de la mesure de la concentration en matière organique
3.4.3 Conclusion
3.5 Ingénierie du microsystème à résazurine
3.5.1 Amélioration de la chaîne instrumentale
3.6 Conception et réalisation des biopuces
3.6.1 Design des biopuces
3.6.2 Première génération de biopuce : Biopuces PDMS
3.6.3 Deuxième génération de biopuces : Biopuces SU8
3.6.4 Troisième génération de biopuces : Biopuces en film DF
3.7 Conclusion
4 Cas d’étude d’une application toxicologique
4.1 Introduction
4.2 Application toxicologique
4.2.1 Protocole expérimental
4.2.2 Souche E.coli
4.2.3 Souche Pseudomonas aeroginosa
4.2.4 Souche Rhizobium radiobacter
4.2.5 Conclusion
4.3 Vers une application sur le terrain
4.3.1 Protocole expérimental
4.3.2 Mélangeur fluidique
4.4 Conclusion
Conclusion
Glossaire
A Milieux de culture et produits chimiques
A.1 Stérilisation du matériel
A.2 Milieux de culture
B Préparation de la souche bactérienne
B.1 Conservation des souches bactériennes
B.2 Cinétique et suivi de la croissance bactérienne
C Protocole bactérien de préparation de l’échantillon
C.1 Etape de pré-culture
C.2 Etape de culture
C.3 Etape de lavage des bactéries
C.4 Préparation de l’échantillon
D Chaîne instrumentale du capteur à Résazurine
D.1 Etage d’excitation
D.2 Etage de détection
E Procédé de fabrication des biopuces Verre/PDMS
Annexes
Bibliographie