Epreuves diagnostiques des HT

Epreuves diagnostiques des HT

Lieu du stage

Mon stage a été réalisé dans le laboratoire central d’analyses médicales au sein du centre hospitalier et universitaire Hassan II de Fès (CHU), et plus précisément dans l’unité d’immuno-sérologie.

Prélèvement et transport au laboratoire

Le prélèvement est réalisé sur tube sec, le matin chaque échantillon doit avoir une fiche d’identification dont elle est inscrite la date, le numéro, le service, le sexe, l’âge, le nom et prénom du patient et les différentes analyses à effectuer. Les échantillons doivent être apportés immédiatement au laboratoire. Toutes conditions de transport défavorables peuvent influencer les résultats.

Test ELISA pour la détermination quantitative de la TSH

Principe

Le test ELISA TSH est basé sur la technique ELISA en sandwich classique. Comme un dosage de deuxième génération, il fait usage d’un enduit d’anticorps anti-TSH monoclonal hautement spécifique sur la surface du puits de microtitration. Dans la première étape d’incubation, des échantillons, des calibrateurs ou les contrôles et le conjugué d’enzyme (peroxydase-anticorps anti-TSH) sont mélangés pour former le complexe de type sandwich, qui est lié à la surface de l’incubation de l’enzyme conjugué en excès est éliminé par lavage. Réactif de substrat est ajouté et la couleur qui en résulte, qui devient jaune après arrêt de la réaction avec la solution d’arrêt, est mesurée par photométrie. L’intensité de la couleur est directement proportionnelle à la concentration de la TSH dans un échantillon. L’absorbance des étalons et les échantillons sont déterminés en utilisant des systèmes ELISA. La concentration est évaluée au moyen d’une courbe d’étalonnage qui est établie à partir des étalons fourni avec le kit (1).

Matériels :

 Plaque à micropuits  Pipettes  Lecteur ELISA avec filtre 450 nm, avec un filtre de référence de 630-690 nm, si disponible.  Bandes adhésives  Eau distillée  Tubes à essai  Papier absorbant

Réactifs et contenus

MIC: barrettes de la microplaque 8 puits bandes cassables, recouvertes d’anti-TSH (monoclonal, souris) CAL (A-F): calibrateurs– bouchons et les étiquettes colorées CON (13ml) conjugué enzymatique (bouchon blanc) prêt à l’emploi, coloré en rouge pH 6.25 Anti-TSH marqué WS (50 ml) solution de lavage WS (bouchon blanc)

Mode opératoire

Pour réussir le test ELISA pour la détermination quantitative de la TSH dans le sérum humain, il faut suivre le schéma de pipetage (tableau 1). D’abord, il faut disposer le nombre de puits de microtitration désiré dans le support, déposer 50 µl de chaque calibrateurs, contrôles et les échantillons dans les puits appropriés. Après il faut déposer 100 µl de CON dans chaque puits.  bien mélanger et couvrir les barrettes de la microplaque avec une bande adhésive.  Incuber pendant 60 min à température ambiante 20-25°C  Décanter le contenu des puits et rincer les puits 5 fois avec de la solution de lavage diluée. Tapoter les puits sur du papier absorbant afin d’éliminer les gouttelettes résiduelles.  Ajouter 100 µl de solution Substrat à chaque puits. Et incuber pendant 15 min à température ambiante.  Stopper la réaction enzymatique en ajoutant 100 µl de solution d’arrêt à chaque puits. Enfin on lit la densité optique à 450 nm à l’aide d’un spectrophotomètre lecteur de microplaque dans les 5 min après avoir ajouter la solution d’arrêt.Mélanger et couvrir MIC avec bande adhésive Incuber pendant 60 min à 20-25 °C laver 5 fois comme décrit (voir W1-W3) mélanger soigneusement mesurer l’absorbance à 450 nm dès que possible ou dans les 30 minutes. après la fin de la réaction, en utilisant une longueur d’onde de référence 630-690 nm (si disponible) La procédure de lavage est critique. Un lavage insuffisant entraînera une mauvaise précision ou faussement élevée absorbance (12). W1: enlever les bandes adhésives, Aspirer le contenu, ajouter la solution de lavage, aspirer au bout de 30 sec. Le temps de trempage et de répéter à laver 4 fois. W2: en cas de lavages automatiques de remplissage et le premier avec une solution de lavage. Laver ensuite les bandes 5 fois. S’assurer que la cuve se remplit tous les puits complètement et aspire hors efficace au bout de 30 sec. W3: Après le lavage, enlever le liquide restant en tapotant la plaque à l’envers sur du papier absorbant.

Validation du test

Les résultats du test sont valides à condition que les critères suivants soient respectés:  Absorbance maximale (CAL F) D.O ≥ 1.2  Concentration de TSH à 80% du max. absorbance = 24,2 ± 4,6 mUI / l  TSH à 50% du maximum. absorbance = 13,8 ± 3,3 mUI / l  Concentration de TSH à 20% du max. absorbance .

Calcul

Une courbe dose-réponse est utilisé pour interpoler la concentration de TSH en mUI / l sur du papier millimétré. Tracer la courbe d’ajustement à travers les points tracés. Pour déterminer la concentration de la TSH pour un échantillon inconnu (S), de localiser l’absorbance moyenne des doubles sur l’axe vertical de la concentration (en mUI / l) à partir de l’axe horizontal du graphique.

Interprétation des résultats

Concentration sérique de TSH dépend de multiples facteurs: la fonction de la glande hypothalamus, la fonction de la glande thyroïde, et la réactivité de l’hypophyse à la TRH. Ainsi, la concentration de TSH seule n’est pas suffisante pour évaluer l’état clinique. Les variations génétiques ou la dégradation de TSH intact en sous-unités peuvent affecter les caractéristiques de liaison des anticorps et d’influencer le résultat final (13). Les résultats ne peuvent ps être l’unique raison de conséquences thérapeutiques. Ils doivent être corrélés à d’autres observations cliniques et tests diagnostics.

Valeurs attendues

Résultats d’une étude avec une population euthyroïdien : Plage normale: 0,3 à 6,2 mUI / l TSH (13). Chaque laboratoire doit établir ses propres valeurs attendues en utilisant l’instrumentation, les méthodes de collecte de sang et de techniques de tests couramment utilisés dans ce laboratoire.

Dosage de TSH par l’automate Architect system TSH

Définition

Architect TSH est un dosage immunologique microparticule par chimilunescence (CMIA) pour la détermination quantitative de l’hormone thyréo-stimulante (TSH) humaine dans le sérum et le plasma humains.

Principe

Architect TSH est un dosage immunologique en deux étapes pour la détermination de la concentration de l’hormone thyréo-stimulante (TSH) dans le sérum ou le plasma humain, utilisant la technologie de dosage immunologique microparticule par chimilunescence (CMIA) avec des protocoles de dosage flexibles appelée chemiflex. Dans un premier temps, l’échantillon, les microparticules recouvertes d’anticorps anti-B TSH et le diluant de dosage TSH sont mis en présence. La TSH présente dans l’échantillon se lie aux microparticules recouverte d’anticorps anti-TSH. Après lavage, le conjugué d’anticorps anti- TSH marqué à l’acridinum est ajouté au cours de la seconde étape. Les solutions de préactivation et d’activation sont ensuite ajoutées au mélange réactionnel. La réaction chimiluminescente qui en résulte est mesurée en unités relatives de lumière (URL). Il existe une relation directe entre la quantité de TSH présente dans l’échantillon et les URL détectées par le système optique ARCHITECT i.

Calibration

• Pour effectuer une calibration ARCHITECT TSH, analyser les calibrateurs 1 et 2 en double. Un échantillon de chacun des contrôles TSH doit être testé pour évaluer la calibration du dosage. S’assurer que les valeurs des contrôles du dosage se situent dans les limites de concentration spécifiés dans le paquet insérer. Les calibrateurs doivent être chargés en priorité. • Limites de calibrateurs : 0,0000 à 100,0000 mUI / ml. • Une fois la calibration de la TSH architecte est acceptée et mémorisée, tous les échantillons subséquents peuvent être testés sans étalonnage, à moins que: •un kit de réactifs portant un nouveau numéro de lot est utilisé. • Les valeurs des contrôles se situent en dehors de limites spécifiées

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Table des matières

Introduction
Etude bibliographique
I. Les hormones thyroïdiennes
1- Présentation de la thyroïde
2- Métabolisme des Hormones thyroïdiennes
2.1. Structure des HT
2.2. Biosynthèse des HT
2.3. Distribution et catabolisme des HT
2.4. Régulation de la fonction thyroïdienne
2.5. Mécanismes d’action
3- Effets biologiques des HT
4- Les anticorps antithyroïdiens
5- Les marqueurs
6- Physiopathologie et traitement
6.1 – Hyperthyroïdie
6.2 – Hypothyroïdie
II. Epreuves diagnostiques des HT
III. Techniques de dosage des HT
1- Dosages avec un excès de réactif : méthodes immunométriques ou méthodes directes
2- Dosages avec réactif limitant : méthodes par compétition ou méthodes indirectes
3- Dosage RIA (RadioImmunoAssay)
4- Dosages des hormones totales Matériels et méthodes
1. Lieu de stage
2. Prélèvement et transport au laboratoire
3. Test ELISA pour la détermination quantitative de la TSH
Principe Matériels
c. – Réactifs et contenus
d. – Mode opératoire
e. – Validation du test Calcul
g. – Interprétation des résultats h. – Valeurs attendues
4. Dosage de TSH par l’automate Architect system TSH
4.1- Définition
4.2 – Principe
4.3 – Calibration
4.4 – Les résultats
4.5 – Valeurs attendues
4.6 – Limites de la méthode
Résultats et Discussion
Conclusion
Références bibliographiques Glossaire