Soutenance mémoire
Tubercules
Les tubercules présentent la partie la plus intéressante de la pomme de terre car ils accumulent des réserves. Les tubercules proviennent du développement des stolons et présente des formes variables; ronds, longs, ovales et parfois aplatis. Leur peau peut être lisse ou rugueuse de teinte variée due à la présence d’un ou plusieurs pigments dans les cellules de l’épiderme. Elle peut être rouge, jaune-ocre ou bleu-violacée. De même, la chair peut être de couleur blanche, jaune, rose ou violette foncé. Les tubercules présentent deux pôles (Figure 6) :
– Un pôle basal dénommé « talon » qui est la partie élargie légèrement déprimée où l’on trouve le point d’attache du stolon ou « l’ombilic ».
– Un pôle apical appelé « couronne » sur lequel on trouve les yeux disposés en hélice qui peuvent être superficiels, demi-enfoncés ou enfoncés.
Différentes techniques
La culture in-vitro regroupe plusieurs techniques dont la manière de procéder et les buts recherchés sont très différents. Elle se présente sous quatre (04) aspects.
Culture de méristème La culture de méristème constitue une application importante de la technologie de la culture in-vitro car elle est utilisée pour l’éradication des virus. Elle assure la guérison des plantes atteintes de virus par le fait que les cellules méristèmatiques apicale d’une plante ont une vitesse de multiplication plus vite que celle du virus.
Culture d’anthère, de grain de pollen et d’ovule. Cette technique est utilisée pour l’amélioration de la plante sur le plan génétique. Elle permet la production rapide des plantes haploïdes et conduit à l’obtention de plante homozygote après doublement de chromosomes. A l’apparition des mutants, elle permet la création des plantes qui n’existent pas à l’état naturel.
Culture de protoplastes La culture de protoplastes consiste à débarrasser la paroi pectocellulosique de la cellule. Elle permet d’induire la fusion de protoplastes d’espèces éloignées. Elle permet de faire pénétrer dans la cellule des molécules diverses comme l’ADN (Acide Désoxyribonucléique), des organites, des noyaux et effectuer des manipulations génétiques qui conduit à la création de nouvelle variété résistante à certaines maladies ou ravageurs.
Micropropagation La micropropagation qui fera l’objet de notre étude est la technique la plus répandue. Elle consiste à multiplier un individu donné à partir d’un fragment végétal de taille plus ou moins grande. Le but essentiel de la micropropagation est de produire en grande quantité des jeunes plantes identiques au pied-mère. De plus elle permet l’élimination des bactéries et des champignons mais elle n’offre aucune garantie contre le virus. La micropropagation est une réelle multiplication qui a apporté un progrès considérable avec un taux de multiplication 100 à 1000 fois plus élevé par rapport aux méthodes de multiplication traditionnelle. Grâce à cette technique, on part d’une petite quantité de tissu au départ pour produire une infinité de plantes. On peut constituer des collections de pied-mère, des banques de clone, assurer la sauvegarde des espèces en voie d’extinction et programmer des cultures tout au long de l’année. La micropropagation peut suivre deux (02) voies différentes :
– soit en provoquant le développement de bourgeons axillaires présents naturellement à la base des feuilles et qui ne fait qu’accélérer in-vitro le fonctionnement normal des méristèmes de bourgeons déjà formés sur une plante (multiplication par bourgeonnement axillaire).
– soit en provoquant l’apparition de bourgeons adventifs à des endroits inhabituels sur n’importe quel type d’organe ou de tissu (feuille, tige, racine…) (multiplication par bourgeonnement adventif).
Elle comprend 4 phases :
Phase I : Etablissement de la culture aseptique : C’est l’étape de base de l’opération qui consiste à la désinfection et de ce fait demande un maximum de précautions. Le choix dépend essentiellement de :
– la qualité sanitaire du pied-mère
– l’âge et l’état physiologique du pied-mère
– l’époque de prélèvement de l’explant
– la taille et la nature de l’explant
– la méthode de désinfection
– la composition du milieu de culture
1) Qualité sanitaire du pied-mère : Comme la technique de la micro propagation n’offre aucune garantie contre le virus et diverses autres maladies, il est indispensable d’avoir au départ du matériel végétal sain. Les pieds-mères sains sont obtenus après traitement ou sont issus de la culture in-vitro.
2) Age et état physiologique du pied-mère : Selon l’âge et l’état du pied-mère, les réactions des explants pourront varier dans une très large mesure. En général, on peut admettre que ce sont les plantes jeunes qui fournissent des explants les plus réactifs. Après la germination au cours du stade juvénile, les tissus présentent de bonnes réactions et sont à l’origine de nombreuses réussites, mais les potentialités diminuent avec l’âge.
3) Epoque de prélèvement de l’explant : Le problème avec l’époque de prélèvement repose surtout sur les espèces vivaces pour lesquelles on peut distinguer un stade de vie active et un stade de vie ralentie. Au cours du cycle annuel, la plante va voir ses équilibres internes évoluer :
– au cours du printemps, les organes croissent et les analyses montrent la présence des régulateurs comme l’auxine, les gibbérellines et les cytokinines.
– au cours de l’été, ce flux de substances diminue.
– à l’automne, apparaissent des inhibiteurs de croissance.
4) Taille et nature de l’explant : La taille de l’explant mis en culture présente une grande importance par le fait que plus l’explant est grande, plus les équilibres endogènes seront déterminants. Par contre l’explant de petite taille sera plus facilement orienté et facile à désinfecter. Pour les explants possédant une structure organisée ou ébauchée comme le nœud, l’apex, le bourgeon…, leur utilisation est plus intéressante. Cette dernière permet d’obtenir plus de réussite au plan génétique, et assure le maximum de variabilité.Les explants constitués de tissus différenciés peuvent être prélevés sur n’importe quelle partie de l’appareil végétatif de la plante (sépale, pétale, étamine, pollen…). L’explant mis en culture débutera leur réaction par la formation d’un cal différentiel mais la survie est difficile et les échecs sont nombreux.
5) Méthode de désinfection : La première condition de la réussite de la culture in-vitro est l’asepsie. Les milieux de culture sont très favorables au développement des bactéries et des champignons dont la croissance, bien plus rapide que celui des tissus végétaux aboutit à l’envahissement de la culture. Des règles d’hygiène doivent être utilisées pour assurer l’asepsie de la culture. Elles consistent à :
– Purifier l’air qui contient en grande quantité des microorganismes en suspension sous forme de spores de bactéries ou de champignons.
– Aseptiser les mains de l’opérateur (transportant des multiples microorganismes) qui seront en contact avec l’explant, du milieu de culture et des matériels de culture.
– Utiliser des produits chimiques (hypochlorite de sodium, hypochlorite de calcium, mercryl laurylé, bichlorure de mercure, éthanol de 70 à 90° et divers produits bactéricides et fongicides) qui détruisent les microorganismes couvrant les tissus végétaux et qui peuvent même se trouver à l’intérieur de ces tissus.
– Autoclaver les milieux de cultures ainsi que les instruments utilisés
– Stériliser les instruments à la flamme du bec Bunsen
– Détruire les spores sur le rayon U.V
– Travailler sous hotte à filtre spéciaux qui ne laisse passer que les molécules dont le diamètre est inférieur à 0,22 micron.
6) Composition du milieu de culture : Les tissus cultivés ont de besoins spécifiques vis-à-vis des ions K+ , NO3-, NH4+, Ca2+, Mg2+. Le phosphore est apporté à de faibles concentrations. Ce sont les ions K+, NO3-, et NH4+ qui ont une influence prépondérante sur la croissance des tissus. Dans la plupart des cas, la composition minérale de MURASHIGE et SKOOG (7) donne des résultats satisfaisants mais il serait souhaitable de choisir une composition définie en fonction de la connaissance de la physiologie de l’espèce vis à vis de la nutrition minérale. Le choix d’une solution minérale est difficile, c’est la raison pour laquelle on se contente d’essayer des solutions connues et qui ont été étudiées par différents auteurs comme GAMBORG, HELLER, MURASHIGE et SKOOG, KNUDSON, WHITE, GAUTHERET, MOREL (2). Les tissus végétaux ont aussi besoin de substances organiques telles que les sucres, les vitamines, les acides aminés pour leur croissance. Pour les sucres, les besoins sont en général satisfaits par un apport de saccharose à la concentration de 20 g/l et peut varier de 5 à 40 g/l ou plus. Le sucre est nécessaire à la croissance des tissus car il constitue la meilleure source de carbone. Les vitamines utilisées appartiennent au groupe B et les plus efficaces sont :
– la vitamine B1 ou Thiamine-HCl
– la vitamine B6 ou Pyridoxine
– la biotine
– le pantothenate de calcium
– le myo-inositol
L’emploi de ces vitamines favorise le développement des cultures in-vitro et ils sont apportés à des concentrations de l’ordre de milligramme par litre. Les tissus ou les cellules des certaines espèces peuvent manifester le besoin en acides aminés. Ils sont apportés sous forme de mélange complexe appelé « hydrolysat de caséine » mais dans certains cas, on apportera de l’asparagine, de la glutamine, de l’arginine, de l’acide aspartique, de l’acide glutamique et de la tyrosine soit en mélange, soit individuellement. De plus, les besoins de tissus vis-à-vis des régulateurs de croissance sont spécifiques, ces substances ont une influence très sensible sur la croissance ou le développement des tissus pour de très faibles variations de concentration (de l’ordre de 0,01 à 10 mg/l). Ils appartiennent à trois catégories d’hormone végétale :
– les auxines : les plus utilisées sont les acides indolacétique (AIA) qui sont des auxines naturelles que l’on peut obtenir par synthèse chimique ; les Acide α – naphtalèneacétique (ANA) qui sont des produits de synthèse. Les auxines interviennent dans de nombreux phénomènes physiologiques, mais leurs actions dépendent de leurs concentrations et de leurs interactions avec les autres régulateurs. Elles stimulent l’élongation de la tige, la différentiation et la croissance des racines, la fructification.
– les cytokinines, dont l’existence dans la plupart des végétaux a été mise en évidence vers 1963 sont utilisés maintenant couramment pour les cultures des tissus. Quatre (04) cytokinines sont employés : l’isopentényladénine (2iP) et le zéatine qui sont naturelles, la benzyladénine (BA ou BAP) et la kinétine qui sont obtenues par synthèse. Les cytokinines permettent la stimulation de la croissance axillaire et facilitent la culture in-vitro mais leurs effets sont liées à ceux des auxines. Selon le rapport auxine/cytokinine, le comportement physiologique d’un explant mis en culture serait le suivant :
• si le rapport auxine/cytokinine est élevé (supérieur à l’unité), on obtient une rhizogénèse.
• si le rapport auxine/cytokinine est voisin de l’unité, l’explant évoluera vers une calogenèse.
• si le rapport auxine/cytokinine est faible (inférieur à l’unité), on aura un caulogenèse.
– Les gibbérellines sont nombreuses mais seul l’acide gibbérellique (GA3) est couramment utilisé. On utilise principalement l’acide gibbérellique pour stimuler la croissance des méristèmes, pour induire l’allongement des tiges ou pour activer la croissance des embryons somatiques. L’acide gibbérellique est un produit naturel.
Phase II : Multiplication proprement dite : C’est une phase dans laquelle on cherche le maximum d’unités de propagation dans un minimum de temps suivant le matériel végétal obtenu en phase I. Dans la plupart des cas, on procède à un microbouturage. Ces fragments sont remis en culture puis à nouveau divisés, ceci autant de fois que nécessaire jusqu’à l’obtention du nombre de plants désirés.
Phase III : Enracinement : C’est l’étape la plus délicate mais pas obligatoire pour quelques espèces. On cherche à différencier des initiaux racinaires et provoquer leurs développement. Le milieu de culture de la phase d’enracinement est caractérisé par l’équilibre des régulateurs de croissance auxines et cytokinines. On peut également ne pas enraciner les plantules en cette phase et les laisser se développer sans racines pour pouvoir les multiplier à nouveau.
Phase IV : Acclimatation : L’acclimatation est une étape qui consiste à adapter progressivement les plantules aux conditions climatiques naturelles et au substrat. Les plantules sont, à cette période plus délicates parce que les racines nées in-vitro sont extrêmement fragiles et au contact du substrat, elles peuvent mourir. Il en est de même pour les tiges et les feuilles au contact du climat naturel. Il faut donc bien assurer le soin hygrométrique, la température, l’ombrage et les maladies pendant cette phase.
Compositions des milieux de culture
Les milieux de culture doivent contenir au moins 7 constituants tels que :
– l’eau : on utilise en général de l’eau déminéralisée ou de l’eau distillée.
– les sels minéraux : on utilise deux sortes d’éléments différents par leurs concentrations et sont représentés par :
• Les macroéléments composés par les cations : ammonium (NH4)2+,potassium(K)+, calcium (Ca)2+, magnésium (Mg)2+ et les anions : nitrate (NO3)-, phosphate(PO4)2-, sulfate (SO4)2- à des concentrations variant de 50 à 400 mg par litre.
• Les microéléments : composés de fer (Fe), manganèse (Mn), bore (Br.), zinc (Zn), molybdène (Mo), cobalt (Co), nickel (Ni), aluminium (Al) à de concentration de l’ordre de quelques milligrammes par litre.
– Les sucres : on utilise généralement du saccharose ou du glucose à des concentrations de 2 à 6% c’est-à-dire 2 à 6 g pour 100 ml soit 20 à 60g par litre. Ils apportent les glucides nécessaires au métabolisme cellulaire.
– Les vitamines : dans la plupart des cas, on utilise des vitamines du groupe B : thiamine, pyridoxine, biotine, méso-inositol à la concentration de l’ordre de 1 mg par litre. Elles favorisent le développement des plants in-vitro.
– Les régulateurs de croissance : Ils sont aussi appelés : « phytocrhrome » ou « hormone végétal ». Parmi les hormones végétaux, les plus utilisés sont les auxines (AIA, ANA, AIB), le cytokinine (BAP), le gibberelline. Ils déclencheront une réaction précise comme la divisioncellulaire ou leur différenciation selon leur nature. Les phytochromes sont utilisés à des doses très faibles de l’ordre de .0.01 mg par litre à 10 mg par litre car à forte dose ils peuvent devenir toxiques pour la plante.
– Le fer sous forme de chélate (Fe-EDTA), à la concentration de 10 à 30 mg par litre qui est indispensable au métabolisme de la cellule.
– Les produits divers comme le lait de coco, les jus de fruit (jus de banane, jus d’ananas, jus de tomate,…). Ces substances apportent des acides aminés aux cellules mais ils ne sont pasobligatoirement utilisés. On utilise aussi quelquefois du charbon actif pour sa qualité détoxifiante.
– La gélose ou agar-agar : c’est un polyoside extrait d’algue du genre gelidium. La gelose est utilisée pour solidifier et rendre le milieu transparent. La concentration la plus utilisée est de 5 à 10 g par litre.
Intérêts pédagogiques
Au niveau de l’enseignement, l’étude pourait avoir des impacts au niveau de l’enseignement secondaire. En effet les informations contenues dans ce mémoire pourraient être utilisées pour l’enseignement de la Sciences de la Vie et de la Terre (SVT). Les contenus de ce travail peuvent constituer bien des outils aussi bien en biologie végétale qu’en biologie animale.
Biologie végétale Dans le curriculum de la classe de 6ème dans le chapitre « les végétaux », sous chapitre « Etude d’une plante dicotylédone » l’étude des appareils végétatifs d’une plante dicotylédone est recommandée. Les informations fournies dans la première partie de ce mémoire peuvent largement aider le maître à préparer le cours correspondant. Elles peuvent aussi aider les élèves à mieux comprendre le cours en prenant comme exemple une plante qu’ils savent bien comme la pomme de terre. En classe de 3ème, les élèves étudient les modes de multiplication des végétaux mentionnée dans le chapitre « Reproduction des plantes à fleurs », sous chapitre «La multiplication asexuée des plantes à fleurs ou la multiplication végétative ». Le maître peut déjà informer aux élèves l’existence de la multiplication végétative in vitro et de les faire comprendre la possibilité de la bouture même à partir de minuscule fragment de plante cultivé hors sol. Il peut également leur parler de la possibilité de la réussite de cette multiplication grâce à la totipotence des cellules végétales en se référant à la deuxième partie de notre expérimentation.
Biologie animale En classe de 4eme et 1ère, les élèves étudient la composition des aliments. Dans la classe de 4 eme, cette étude figure dans le chapitre « Les fonctions de nutrition chez l’homme » sous chapitre « Les besoins nutritionnels ». Pour la classe de 1ere le chapitre s’intitule « Alimentation des animaux et de l’homme ». Pour que les élèves comprennent mieux, il est indispensable d’expliquer la leçon à partir d’un exemple concret. De ce fait, le maitre peut mener le cours en prenant l’exemple de pomme de terre et faire l’étude à partir de la valeur nutritionnelle moyenne de la pomme de terre (ANNEXE IV). A cette fin, nous présentons un exemple de fiche pédagogique adaptée au programme de la classe de 1ère C.
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Table des matières
INTRODUCTION GENERALE
PREMIERE PARTIE : GENERALITES
I. Généralités sur Solanum tuberosum (pomme de terre)
I . 1 Origine et historique
I . 2 Classification botanique
I . 3 Description botanique
I . 3 . 1 Parties aériennes
I . 3 . 1 . 1 Tiges
I . 3 . 1 . 2 Feuilles
I . 3 . 1 . 3 Fleurs
I . 3 . 1 . 4 Fruits et graines
I . 3 . 2 Partie souterraines
I . 3 . 2 . 1 Racines
I . 3 . 2 . 2 Stolons
I . 3 . 2 . 3 Tubercules
I . 3 . 2 . 4 Germes
I . 4 Physiologie
I . 4 . 1 Germination
I . 4 . 2 Croissance
I . 4 . 3 Tubérisation
I . 4 . 4 Floraison et fructification
I . 4 . 5 Maturation
I . 4 . 6 Dormance
I . 4 . 7 Caractéristiques distinctifs des variétés Meva, Jengy manga, Spunta
II. Généralités sur la culture in-vitro
II . 1 Définition
II . 2 Historique
II . 3 Différentes techniques
II . 3 . 1 Culture de méristème
II . 3 . 2 Culture d’anthère, de grain de pollen et d’ovule
II . 3 . 3 Culture de protoplastes
II . 3 . 4 Micropropagation
II . 4 Avantages et Inconvénients
I . 4 . 1 Avantages
I . 4 . 2 Inconvénients
II . 5 Milieux de culture
II . 5 . 1 Compositions des milieux de culture
II . 5 . 2 Préparation
II . 6 Mise en culture
II . 7 Conditions de la salle de culture
II . 7 . 1 Besoins en lumière
II . 7 . 2 Température
DEUXIEME PARTIE : EXPERIMENTATION D’INITIATION A LA CULTURE IN VITRO DES TROIS (03) VARIETES DE Solanum tuberosum
I. Etudes préliminaires
I . 1 Présentation du lieu de récolte des tubercules
I . 2 Germination des tubercules
I . 2 . 1 Durée et lieu
I . 2 . 2 Principe
II. Initiation par bourgeonnement axillaire des trois (3) variétés de solanum tuberosum
II . 1 Matériels
II . 1 . 1 Matériel végétal
II . 1 . 2 Matériel de mise en culture
II . 1 . 3 Milieu de culture
II . 2 Méthodologie
II . 2 . 1 Objectif
II . 2 . 2 Durée de l’expérimentation
II . 2 . 3 Schéma du dispositif expérimental
II . 2 . 4 Stérilisation des explants
II . 2 . 5 Mise en culture
II . 2 . 6 Méthode d’observation
II . 2 . 7 Méthode d’analyse statistique des résultats
II . 3 Résultats et discussions
II . 3 . 1 Evaluation de la stérilisation
II . 3 . 2 Evaluation de survie des cultures non contaminées
II . 3 . 3 Evolution du nombre de bourgeons
II . 3 . 4 Evaluation de la longueur moyenne des pousses
II . 3 . 5 Évaluation du nombre de racines
II . 4 Conclusion de l’expérimentation
TROISIEME PARTIE : INTERETS DE L’ETUDE
I. Intérêts pédagogiques
I . 1 Biologie végétale
I . 2 Biologie animale
II. Intérêts économiques
CONCLUSION GENERALE
REFERENCES BIBLIOGRAPHIQUES REFERENCES BIBLIOGRAPHIQUES
ANNEXES
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