Essai de mise en évidence des hétérosides cardiotoniques

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METHODES GENERALES D’ANALYSE : [2-4-6-8-9-10- 13-15]

Ce chapitre sera consacré à la description des différentes méthodes d’analyse utilisées au cours de nos recherches :

DETERMINATION DE LA TENEUR EN EAU :

La détermination de la teneur en eau a été possible grâce à la méthode gravimétrique.
Elle correspond à la perte de poids de la drogue par dessiccation à l’étuve.
Par chauffage à 100-105°C pendant un temps suffisant, la drogue convenablement divisée subit une perte de poids correspondant sensiblement à la totalité de l’eau qu’elle contient.
Le mode opératoire consiste à :
– tarer une capsule préalablement séchée à l’étuve et refroidie dans un dessiccateur ;
– introduire dans la capsule environ 2 g de la drogue broyée : soit P le poids exact de la drogue (au mg près) ;
-porter à l’étuve entre 100-105°C durant une heure ;
-laisser refroidir dans un dessiccateur et peser : le poids obtenu est P’. La perte de poids sera rapportée à 100 g de drogue et correspond à la teneur en eau de la drogue (TE) en pourcentage : Remarque : le dosage des matières minérales se fera ultérieurement sur le même échantillon d’où la nécessité de ne pas jeter la drogue séchée ; la capsule sera conservée dans le dessiccateur.

DOSAGE DES CENDRES :

Il consiste à évaluer la teneur en éléments minéraux des drogues après incinération de celles-ci. Le dosage des cendres permet de déceler les falsifications par des charges minérales fréquentes avec les drogues chères (safran) ou les souillures par la terre au moment de la récolte des diverses drogues (racines, rhizomes…).
Le mode opératoire consiste à incinérer dans un four à moufle de température comprise entre 400-600°C durant une heure, 2 g de drogue végétale séchée à poids constant à l’étuve. A cette température, toute la matière organique est décomposée, le carbone est oxydé par l’oxygène et se dégage sous forme de CO2 ou de CO.
Les cendres représentant les matières minérales sont pesées après refroidissement dans un dessiccateur.
Leur poids est amené ensuite à 100 g de drogues séchées.

RECHERCHE DES HETEROSIDES FLAVONOÏQUES :

Les flavonoїdes, au sens strict, sont des pigments jaunes généralement polyphénoliques. On les retrouve sous forme d’hétérosides appelés flavonosides dont les génines sont des dérivés de la phénylchromone [3].

Matériel et réactifs :

-poudre de drogue,
-balance de précision,
-chauffe ballon,
-ballon rodé,
-eau distillée,
-réfrigérant,
-éthanol,
-erlenmeyer,
-carbonate de calcium,
-chronomètre,
-entonnoir,
-papier filtre,
-soude au 1/10e
-FeCl3,
-tubes à essai,
-alcool chorhydrique,
-fragments de magnésium,
-éprouvette.

Solution extractive :

Dans un erlenmeyer, introduire :
-100 ml d’eau distillée
-10 g de poudre de drogue.
Faire bouillir le tout pendant 30 mn au bain-marie, filtrer et laisser refroidir.

Réactions générales de caractérisation des flavonoїdes :

Coloration en milieu alcalin :

En milieu alcalin, les flavonosides se dissolvent facilement en donnant des colorations allant du jaune au brun.
Le mode opératoire consiste à introduire dans un tube à essai 2 ml de la solution extractive et quelques ml de soude au 1/10e.
On note une coloration jaune-orangée en présence de flavonoїdes.

Coloration par le perchlorure de fer :

Du fait de la présence des fonctions phénoliques dans leur génine, les flavonosides donnent des colorations variées avec des solutions diluées de FeCl3.
En ajoutant 2 à 3 gouttes d’une solution diluée de FeCl3 à quelques ml de la solution extractive, on observe une coloration verdâtre qui indique la présence de composés phénoliques.

Réaction de la cyanidine :

En milieu alcoolique et en présence d’hydrogène naissant obtenu in situ par action de l’acide chlorhydrique sur du magnésium, les flavonosides donnent des colorations variées allant du rouge-orange au violet. Dans un tube à essai introduire :
-2 ml de la solution extractive,
-2 ml d’alcool chlorhydrique composés de :
-2 ml d’alcool 96°
-2 ml d’eau
-1 ml de HCl concentré
-quelques fragments de magnésium (réaction exothermique).
Une coloration rose puis rouge se développera lentement en présence de flavonosides.

Séparation et identification des flavonoїdes par C.C.M.

– Principe :
La C.C.M. est une chromatographie d’absorption qui permet la séparation de substances contenues dans un mélange déposé sur un adsorbant grâce à une phase mobile appelée éluant.
– Technique :
Les échantillons sont déposés à 1,5 cm de l’une des extrémités de la plaque à l’aide de micropipettes.
La plaque est ensuite introduite dans la cuve où se trouve le solvant approprié. Après migration, la plaque est retirée puis séchée à l’étuve. On pulvérise ensuite par le révélateur approprié.
– Résultats :
Ils sont exprimés par :
d : est la distance de migration de la substance.
D : est la distance de migration du solvant.
-par les couleurs ou les fluorescences obtenues avec les réactifs de révélation, -par les fluorescences sous lumière ultra-violette.

Matériel et réactifs utilisés :

-ampoule à décanter,
-ballon rodé de 1000 ml,
-hexane,
-eau distillée,
-entonnoir,
-acétate d’ethyle,
-évaporateur,
-méthanol,
-butanol,
-papier filtre,
-réfrigérant,
-micropipette,
-étuve

Préparation des extraits : Voir figure V [15].

-Support : plaque de cellulose,
-Solvant éluant : acide acétique à 15% dans l’eau,
-Dépôts : Extrait de feuilles de la plante dans le méthanol, Extrait de tiges de la plante dans le méthanol, Extrait de racines de la plante dans le méthanol, Témoin de vitexine à 1% dans le méthanol, Témoin de quercétine dans le méthanol.
-Révélateur : chlorure d’aluminium à 15% dans le mélange eau-méthanol (1v/1v).

Technique :

Le témoin et les extraits à analyser sont déposés sur la plaque de cellulose. Après élution et migration, la plaque est observée sous la lampe UV à λ=365 et 254 nm afin de voir les spots fluorescents. La plaque est ensuite séchée à l’étuve à 100°C pendant 5 minutes, puis une solution de chlorure d’aluminium à 15% dans le méthanol est pulvérisée. On observe ensuite à l’UV. La présence des flavonoїdes est caractérisée par des spots jaunâtres.

RECHERCHE DES TANINS :

Les tanins sont des composés polyphénoliques ayant la propriété de tanner la peau, c’est à dire de la rendre dure et imputrescible en se fixant sur les proteines. On distingue deux grands groupes de tanins :
-les tanins hydrolysables ou pyrogalliques qui sont des esters d’oses et d’acides phénols (acides galliques),
-les tanins condensés, non hydrolysables ou catéchiques qui dérivent des catéchols et des proanthocyanidols par condensation.

Matériel et réactifs :

-erlenmeyer,
-entonnoir,
-papier filtre,
-chauffe ballon,
-eau distillée,
-chlorure ferrique à 2%,
-acide phosphotunstique,
-carbonate de sodium à 25%,
-balance de précision,
-chronomètre, tubes à essai,
-éprouvette, pipettes.

Extraction :

La caractérisation se fait sur un infusé à 10%.
Sur 5 g de drogue, verser 50 ml d’eau bouillante et laisser infuser pendant 30 minutes puis filtrer.

Réactions de caractérisation :

Caractérisation par le perchlorure de fer :

Avec le perchlorure de fer, la présence des tanins se traduit par la formation d’une coloration brun-vert.
On ajoute quelques gouttes de solution de perchlorure de fer à 2%, à 5 ml de la solution extractive puis on agite. La présence des tanins est signalée par une coloration brun-vert du mélange.

Caractérisation par l’acide phosphotungstique :

Les tanins donnent avec l’acide phosphotungstique une coloration bleue.
On dilue l’infusé au 1/10e puis on ajoute ensuite à 1 ml de la solution :
-1 ml d’une solution d’acide phosphotungstique,
-9 ml d’une solution aqueuse de carbonate de sodium à 25%.
Il apparaîtra une coloration bleue du mélange.

Différenciation des tanins :

Elle permet de distinguer les deux catégories de tanins à savoir :
-les tanins condensés et
-les tanins hydrolysables.

Matériel et réactifs :

-réactif de Stiasny,
-bain-marie,
-acétate de sodium,
-HCl,
-infusé,
-eau distillée,
-chronomètre,
-chrorure ferrique à 2%,
-tube à essai,
-papier filtre,
-entonnoir.

Précipitation par le réactif de Stiasny :

En milieu acide et à chaud, les tanins condensés sont précipités par le réactif de Stiasny tandis que les tanins hydrolysables restés en solution donnent avec le perchlorure de fer à 2% une coloration bleue, ceci après saturation du filtrat avec l’acétate de sodium.
Le mode opératoire consiste à ajouter à 15 ml de l’infusé, 8 ml de réactif de Stiasny (formaldéhyde chlorhydrique) puis chauffer au bain-marie à ébullition pendant 30 mn.
La précipitation montre la présence des tanins condensés.
On filtre et sature le filtrat par l’acétate de sodium, puis on ajoute quelques gouttes de solution de chlorure ferrique à 2% : il apparaît une coloration bleu-noire indiquant la présence des tanins hydrolysables non précipités par le réactif de Stiasny.

Oxydation des tanins condensés :

Par chauffage en milieu chlorhydrique, les tanins condensés s’oxydent en phlobaphènes colorés en rouge.
On ajoute à 5 ml de l’infusé, 1 ml d’acide chlorhydrique puis on porte à ébullition. Il se développe une coloration rouge due à la formation de phlobaphènes.
Remarque : au cours de la conservation des drogues à tanins condensés, une partie de ces tanins s’oxyde en phlobaphènes responsables de la coloration rouge de ces drogues.

Préparation des extraits pour la chromatographie sur couche mince (CCM) :

Matériel et réactifs :

-ballon,
-poudre de drogue,
-balance de précision,
-eau distillée,
-chauffe ballon,
-chronomètre,
-réfrigérant,
-entonnoir,
-papier filtre,
-hexane,
-méthanol,
-acétate d’éthyle,
-butanol.

Chromatographie sur couche mince :

Matériel et réactifs :

-Support : silice
-Solvant de migration : acétate d’éthyle / méthanol / eau (40v/8v/5v)
-Dépôts :
Témoin d’acide gallique
Extraits de la plante à analyser
-Révélateur : mélange chlorure ferrique, acide acétique, eau (2v/2v/96v)

Protocole expérimentale :

Le témoin et les extraits à analyser sont déposés sur la plaque, puis laissés à migrer dans la cuve. Après migration, la plaque de silice est observée sous lampe UV à λ=365 et 254 nm. La plaque est ensuite séchée à 100°C à l’étuve pendant 5 minutes, puis révélée avec FeCl3. Les tanins donnent des taches de couleur noire.

RECHERCHE DES HETEROSIDES ANTHRACENIQUES :

Les hétérosides anthracéniques ou anthracénosides sont des substances de structures homogènes dérivées de l’anthracène.
Les plantes qui les renferment sont utilisées comme purgatif [4].

Materiel et réactifs :

-erlenmeyer,
-éprouvette,
-ampoule à décanter,
-eau distillée,
-HCl concentré,
-bain-marie,
-chloroforme,
-ammoniaque au ½,
-capsule en verre.

Réaction de caractérisation : réaction de Borntraeger

Les génines anthracéniques donnent en présence d’un alcali une coloration rouge qui est intense avec les génines oxydés.
Le mode opératoire consiste à :
-mélanger 25 mg de poudre , 20 ml d’eau , 1 ml de HCl concentré ; -porter au bain-marie pendant 15 mn ; -laisser refroidir ;
-extraire, après filtration, avec 10 ml de chloroforme ; -évaporer à sec la solution chloroformique ; -ajouter au résidu 2 ml d’ammoniaque au 1/2.
On observe une coloration jaune qui vire au rouge par chauffage au bain-marie.

Identification des principes actifs par CCM :

Pour la préparation des extraits [15], observer la figure V.
-Support : silice
-Solvant de migration : n-butanol /acide acétique / eau (4v/1v/5v)
-Dépôts :
Solutions extractives,
Temoin de Rhein
-Révélation :
Examen en lumière UV
Pulvériser une solution d’acide périodique à 1%.
Chauffer la plaque à l’étuve à 100°C pendant 10 minutes.
Pulvériser une solution de potasse à 10% dans l’éthanol à 50°

RECHERCHE DES SAPONOSIDES :

Les saponosides sont des hétérosides caractérisés entre autres par leur pouvoir aphrogène en solution aqueuse : la teneur en saponosides sera évaluée par la détermination de «l’indice de mousse» sur le décocté.

Matériel :

-erlenmeyer de 500 ml,
-bain-marie,
-éprouvette,
-chauffe ballon,
-eau distillée,
-balance de précision,
-chronomètre, tube à essai, règle.

Extraction :

Dans un erlenmeyer de 500 ml, mettre :
-1 g de poudre de drogue,
-100 ml d’eau, puis porter au bain-marie à ébullition modérée pendant 30 mn.
On filtre après refroidissement et on ajuste à 100 ml.

Mesure de l’indice de mousse :

Dans une série de 10 tubes calibrés numérotés de 1 à 10, répartir successivement 1, 2, 3, 4…10 ml du décocté.
Dans chaque tube, on ajuste le volume à 10 ml par addition d’eau distillée ; puis on agite pendant 15 secondes dans le sens de la longueur (2 agitations par seconde) ; on laisse reposer 15 mn et enfin on mesure la hauteur de la mousse.
Le tube X dans lequel la hauteur de la mousse est de 1 cm va servir de base au calcul de l’indice de mousse.

Table des matières

INTRODUCTION
I-APPELLATIONS
II-RAPPEL BOTANIQUE SUR LA PLANTE
III-REPARTITION GEOGRAPHIQUE ET HABITAT
IV-COMPOSITION CHIMIQUE
V-PROPRIETES ET EMPLOIS
DEUXIEME PARTIE
I-RECOLTE ET CONSERVATION DES ECHANTILLONS
II-METHODES D’ANALYSE
II-1/ DETERMINATION DE LA TENEUR EN EAU
II-2/ DOSAGES DES CENDRES
II-3/ RECHERCHE DES HETEROSIDES FLAVONIQUES
II-3-1/ Matériels et réactifs
II-3-2/ Solution extractive
II-3-3/ Réactions générales de caractérisation
II-3-3-1/ Coloration en milieu alcalin
II-3-3-2/ Coloration par le perchlorure de fer
II-3-3-3/ Réaction de la Cyanidine
II-3-4/ Séparation et identification des flavonoїdes par CCM
II-3-4-1/ Matériels et réactifs
II-3-4-2/ Préparation des extraits
II-3-4-3/ Technique
II-4/ RECHERCHE DES TANINS
II-4-1/ Matériel et réactifs
II-4-2/ Extraction
II-4-3/ Réactions de caractérisation
II-4-3-1/ Caractérisation par le perchlorure de fer
II-4-4-2/ Caractérisation par l’acide phosphotungstique
II-4-4/ Différenciation des tanins
II-4-4-1/ Matériel et réactifs
II-4-4-2/ Précipitation par le réactif de Stiasny
II-4-4-3/ Oxydation des tanins condensés
II-4-5/ Préparation des extraits pour la CCM
II-4-5-1/ Matériel et réactifs
II-4-5-2/ Préparation des extraits
II-4-6/ Chromatographie sur couche mince
II-4-6-1/ Matériel et réactifs
II-4-6-2/ Protocole expérimentale
II-5/ RECHERCHE DES HETEROSIDES ANTHRACENIQUES
II-5-1/ Matériel et réactifs
II-5-2/ Réaction de caractérisation
II-5-3/ Identification des principes actifs par CCM
II-6-1/ Matériel
II-6-2/ Extraction
II-6-3/ Mesure de l’indice de mousse
II-6-4/ Calculs
II-7/ RECHERCHE DES HETEROSIDES CARDIOTONIQUES
II-7-1/ Matériel et réactifs
II-7-2/ Principe
II-7-3/ Mode opératoire
II-7-3-1/ Dégraissage
II-7-3-2/ Extraction
II-7-3-3/ Caractérisation
II-8/ RECHERCHE DES ALCALOIDES
II-8-1/ Matériel et réactifs
II-8-2/ Extraction et purification des alcaloïdes
II-8-2-1/ Principe
II-8-2-2/ Mode opératoire
II-8-3/ Caractérisation des alcaloïdes
II-8-4/ Chromatographie sur couche mince des alcaloїdes
III-RESULTATS
III-1/ Détermination de la teneur en eau et en cendres
III-2/ Essai de mise en évidence des hétérosides flavoniques
III-3/ Essai de mise en évidence des saponosides
III-4/ Essai de mise en évidence des hétérosides cardiotoniques
III-5/ Essai de mise en évidence des alcaloïde
III-6/ Essai de mise en évidence des hétérosides anthracéniques
III-7/ Essai de mise en évidence des tanins
IV/ DISCUSSION
V/ CONCLUSION
VI/ BIBLIOGRAPHIE
VII/ ANNEXES

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